專利名稱：一種破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
破傷風(fēng)類毒素是由破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生并分泌至菌體外的一種蛋白質(zhì)，由1315個(gè)氨基酸組成，分子量為150 700Da。最初用于人免疫接種的是破傷風(fēng)原制類毒素，這種類毒素免疫效果好，但接種后副反應(yīng)很大，甚至有過敏休克死亡的病例 。這主要是在原制類毒素中存在著大量水解不完全的蛋白成分，引起過敏反應(yīng)。為了減輕接種的副反應(yīng)，1923年Ramon對(duì)破傷風(fēng)原制類毒素進(jìn)行了精制純化，制備出了精制破傷風(fēng)類毒素。通過使用觀察，精制破傷風(fēng)類毒素的接種后副反應(yīng)比原制類毒素顯著減少。精制破傷風(fēng)類毒素在生產(chǎn)中要進(jìn)行脫毒，由于原制毒素中含有大量的培養(yǎng)基成分，在脫毒過程中，容易通過甲醛與毒素分子交聯(lián)，提純比較困難，此外，脫毒后的體積大，精制操作不便。精制過程中通常采用離心機(jī)分離或過濾，但所得到的疫苗制品選擇性差，質(zhì)量不高，純度低(每毫克蛋白氮含40(Γ600個(gè)絮狀單位)，色澤深，用聚丙烯酰胺電泳檢查，仍然是一個(gè)多種成分的混合體。目前國內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)破傷風(fēng)類毒素疫苗的工藝中，菌液分離、破傷風(fēng)類毒素溶液的濃縮、破傷風(fēng)類毒素的提純、脫鹽這些過程較為簡(jiǎn)單粗放，有些工藝不符合GMP要求，有些工藝方法在大生產(chǎn)條件下使用會(huì)受到限制。例如菌液分離工藝中，一般大生產(chǎn)要處理的體積要達(dá)到500L以上，若采用離心則不太適合，處理的時(shí)間會(huì)很長，耗費(fèi)大量的勞動(dòng)力；若采用帆布過濾除菌，存在過濾不徹底和帆布材料不符合GMP要求的缺陷；板框過濾的缺點(diǎn)是濾板易堵塞，過濾時(shí)間過長；切向流過濾不易堵塞，過濾速度也較理想，但對(duì)菌體、蛋白的剪切力可能較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法，以提高破傷風(fēng)類毒素疫苗的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法，包括以下步驟將破傷風(fēng)菌種經(jīng)傳代發(fā)酵，甲醛脫毒后，將培養(yǎng)液調(diào)節(jié)PH至6. 9^7. 5，過濾除去菌體，將濾液用孔徑為1(T40KD的超濾膜進(jìn)行超濾，直至濾液的體積為原體積的1/6 1/8，再向?yàn)V液中加入質(zhì)量體積比為2(Γ30%的硫酸銨鹽析，靜置24小時(shí)后離心分離，將離心后的沉淀用注射用水完全溶解后，再次用孔徑為IOlOKD的超濾膜超濾，直至濾液中硫酸銨的質(zhì)量百分含量小于O. 025%。優(yōu)選的，所述超濾膜的孔徑為30KD，所述超濾的壓力為l(Tl5psi，流速為200 220L/小時(shí)。優(yōu)選的，向?yàn)V液中加入質(zhì)量體積比為25 27%的硫酸銨鹽析。所述過濾除去菌體采用的是板框過濾。
本發(fā)明先將培養(yǎng)液進(jìn)行除菌體處理，再進(jìn)行精制，從而減少板框過濾除去菌體的過程中菌體和其他雜質(zhì)碎片對(duì)板框膜包的堆積引起的孔道堵塞，增加過濾過程中的流暢性；通過改進(jìn)鹽析方法，有效去除了培養(yǎng)液中的毒素蛋白和其他致敏原；培養(yǎng)液的濃縮和鹽析后的脫鹽方法采用的均是超濾方法，減少了因?qū)Χ舅氐鞍椎募羟性斐傻目乖茐?，避免了蛋白的沉淀。本發(fā)明縮短了破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率。


圖I是本發(fā)明的工藝流程圖；圖2是本發(fā)明中切向流超濾的工作原理圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例I一種破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法，包括以下步驟I)破傷風(fēng)類毒素的培養(yǎng)采用的菌種為破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌，來源于中國食品藥品檢定研究院，菌號(hào)為CMCC64008，檢定合格后使用，所述菌種的傳代發(fā)酵方法如下種子開啟后，經(jīng)用本領(lǐng)域常規(guī)手段發(fā)酵該菌株，在種子罐中34 36°C培養(yǎng)40小時(shí)，種子罐規(guī)格為50L，然后轉(zhuǎn)入大罐培養(yǎng)，采用1000L的發(fā)酵系統(tǒng)，培養(yǎng)溫度34 36°C，深層間歇攪拌通氣法培養(yǎng)67小時(shí)后停止培養(yǎng)。發(fā)酵完成后，加入甲醛溶液至甲醛終濃度為O. 35% (V/V)，3(T35°C保溫30分鐘。2)菌液分離取50L破傷風(fēng)類毒素培養(yǎng)液(73Lf/ml)，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至6. 9，在壓力不大于O. IMp的情況下，用板框過濾器(型號(hào)為JGLB 400*400，重慶輕工機(jī)械廠)進(jìn)行壓濾以去除菌體。3)超濾濃縮收集濾液，將濾液用30KD超濾膜的超濾系統(tǒng)(超濾系統(tǒng)型號(hào)為Sartocon 2 plu,德國賽得利斯)進(jìn)行切向流超濾濃縮，所述超濾濃縮的步驟為連接好超濾系統(tǒng)和精制罐，將超濾系統(tǒng)進(jìn)口、回流口和廢液口分別連接好，開啟超濾系統(tǒng)；確認(rèn)系統(tǒng)全部閥門打開，將變頻調(diào)速器調(diào)至15 20HZ左右，運(yùn)轉(zhuǎn)3飛分鐘后再將數(shù)字調(diào)到2(Γ45ΗΖ，使進(jìn)口與濾出口端壓力差達(dá)到l(Tl5psi，開始超濾，流速為200L/小時(shí)，收集回流端液體；待濾液的體積為原體積的1/6時(shí)，停止超濾濃縮，關(guān)掉泵的電源開關(guān)。4)鹽析向?yàn)V液中加入質(zhì)量體積比為27%的硫酸銨鹽析沉淀，靜置24小時(shí)，在低溫(2 8°C )離心機(jī)上離心,5020g, 30min,取糊狀沉淀1300ml。5)超濾脫鹽沉淀用注射用水20000ml完全溶解后,用30KD超濾膜包進(jìn)行超濾(超濾系統(tǒng)型號(hào)為Sartocon 2 plu)進(jìn)行切向流透析,所述超濾透析的步驟為
接好超濾系統(tǒng)和精制 、儲(chǔ)水te，將濾出端連接在廢液缸中，進(jìn)口和回流端與精制罐相連，將儲(chǔ)水罐與精制罐連接好，確認(rèn)全部閥門打開；將變頻器調(diào)至15 20HZ左右，運(yùn)轉(zhuǎn)3分鐘后，再將數(shù)字調(diào)至2(Γ25ΗΖ左右，使進(jìn)口與濾出口端壓力差達(dá)到l(Tl5psi，開始超濾，流速為220L/小時(shí)，收集回流端液體；超濾過程中隨時(shí)觀察O. 9%氯化鈉溶液的流入精制罐的流速要與濾出端的流速相一致，保持精制罐內(nèi)毒素體積不變，期間檢測(cè)樣品中殘余硫酸銨含量小于O. 025%為合格標(biāo)準(zhǔn)，停止超濾脫鹽。得到破傷風(fēng)類毒素疫苗3. 2L，濃度為780Lf/ml，批號(hào)為20090101。實(shí)施例2 一種破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法，包括以下步驟I)破傷風(fēng)類毒素的培養(yǎng)培養(yǎng)方法同實(shí)施例I。2)菌液分離取50L破傷風(fēng)類毒素培養(yǎng)液(68Lf/ml)，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7. 5，在壓力不大于O. IMp的情況下，用壓濾器進(jìn)行壓濾以去除菌體。3)超濾濃縮收集濾出液，將濾出液用40KD超濾膜的超濾系統(tǒng)進(jìn)行切向流超濾濃縮，所述超濾濃縮的步驟為連接好超濾系統(tǒng)和精制罐，將超濾系統(tǒng)進(jìn)口、回流口和廢液口分別連接好，開啟超濾系統(tǒng)；確認(rèn)系統(tǒng)全部閥門打開，將變頻調(diào)速器調(diào)至15 20HZ左右，運(yùn)轉(zhuǎn)3飛分鐘后，再將數(shù)字調(diào)到2(Γ45ΗΖ，使進(jìn)口與濾出口端壓力差達(dá)到l(Tl5psi，開始超濾，流速為200L/小時(shí)，收集回流端液體；待濾液的體積為原體積的1/8時(shí)，停止超濾濃縮，關(guān)掉泵的電源開關(guān)。4)鹽析向?yàn)V液中加入質(zhì)量體積比為25%的硫酸銨鹽析沉淀，靜置24小時(shí)，在低溫離心機(jī)上離心，5020g, 30min,取沉淀 500ml。5)超濾脫鹽沉淀用注射用水3000ml完全溶解后，用30KD超濾膜進(jìn)行切向流透析，所述超濾濃縮的步驟為接好超濾系統(tǒng)和精制 、儲(chǔ)水te，將濾出端連接在廢液缸中，進(jìn)口和回流端與精制罐相連，將儲(chǔ)水罐與精制罐連接好，確認(rèn)全部閥門打開；將變頻器調(diào)至15 20HZ左右，運(yùn)轉(zhuǎn)3分鐘后，再將數(shù)字調(diào)至20 25ΗΖ左右，使進(jìn)口與濾出口端壓力差達(dá)到l(Tl5psi，開始超濾，流速為220L/小時(shí)，收集回流端液體；洗濾過程中隨時(shí)觀察O. 9%氯化鈉溶液的流入精制罐的流速要與濾出端的流速相一致，保持精制罐內(nèi)毒素體積不變，期間檢測(cè)樣品中殘余硫酸銨含量小于O. 025%為超濾合格，停止超濾脫鹽。得到精制破傷風(fēng)類毒素疫苗2. 95L，濃度為720Lf/ml，批號(hào)為20090102。上述兩批疫苗的動(dòng)物免疫效果試驗(yàn)結(jié)果見表I。
表I. 20090101、20090102批破傷風(fēng)類毒素疫苗的效價(jià)
Wx 1
20090101132 IU/ml
20090102127 IU/ml 現(xiàn)有工藝均值 131 IU/ml
本發(fā)明制備獲得的兩個(gè)批次的破傷風(fēng)類毒素疫苗的各項(xiàng)生化檢測(cè)結(jié)果如下表2. 20090101、20090102批破傷風(fēng)類毒素疫苗的各項(xiàng)生化檢測(cè)結(jié)果
收獲絮狀收獲量收率純度
批號(hào)
__(Lf/ml)__(L)__(%) (Lf/mgPN)20090101 780 3.2 68.4 278520090102__720__T95__615__2769
現(xiàn)有工藝均值 700__3__55__2100由表2可看出，用本發(fā)明方法制得的破傷風(fēng)類毒素疫苗的純度與收率有較明顯的提高，制備所用的時(shí)間明顯縮短，工作效率和產(chǎn)品質(zhì)量得到了改善。而且可大幅減少鹽析所用的硫酸銨用量，從以前每批次大約IOOKg左右，降低到目前的20Kg左右。
權(quán)利要求
1.一種破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法，其特征在于將破傷風(fēng)菌種經(jīng)傳代發(fā)酵，甲醛脫毒后，將培養(yǎng)液調(diào)節(jié)PH至6. 9^7. 5，過濾除去菌體，將濾液用孔徑為IOlOKD的超濾膜進(jìn)行超濾，直至濾液的體積為原體積的1/6 1/8，再向?yàn)V液中加入質(zhì)量體積比為2(Γ30%的硫酸銨鹽析，靜置24小時(shí)后離心分離，將離心后的沉淀用注射用水完全溶解后，再次用孔徑為IOlOKD的超濾膜超濾，直至濾液中硫酸銨的質(zhì)量百分含量小于O. 025%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法，其特征在于所述超濾膜的孔徑為30KD。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法，其特征在于所述超濾的壓力為10 15psi，流速為20(T220L/小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法，其特征在于向?yàn)V液中加入 質(zhì)量體積比為25 27%的硫酸銨鹽析。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法，其特征在于所述過濾除去菌體采用的是板框過濾。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備方法，該方法是以破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌菌株為原料，經(jīng)過破傷風(fēng)類毒素的培養(yǎng)、菌液分離、超濾濃縮、鹽析和超濾脫鹽等步驟制備而成的。本發(fā)明先將培養(yǎng)液進(jìn)行脫毒處理，再進(jìn)行精制，從而減少板框過濾除去菌體的過程中菌體和其他雜質(zhì)碎片對(duì)板框膜包的堆積引起的孔道堵塞，增加過濾過程中的流暢性；通過改進(jìn)鹽析方法，有效去除了培養(yǎng)液中的毒素蛋白和其他致敏原；培養(yǎng)液的濃縮和鹽析后的脫鹽方法采用的均是切向流超濾方法，減少了因?qū)Χ舅氐鞍椎募羟性斐傻目乖茐?，避免了蛋白的沉淀。本發(fā)明縮短了破傷風(fēng)類毒素疫苗的制備時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102961741SQ20121053368
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者李佩珊, 陳亮, 白磊, 凌霜, 楊以梅, 楊海燕, 薛紅剛, 李新國 申請(qǐng)人:武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司