專(zhuān)利名稱(chēng)：學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)及遺忘癥的治療的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2001年9月14日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/322,389號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
背景長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)是突觸可塑性的一種長(zhǎng)期持久形式，其有助于某些類(lèi)型的學(xué)習(xí)記憶。例如參見(jiàn)，Bliss & Collingridge(1993)Nature 36131-39。在海馬CA1區(qū)中，LTP的誘導(dǎo)與Ca2+進(jìn)入由N-甲基-D-天冬氨酸受體活動(dòng)觸發(fā)的突觸后神經(jīng)元有關(guān)。例如參見(jiàn)，Tsien et al.(1996)Cell871327-1338。由于N-甲基-D-天冬氨酸受體與廣范圍的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患有關(guān)，所以對(duì)它的研究特別令人感興趣。例如參見(jiàn)，F(xiàn)oster et al.(1987)Nature 329395-396；及Mayer et al.(1990)Trends in Pharmacol.Sci.11254-260。
一氧化氮是一種擴(kuò)散性分子，其可作為大腦中一種新型的細(xì)胞間信使，也可在LTP過(guò)程中作為逆行信使。例如參見(jiàn)，Son et al.(1996)Cell871015-1023；及Wilson et al.(1997)Nature 386338。一氧化氮合酶是產(chǎn)生一氧化氮的酶，它的抑制劑可防止LTP的誘導(dǎo)。一氧化氮的下游效應(yīng)器之一是cGMP，其也與LTP的誘導(dǎo)有關(guān)。cGMP是由可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生的。可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的抑制劑可抑制LTP。例如參見(jiàn)，Zhuo etal.(1994)Nature 368635-639；及Boulton et al.(1995)Neuroscience69699-703。此外，cGMP可控制許多蛋白的活性，包括依賴(lài)cGMP的蛋白激酶G，其對(duì)LTP的誘導(dǎo)起作用。蛋白激酶G的抑制劑可阻斷LTP的誘導(dǎo)，蛋白激酶G的活化劑可促進(jìn)響應(yīng)較弱強(qiáng)直刺激的LTP誘導(dǎo)。例如參見(jiàn)，Zhuo et al.(1994)Nature 368635-639；Zhuo et al.(1994)Nature 368635-639。綜上所述，包括一氧化氮、cGMP和蛋白激酶G的信號(hào)通路與LTP的誘導(dǎo)相關(guān)?？烧{(diào)節(jié)信號(hào)通路的化合物的識(shí)別能夠?qū)W(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)提供有用的新治療方法。
概述一方面，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的方法。該方法包括對(duì)需要的受治療者使用如下通式(I)所示的稠環(huán)吡唑基化合物(fused pyrazolylcompound) A是H、R或 (下文中稱(chēng)為“(CH2)nAr3(R5)(R6)”)；Ar1、Ar2和Ar3中的每一個(gè)獨(dú)立地是苯基、噻吩基、呋喃基或吡咯基；R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一個(gè)獨(dú)立地是H、硝基、鹵素、R、OH、OR、C(O)OH、C(O)OR、C(O)SH、C(O)SR、C(O)NH2、C(O)NHR、C(O)NRR’、ROH、ROR’、RSH、RSR’、ROC(O)R’OH、NHR、NRR’、RNHR’或RNR’R”；或者R1和R2同時(shí)、R3和R4同時(shí)或R5和R6同時(shí)是ORO。R、R’和R”中的每一個(gè)獨(dú)立地是C1～C6烷基；及n是1、2或3。為增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶該化合物以有效量存在。
通式(1)包括吡唑基中心和至少兩個(gè)芳基，即Ar1和Ar2。通式(I)化合物的一個(gè)子集的特征在于A是(CH2)nAr3(R5)(R6)。例如Ar1是苯基，R1和R2分別取代在苯基的4位和5位。Ar2可以是5’-呋喃基，R3和R4中的一個(gè)取代在5’-呋喃基的2位，例如1-芐基-3-(5’-羥甲基-2’-呋喃基)-吲唑(化合物1)。Ar2也可以是苯基，R3和R4中的一個(gè)取代在苯基的4位，例如1-(3-氯-芐基)-3-(4’-甲苯基)-吲唑(化合物9)或1-(4-硝基-芐基)-3-(4’-甲苯基)-吲唑(化合物10)。在某些實(shí)施方案中，Ar3是苯基，n是1。
通式(I)化合物的另一個(gè)子集的特征在于A是H。例如Ar1是苯基，R1和R2分別取代在苯基的4位和5位。在另一個(gè)實(shí)施例中，Ar2是5’-呋喃基，R3和R4中的一個(gè)取代在5’-呋喃基的2位。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“芳基”包括苯基、噻吩基、呋喃基或吡咯基，其中的每一個(gè)可選擇地包括一個(gè)或多個(gè)取代部分。取代部分可以與R1、R2、R3、R4、R5或R6相同或不同。它們可以是鹵素、氨基、羥基、巰基、氰基、硝基、C1～C6烷基、C1～C6烯基、C1～C6烷氧基、芳基、雜芳基、或雜環(huán)基，其中烷基、烯基、烷氧基、芳基、雜芳基及雜環(huán)基可選擇地可被C1～C6烷基、鹵素、氨基、羥基、巰基、氰基或硝基取代。術(shù)語(yǔ)“烷基”既指直鏈烷基也指支鏈烷基。
下面列出的是稠環(huán)吡唑基化合物的一些具體實(shí)例，其可用來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法化合物1 化合物2
化合物3 化合物4 化合物5 化合物6
化合物7 化合物8 化合物9 化合物10
化合物11 化合物12 化合物13 化合物14
化合物15 化合物16 化合物17 化合物18
如上所述的稠環(huán)吡唑基化合物包括化合物本身，及需要時(shí)包括其鹽和其前體。這種鹽例如可通過(guò)稠環(huán)吡唑基化合物上帶負(fù)電荷的取代基(例如羧酸根離子)和陽(yáng)離子間的相互作用而形成。適合的陽(yáng)離子包括但不限于鈉離子、鉀離子、鎂離子和銨陽(yáng)離子，如四甲基銨離子。同樣，帶正電荷取代基(例如氨基)可與電相反電荷的離子形成鹽。適合的相反電荷離子包括但不限于氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根離子、硝酸根離子、磷酸根離子或醋酸根離子。前體的例子包括酯和其它藥學(xué)上可接受的衍生物，經(jīng)過(guò)對(duì)受治療者使用其能夠提供如上所述的稠環(huán)吡唑基化合物。
本發(fā)明也提供一種治療遺忘癥的方法。該方法包括對(duì)需要的受治療者使用有效量的一種或多種如上所述的稠環(huán)吡唑基化合物。在本文中遺忘癥指記憶缺失，其可起因于神經(jīng)心理性疾患。“神經(jīng)心理性疾患”的例子包括但不限于認(rèn)知、學(xué)習(xí)及記憶不足，源于神經(jīng)退化的疾患(例如亨丁頓氏癥(Huntington’s disease)、帕金森氏癥(Parkinson’s disease)或阿滋海默氏癥(Alzheimer’s disease))，情感性疾患(例如雙極性疾患、精神抑郁癥或季節(jié)性感情障礙)，及抑郁癥。
另一方面，本發(fā)明提供一種包裝產(chǎn)品。該包裝產(chǎn)品包括容器、在該容器內(nèi)的一種或多種稠環(huán)吡唑基化合物、及與該容器相關(guān)并表明用以增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶或治療遺忘癥的吡唑基化合物使用的說(shuō)明(例如標(biāo)簽或插入物)。
上述化合物在制備用于增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶或治療遺忘癥的藥物中的用途也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
從說(shuō)明書(shū)中和權(quán)利要求書(shū)中可更清楚本發(fā)明的其它特征、目的及優(yōu)點(diǎn)。
詳細(xì)說(shuō)明用于實(shí)施本發(fā)明方法的稠環(huán)吡唑基化合物可通過(guò)本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的方法制備(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,574,168號(hào))。這些方法包括下面的合成路線(xiàn)首先通過(guò)將芳酰氯與另一種芳基化合物接合而制備芳基芳基酮。每種芳基化合物可選擇地可被單取代或多取代。然后，酮與芳基烷基肼反應(yīng)以形成含有三個(gè)芳基的腙，芳基烷基肼的芳基可選擇地可被單取代或多取代。腙基通過(guò)烯化連接轉(zhuǎn)化成稠環(huán)吡唑基中心，另一個(gè)芳基在吡唑基中心的4-C和5-C處稠合，第三個(gè)芳基直接與吡唑基中心的3-C相連接。通過(guò)改變?nèi)我粋€(gè)芳基的取代基可得到稠環(huán)吡唑基化合物的衍生物。
上述合成路線(xiàn)中所用的化學(xué)物質(zhì)例如可以包括溶劑、反應(yīng)物、催化劑、保護(hù)基試劑及脫保護(hù)基試劑。為最終能夠合成稠環(huán)吡唑基化合物，上述的方法還可在此處明確說(shuō)明的步驟之前或之后包括其它步驟用以加入或除去適合的保護(hù)基團(tuán)。此外，各種合成步驟可按不同的順序或次序進(jìn)行以得到所需要的化合物。對(duì)于合成適用的稠環(huán)吡唑基化合物有效的合成化學(xué)轉(zhuǎn)化及保護(hù)基方法(保護(hù)和脫保護(hù))在本領(lǐng)域是公知的，例如在R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2d.Ed.，John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser and M.Fieser，F(xiàn)ieser andFieser’s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；及L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wileyand Sons(1995)及其后繼版本。
這樣合成的稠環(huán)吡唑基化合物可通過(guò)諸如柱色譜、高壓液相色譜或重結(jié)晶等方法進(jìn)一步純化。
本發(fā)明一個(gè)方面是增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶或治療源于神經(jīng)心理性疾患的遺忘癥的方法。該方法包括對(duì)需要的受治療者使用有效量的一種或多種稠環(huán)吡唑基化合物及藥學(xué)上可接受的載體。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“記憶”指頭腦儲(chǔ)存意識(shí)過(guò)程并在后來(lái)以某種程度的真實(shí)度再現(xiàn)此過(guò)程的能力。作為一種心理過(guò)程，記憶包括保持力、再現(xiàn)及識(shí)別。記憶的理論模型包括知覺(jué)感應(yīng)、短期記憶、工作記憶及長(zhǎng)期記憶(包括語(yǔ)義記憶、程序記憶及事件記憶)。其它的概念化記憶包括聽(tīng)覺(jué)記憶、視覺(jué)記憶、動(dòng)作記憶及識(shí)別記憶。術(shù)語(yǔ)“治療”指對(duì)患有源于神經(jīng)心理性疾患的遺忘癥、有遺忘癥的癥狀或者是具有易患遺忘癥體質(zhì)的受治療者應(yīng)用或使用含有稠環(huán)吡唑基化合物的組合物，用以治療、治愈、緩和、減輕、改變、矯正、改善、改進(jìn)或影響遺忘癥、遺忘癥的癥狀或者是易患遺忘癥的體質(zhì)?！坝行Я俊笔侵笇?duì)需要的受治療者使用的稠環(huán)吡唑基化合物的量可對(duì)該受治療者提供治療作用。稠環(huán)吡唑基化合物的有效量可以是約0.01mg/kg～300mg/kg。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知有效的劑量可以隨使用的方案、所用的賦形劑及與其它用以增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的藥劑或其它用以治療遺忘癥的藥劑一起使用的可能性而改變。
為實(shí)施本發(fā)明的方法，稠環(huán)吡唑基化合物可口服使用、腸胃外使用、吸入噴霧使用或通過(guò)灌輸貯藏器使用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、疾病部位及顱內(nèi)注射或灌輸技術(shù)。
用于口服使用的組合物可以是任何口服可接受的劑量形式，包括但不限于膠囊、片劑、乳狀液及水性懸浮液、分散液和溶液。在口服片劑情況下，通常所用的載體包括乳糖及玉米淀粉。一般也可加入潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂。對(duì)于膠囊形式的口服使用，有效的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)口服使用水性懸浮液或乳狀液時(shí)，活性成分可以懸浮或溶解在與乳化劑或懸浮劑結(jié)合的油相中。如果需要，可以加入某些甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。根據(jù)藥物制劑領(lǐng)域中公知的技術(shù)也可制備吸入組合物，也可制成鹽溶液，并應(yīng)用用以提高生物適用性的芐醇或其它適合的防腐劑、吸收促進(jìn)劑，碳氟化合物和/或本領(lǐng)域公知的其它增溶劑或分散劑。
無(wú)菌注射組合物，例如無(wú)菌注射水性或油性懸浮液，可使用適合的分散劑或潤(rùn)濕劑(例如Tween 80)和懸浮劑并根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)制成。無(wú)菌注射制劑也可以是在非毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌注射溶液或懸浮液，例如1，3-丁二醇的溶液?？梢允褂玫目山邮艿妮d體和溶劑是甘露醇、水、Ringer’s溶液和等滲壓氯化鈉溶液。此外，常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)的是無(wú)菌固定油(例如合成的單或二甘油酯)。在注射劑的制備中可以使用諸如油酸等脂肪酸及其甘油酯衍生物，這是因?yàn)樗鼈兺ǔＪ撬幬锟山邮艿挠?，如橄欖油或蓖麻油，特別是它們的聚氧乙基化形式。這些油溶液或懸浮液也可以含有長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素或相似的分散劑。
藥物組合物中的載體必須是“可接受的”，是指其可與制劑的活性成分相容(優(yōu)選能夠溶解它)并且對(duì)欲治療的受治療者無(wú)害。例如，增溶劑或者一種或多種增溶劑可用作傳輸稠環(huán)吡唑基化合物的藥物賦形劑，其中如環(huán)糊精可與稠環(huán)吡唑基化合物形成特效更可溶的配合物。其它載體的例子包括膠體二氧化硅、硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及D & C Yellow#10。
適當(dāng)?shù)捏w外分析可用來(lái)初步評(píng)估稠環(huán)吡唑基化合物提高長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)誘導(dǎo)的能力。通過(guò)本領(lǐng)域公知的后續(xù)過(guò)程也可進(jìn)行體內(nèi)篩選。參見(jiàn)下面具體的實(shí)施例。
盡管沒(méi)有進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但可以認(rèn)為上面的說(shuō)明足以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，下面的具體實(shí)施方案僅用于解釋性的而不以任何方式限制本說(shuō)明書(shū)的其余部分。本文中所引用的所有出版物以其全部?jī)?nèi)容引為參考。
1-芐基-3-(5’-羥甲基-2’-呋喃基)-吲唑(化合物1)的合成首先通過(guò)在無(wú)水THF(20mL)中攪拌無(wú)水氯化鈣(88.8mg，0.8mmole)和硼氫化鈉(60mg，1.6mmole)4小時(shí)制備硼氫化鈣。然后在30±2℃下將含有88.0mg 1-芐基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)-吲唑(0.27mmole)的30mL THF溶液滴加到硼氫化鈣溶液中?；旌衔锛訜峄亓?小時(shí)，冷卻，用碎冰猝滅反應(yīng)，減壓下除去THF，過(guò)濾得固體產(chǎn)品。固體用二氯甲烷萃取，萃取物濃縮到50mL，加入石油醚后沉淀出固體。收集沉淀，用柱色譜(硅膠-苯)純化，得到70.0mg 1-芐基-3-(5’-羥甲基-2’-呋喃基)-吲唑，產(chǎn)率87％。
mp108-109℃MS(％)，m/z304(M+)IR(KBr)υmax3350cm-1(-OH)1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ4.51(2H，d，J＝5.5Hz，-CH2O-)，5.31(1H，t，J＝5.5Hz，-OH)，5.70(2H，s，＝NCH2-)，6.48(1H，d，J＝3.4Hz，H-4’)，6.97(1H，d，J＝3.4Hz，H-3’)，7.21-7.31(6H，m，H-5，苯基)，7.45(1H，t，J＝8.2Hz，H-6)，7.75(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，H-7)，8.12(1H，dd，J＝8.2，1.0Hz，C4-H)。
電生理學(xué)測(cè)試斬首后快速摘除成年(150-250mg，用于長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的誘導(dǎo))或年輕(2-3周齡，用于長(zhǎng)過(guò)程抑郁的誘導(dǎo))Wistar大鼠的大腦，并解剖出海馬。橫向海馬切片(450μm厚)立即置于冰冷碎塊緩沖液中，緩沖液中含有124mM NaCl，3mM KCl，1.0mM Na2HPO4，25mM NaHCO3，0.5mM CaCl2，5.0mM MgSO4，10mM葡萄糖，并用95％ O2和5％CO2飽和。然后切片在室溫下保持在界面室中，并以1-2mL/min的流速用人工腦脊液(ACSF)灌流。ACSF組合物含有124mM NaCl，4.4mM KCl，1.0mM Na2HPO4，25mM NaHCO3，2.0mM或2.5mM CaCl2，1.0mM MgSO4，10mM葡萄糖，并充入95％O2和5％CO2。通過(guò)置于Schaffer側(cè)枝/連合處通路上的雙極刺激電極產(chǎn)生的測(cè)試脈沖激發(fā)場(chǎng)興奮性突觸后電位(fePSP)，并使用裝有2M NaCl的玻璃微電極(5-10MΩ)從CA1的放射狀層開(kāi)始記錄。測(cè)試脈沖持續(xù)時(shí)間為100μsec，在0.02Hz時(shí)得出測(cè)試響應(yīng)。為在皮質(zhì)扁桃體通路中記錄場(chǎng)電位，刺激電極放置在外包中，其包含從聽(tīng)皮層到側(cè)扁桃體的纖維。當(dāng)記錄扁桃體的fEPSP時(shí)，在灌流溶液中含有荷包牡丹堿(10μM)。為提高通過(guò)灌流系統(tǒng)應(yīng)用的稠環(huán)吡唑基化合物的效力，記錄室中的ACSF水平需足夠高以覆蓋海馬切片但不使它們漂浮。所有的稠環(huán)吡唑基化合物在ACSF中灌流。
記錄激發(fā)的fEPSP，并分析數(shù)據(jù)。計(jì)算fEPSP的初始斜率，數(shù)據(jù)表示成fEPSP基線(xiàn)斜率的平均百分比。
由化合物1增強(qiáng)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)LTP是最主要的學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)心理模型。在大鼠海馬切片的Schaffer側(cè)枝-CA1通路中的LTP由較強(qiáng)的強(qiáng)直刺激誘導(dǎo)，其由2串頻率為100Hz、串長(zhǎng)為1秒、間隔為20秒的串組成。較強(qiáng)的強(qiáng)直刺激可誘導(dǎo)LTP，強(qiáng)直刺激后50分鐘時(shí)fEPSP的斜率為163.4±7.0％(n＝6)。通過(guò)用化合物1(1.6μM)灌流6分鐘(強(qiáng)直刺激之前3分鐘和強(qiáng)直刺激之后3分鐘)LTP明顯增強(qiáng)。強(qiáng)直刺激后50分鐘時(shí)fEPSP的斜率為404.7±34.9％(n＝5)。
較弱的強(qiáng)直刺激不能誘導(dǎo)LTP，其由頻率為20Hz、串長(zhǎng)為0.5秒的串組成。出乎意料的是，通過(guò)用化合物1(1.6μM)灌流6分鐘(強(qiáng)直刺激之前3分鐘和強(qiáng)直刺激之后3分鐘)可誘導(dǎo)LTP。在1小時(shí)時(shí)fEPSP的斜率為172.9±10.7％(n＝7)。3個(gè)刺激串(100Hz，1秒，間隔3分鐘)可誘導(dǎo)暫時(shí)的增強(qiáng)，這種增強(qiáng)在扁桃體中在30分鐘內(nèi)降低到基線(xiàn)。然而，同樣的刺激串在化合物1(n＝4)的存在下可誘導(dǎo)持久的LTP，其可穩(wěn)定地持續(xù)至少1小時(shí)。
化合物1對(duì)LTP增強(qiáng)的機(jī)理研究一氧化氮的作用。將化合物1和NG-硝基-L-精氨酸-甲酯(L-NAME，從RBI購(gòu)得)(300μM)同時(shí)灌流，后者是一氧化氮合酶抑制劑，由化合物1誘導(dǎo)的LTP明顯減弱。另一方面，血紅素加氧酶抑制劑鋅原卟啉(1μM)沒(méi)有影響由化合物1誘導(dǎo)的LTP。此結(jié)果表明一氧化氮而不是一氧化碳與由化合物1增強(qiáng)的LTP誘導(dǎo)有關(guān)。
化合物1與1H-[1，2，4]二唑[4，3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ，從TOCRIS購(gòu)得)一起灌流，后者是可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的特效抑制劑。沒(méi)有ODQ時(shí)，較弱強(qiáng)直刺激(50Hz/0.5s)時(shí)化合物1可誘導(dǎo)LTP。有ODQ(5μM)時(shí)，化合物1不能誘導(dǎo)LTP。fEPSP的斜率為107.8±3.9％(n＝5)。此結(jié)果表明可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶與由化合物1增強(qiáng)的LTP誘導(dǎo)有關(guān)。
化合物1與KT5823(從Calbiochem購(gòu)得)一起灌流，后者是蛋白激酶G的特效抑制劑。沒(méi)有KT5823時(shí)，較弱強(qiáng)直刺激(50Hz/0.5s)時(shí)化合物1可誘導(dǎo)LTP。有KT5823(2μM)時(shí)，化合物1誘導(dǎo)的LTP受到抑制。fEPSP的斜率為112.9±5.4％(n＝4)。此結(jié)果表明一氧化氮-cGMP-蛋白激酶G-信號(hào)通路與由化合物1增強(qiáng)的LTP誘導(dǎo)有關(guān)。
化合物1還與2-氨基-5-膦?；焖?phosphonopentanoic acid)(AP5，從RBI購(gòu)得)一起灌流，后者是N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑。沒(méi)有AP5時(shí)，較弱強(qiáng)直刺激(50Hz/0.5s)時(shí)化合物1可誘導(dǎo)LTP。有AP5(100μM)時(shí)，化合物1誘導(dǎo)的LTP延遲。fEPSP的斜率為142.1±13.5％(n＝5)。此結(jié)果表明從N-甲基-D-天冬氨酸受體流入的Ca2+與由化合物1增強(qiáng)的LTP誘導(dǎo)有關(guān)。
此外，化合物1與MCPG((±)-α-甲基-(4-羧苯基)甘氨酸；從Sigma/RBI購(gòu)得)一起灌流，后者是代謝型受體。有MCPG(100μM)時(shí)，化合物1誘導(dǎo)的LTP下降。同時(shí)應(yīng)用AP-5和MCGP可抑制化合物1誘導(dǎo)的LTP。fEPSP的斜率為111.5±12.3％(n＝3)。
當(dāng)化合物1加到ACSF(1.6μM)中時(shí)2串較強(qiáng)的強(qiáng)直刺激(100Hz/1秒)10分鐘后，化合物1沒(méi)有進(jìn)一步增強(qiáng)LTP，表明在高頻刺激時(shí)一氧化氮被釋放出，化合物1增強(qiáng)的LTP誘導(dǎo)僅在強(qiáng)直刺激后的幾分鐘內(nèi)發(fā)生。
化合物1 對(duì)低頻刺激(LFS)誘導(dǎo)的可塑性L(fǎng)FS(900脈沖，1Hz)被傳輸?shù)綇哪贻p大鼠(7-14天)得到的海馬切片以誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)期抑郁(LTD)。以1Hz刺激海馬切片3分鐘沒(méi)有產(chǎn)生突觸傳遞的LTD。然而，在化合物1(83.4±10.9％，n＝3)存在時(shí)，這種短期LFS可明顯地誘導(dǎo)LTD。在LFS過(guò)程中用化合物1(1.6μM)灌流15分鐘可將LTD可塑性逆轉(zhuǎn)成LTP。在一氧化氮供體硝普鹽(300μM)和化合物1(1.6μM)存在下傳輸0.02Hz的較弱電刺激。同時(shí)灌流一氧化氮供體硝普鹽(30μM)和化合物1(1.6μM)可誘導(dǎo)LTD。此數(shù)據(jù)表明在化合物1存在下一氧化氮供體能夠模擬強(qiáng)直刺激活動(dòng)。單獨(dú)的化合物1或硝普鹽在0.02Hz的刺激時(shí)沒(méi)有增強(qiáng)fEPSP。
吡唑基化合物對(duì)LTP的增強(qiáng)測(cè)試化合物1-8在海馬切片中的LTP誘導(dǎo)。結(jié)果如表1所示，表明強(qiáng)直刺激(50Hz，0.5s)60分鐘后的fEPSP斜率。每種化合物(1.6μM)在較弱的強(qiáng)直刺激之前3分鐘和較弱的強(qiáng)直刺激之后3分鐘灌流。
表1吡唑基化合物對(duì)LTP誘導(dǎo)增強(qiáng)的作用
動(dòng)作任務(wù)測(cè)試Morris水迷宮在位于具有區(qū)別性視覺(jué)提示的房間內(nèi)的圓形水池(直徑為224cm，高度為46cm)中進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。加水至水深為36cm，在確定的象限中心設(shè)置透明的塑料平臺(tái)(25×25cm，高度為32cm)。在測(cè)試環(huán)境中訓(xùn)練大鼠兩天在沒(méi)有透明塑料平臺(tái)的水池中自由游泳。每次訓(xùn)練期是2分鐘，并由實(shí)驗(yàn)者將大鼠從水池中取回。然后，在隨后的六天內(nèi)每天大鼠接受四次連續(xù)的訓(xùn)練測(cè)試。在每次訓(xùn)練測(cè)試中，每只大鼠從一個(gè)象限中隨機(jī)放入水中。大鼠必須游泳直到其爬到浸在水面下的塑料平臺(tái)上為止。記錄從被放入水中到爬上塑料平臺(tái)的時(shí)間，并定義成為逃避潛伏期。如果大鼠在120秒后不能找到塑料平臺(tái)，那么就由實(shí)驗(yàn)者將其抓住并放到塑料平臺(tái)上。每只大鼠在平臺(tái)上停留60秒，這也是測(cè)試的時(shí)間間隔。每天在第一次訓(xùn)練測(cè)試前10分鐘將化合物1(1mg/kg)或載體注射進(jìn)每只大鼠。在每天最后的訓(xùn)練測(cè)試后，每只大鼠用毛巾擦干，并將電加熱器放進(jìn)它的棲息籠中。
有充分證據(jù)表明海馬與空間信息的捕獲和保持有關(guān)。例如參見(jiàn)，Ohonet al.(1979)Behav.Brain Sci.2316-365；及Barnes(1988)Trend Neurosci.11163-169。測(cè)試化合物1對(duì)Morris水迷宮中空間記憶捕獲的作用。大鼠每天接受連續(xù)的訓(xùn)練測(cè)試。每天在第一次訓(xùn)練測(cè)試前10分鐘注射化合物1(1mg/kg)。數(shù)據(jù)表明化合物1可縮短訓(xùn)練第一天內(nèi)第2～4次的逃避潛伏期，這表明化合物1可促進(jìn)短期記憶。對(duì)照組的第2～4次逃避潛伏期分別為93.8±8.7s、79.3±12.3s、57.6±12.5s，化合物1組(n＝10)的第2～4次逃避潛伏期分別為50.4±10.2s、47.3±6.8s、30.3±10.3s?；衔?組隨后3天訓(xùn)練中的第一次測(cè)試的逃避潛伏期也明顯縮短，對(duì)照組的逃避潛伏期分別為91.1±9.8s、47.1±3.9s、35.3±6.1s，化合物1組(n＝10)的逃避潛伏期分別為55.4±12.8s、15.3±2.1s、13.4±1.7s。這些結(jié)果表明化合物1也可增強(qiáng)長(zhǎng)期記憶。盡管化合物1在4天內(nèi)僅使用1次，但是在全部21天的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)化合物組1的逃避潛伏期均較短。在第21天時(shí)對(duì)照組和化合物1組的平均逃避潛伏期分別是13.5±1.8s和6.0±0.5s(每組n＝10)。上述結(jié)果表明化合物1對(duì)于提高學(xué)習(xí)記憶是有前景的藥物。將化合物1與1.25％的羧甲基纖維素(CMC)混合并在連續(xù)6天的第一次測(cè)試前30分鐘直接口服輸送到胃(10mg/kg)。與注射使用相似，口服化合物1也可促進(jìn)短期記憶和長(zhǎng)期記憶。
由于L-NAME可對(duì)抗海馬切片中化合物1誘導(dǎo)的LTP增強(qiáng)，所以進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以測(cè)試L-NAME對(duì)由化合物1引起的改進(jìn)的學(xué)習(xí)記憶的作用。在這些實(shí)驗(yàn)中，對(duì)大鼠慢慢地植入插管，并在每天的第一次測(cè)試前10分鐘通過(guò)腦室內(nèi)(intracerebroventrically)注射L-NAME(1mmole/10mL)或鹽水，同時(shí)經(jīng)i.p.(腹腔)注射化合物1(1mg/kg)。數(shù)據(jù)表明L-NAME可引起深度的遺忘癥并明顯阻斷由化合物1誘導(dǎo)的增強(qiáng)的學(xué)習(xí)記憶。KT 5823的腦室內(nèi)使用也會(huì)削弱化合物1誘導(dǎo)的增強(qiáng)。
被動(dòng)回避和主動(dòng)回避測(cè)試用Liang et al.(1998，Chin.J.Physiol.4133-44)中所述的過(guò)程訓(xùn)練大鼠，并進(jìn)行單次被動(dòng)抑制性回避測(cè)試。簡(jiǎn)言之，將槽形通道的裝置用滑動(dòng)門(mén)分成照明良好的安全室和黑暗震動(dòng)室。將大鼠置于遠(yuǎn)離門(mén)的明亮側(cè)并面對(duì)門(mén)。當(dāng)大鼠轉(zhuǎn)向時(shí)，打開(kāi)門(mén)。大鼠進(jìn)入暗室后，通過(guò)定時(shí)器控制的恒電流震動(dòng)器(Lafayette Instruments，Model80240和Model 58010，Indiana，USA)使其受到不可避免的震動(dòng)。經(jīng)過(guò)震動(dòng)后，從通道中取出大鼠并放回它的棲息籠中。保持測(cè)試24小時(shí)或10天后，將大鼠再次放入通道中，其全部四只腳進(jìn)入震動(dòng)室的潛伏期用作保持力分值。如果在5分鐘或10分鐘內(nèi)大鼠沒(méi)有進(jìn)入，那么終止測(cè)試實(shí)驗(yàn)，最高分值是300s或600s。
扁桃體也與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。研究表明大腦結(jié)構(gòu)尤其與情感信息的處理有關(guān)。例如參見(jiàn)，Cahill and McGaugh(1990)Behav.Neurosci.104532-543；及Gilbert et al.(1991)Behav.Neurosci.105533-561。據(jù)報(bào)道一氧化氮也與依賴(lài)活動(dòng)性的突觸可塑性及扁桃體核中的被動(dòng)回避學(xué)習(xí)有關(guān)。例如參見(jiàn)，Bernabeu et al.(1995)Neuro Report 61498-1500；Watanabeet al.(1995)Brain Res.688233-236；及Teledgy and Kokavszky(1997)Neuropharmacology 361583-1587。研究化合物1對(duì)被動(dòng)回避學(xué)習(xí)的作用。在震動(dòng)訓(xùn)練前10分鐘注射化合物1(i.p.，1mg/kg)。結(jié)果表明化合物1可明顯延長(zhǎng)亮室內(nèi)的保持力潛伏期。這種記憶可持續(xù)幾天。即使在第10天測(cè)試，保持力分值也非常高。在第1天和第10天時(shí)測(cè)試的化合物1處理的大鼠中，多數(shù)大鼠的保持力潛伏期大于5分鐘(對(duì)照組中15只大鼠有2只達(dá)到，化合物1處理組中12只大鼠中有11只達(dá)到)。當(dāng)將化合物1與1.25％CMC混合并在震動(dòng)前直接輸送到胃(10mg/kg)時(shí)，分別進(jìn)行1天和隨后10天的保持力測(cè)試。化合物1大大地提高了被動(dòng)回避學(xué)習(xí)能力(表2)。如表3所示，化合物1(i.p.，1mg/kg)可促進(jìn)老年大鼠的學(xué)習(xí)行為，盡管這種作用明顯低于較年輕的大鼠。選擇1歲的大鼠進(jìn)行這種實(shí)驗(yàn)。在震動(dòng)前10分鐘經(jīng)i.p.注射化合物1(1mg/kg)。分別進(jìn)行1天和隨后10天的保持力測(cè)試。
表2口服化合物1對(duì)被動(dòng)回避保持力的增強(qiáng)
表3在老年大鼠中注射化合物1對(duì)被動(dòng)回避保持力的增強(qiáng)
上述結(jié)果表明，化合物1可提高年輕大鼠和老年大鼠的被動(dòng)回避學(xué)習(xí)。在這些測(cè)試中，化合物1優(yōu)先影響新形成記憶的捕獲，這是一種被認(rèn)為與LTP誘導(dǎo)態(tài)相關(guān)的過(guò)程。對(duì)大鼠而言震動(dòng)被認(rèn)為是很大的刺激。在這種情況下假設(shè)釋放出一氧化氮并很快的產(chǎn)生新陳代謝變化。當(dāng)震動(dòng)30分鐘后注射化合物1時(shí)，化合物1對(duì)大鼠沒(méi)有任何作用。這些結(jié)果表明化合物1僅在記憶測(cè)試之前或過(guò)程中被使用時(shí)才可提高記憶行為。
這些數(shù)據(jù)也表明當(dāng)震動(dòng)30分鐘后注射時(shí)，化合物1對(duì)大鼠回避行為沒(méi)有任何作用。此外，由化合物1誘導(dǎo)的增強(qiáng)作用明顯受L-NAME和KT5823(i.c.v.，分別為1mmole和0.2nmole)的抵抗。這些結(jié)果表明化合物1僅在記憶測(cè)試之前或過(guò)程中被使用時(shí)才可提高記憶行為。此外，在相關(guān)訓(xùn)練前10分鐘使用化合物1而不使用震動(dòng)，可延長(zhǎng)被動(dòng)抑制性回避，這表明化合物1可增強(qiáng)沒(méi)有震動(dòng)的環(huán)境因素的記憶捕獲。
為測(cè)試主動(dòng)回避，將大鼠置于暗室內(nèi)，并面對(duì)門(mén)。門(mén)是半開(kāi)的，大鼠有10秒鐘的時(shí)間穿過(guò)門(mén)進(jìn)入亮室。對(duì)于這次實(shí)驗(yàn)沒(méi)有選擇可在10秒內(nèi)穿過(guò)安全側(cè)的大鼠。10秒鐘后開(kāi)始震動(dòng)，大鼠逃進(jìn)安全室，關(guān)上門(mén)。48小時(shí)后，測(cè)定在黑暗震動(dòng)室內(nèi)的保持力時(shí)間。淘汰在相關(guān)訓(xùn)練中可于10秒內(nèi)進(jìn)入亮室的大鼠。第1天在放進(jìn)暗室的10秒后使用震動(dòng)。第2天測(cè)定記憶保持力。在震動(dòng)前10分鐘注射化合物1可引起記憶保持力的明顯提高，并降低從震動(dòng)室到安全室的逃避潛伏期。此外，由化合物1誘導(dǎo)的記憶增強(qiáng)作用明顯受L-NAME和KT5823(i.c.v.，分別為1mmole和0.2nmole)的抑制。這樣，化合物1通過(guò)NO-cGMP-PKG通路可明顯提高大鼠被動(dòng)回避和主動(dòng)回避的記憶行為。
轉(zhuǎn)棒測(cè)試(Rotorod Test)用小鼠(雄性，20-25gm)進(jìn)行這種實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)棒是塑料圓柱棒(3cm直徑×13cm高度)。棒支撐于兩面墻壁的末端，距墻壁地基25cm。棒末端的墻壁足夠高，從而小鼠不能爬過(guò)棒。每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次測(cè)試。在第一次訓(xùn)練測(cè)試之前20分鐘經(jīng)i.p.注射化合物1(1mg/kg)或載體。對(duì)于每次轉(zhuǎn)棒測(cè)試，將小鼠置于棒上并計(jì)時(shí)，直到它們從棒上跌落。計(jì)時(shí)最長(zhǎng)達(dá)3分鐘，時(shí)間間隔是10分鐘，以28rpm的轉(zhuǎn)速用電動(dòng)發(fā)動(dòng)機(jī)旋轉(zhuǎn)棒。
據(jù)報(bào)道小腦一氧化氮也與LTD和動(dòng)作學(xué)習(xí)有關(guān)。例如參見(jiàn)，Li et al.(1995)J.Neurophysiol.74489-494。研究化合物1對(duì)動(dòng)作學(xué)習(xí)的提高。選擇小鼠進(jìn)行這種實(shí)驗(yàn)?；衔?(i.p.，1mg/kg)明顯可提高小鼠在旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)棒(28rpm)上的動(dòng)作協(xié)調(diào)性。隨著測(cè)試次數(shù)的增加對(duì)照小鼠的能力得到了提高，且在第三次測(cè)試時(shí)有較好的提高。然而，用化合物1處理的小鼠即使在第一次測(cè)試時(shí)在棒上也表現(xiàn)出較好的平衡，并且在第二次測(cè)試時(shí)有非常好的動(dòng)作協(xié)調(diào)性。顯然化合物1通過(guò)作用于小腦可提高動(dòng)作學(xué)習(xí)。
其它實(shí)施方案說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的所有特征可以以任何方式組合。說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的每個(gè)特征可用變化的起同樣、等價(jià)或相似作用的特征來(lái)代替。由此，除非另有明確說(shuō)明，公開(kāi)的每個(gè)特征僅是等價(jià)或相似特征群的一個(gè)實(shí)例。
本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可從上述說(shuō)明書(shū)很容易地確定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)特征，而不會(huì)脫離本發(fā)明的精神和范圍，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員也可對(duì)本發(fā)明作出各種變化和修改以使其適于各種應(yīng)用和條件。例如，稠環(huán)吡唑基化合物結(jié)構(gòu)上的相似化合物也可用于實(shí)施本發(fā)明。這樣，其它實(shí)施方案也包含在權(quán)利要求書(shū)之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶或治療遺忘癥的方法，所述方法包括對(duì)需要的受治療者使用有效量的如下通式所示的化合物 其中A是H、R或 Ar1、Ar2和Ar3中的每一個(gè)獨(dú)立地是苯基、噻吩基、呋喃基或吡咯基；R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一個(gè)獨(dú)立地是H、硝基、鹵素、R、OH、OR、C(O)OH、C(O)OR、C(O)SH、C(O)SR、C(O)NH2、C(O)NHR、C(O)NRR’、ROH、ROR’、RSH、RSR’、ROC(O)R’OH、NHR、NRR’、RNHR’或RNR’R”；或者R1和R2同時(shí)、R3和R4同時(shí)或R5和R6同時(shí)是ORO；其中R、R’和R”中的每一個(gè)獨(dú)立地是C1～C6烷基；及n是1、2或3。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中A是
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中Ar1是苯基。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中R1和R2分別取代在苯基的4位和5位。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)取代在呋喃基的2位。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其中Ar3是苯基。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中n是1。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中Ar1是苯基。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中R1和R2分別取代在苯基的4位和5位。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中R5和R6中的每一個(gè)都是H，R3和R4中的一個(gè)取代在呋喃基的2位。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中R1和R2中的每一個(gè)都是H。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)是H，另一個(gè)是CH2NCH3。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)是H，另一個(gè)是CH2OH。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)是H，另一個(gè)是CH2OCH3。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)是H，另一個(gè)是COOCH3。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)是H，另一個(gè)是CH2OH。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中R1和R2中的每一個(gè)都是H。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中R1是H，R2是F。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中R1是H，R2是OCH3。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其中R1和R2同時(shí)是OCH2O。
23.如權(quán)利要求2所述的方法，其中Ar1是噻吩基。
24.如權(quán)利要求3所述的方法，其中Ar2是苯基。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)取代在苯基的4位。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)是H，另一個(gè)是CH3。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其中Ar3是苯基。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中n是1。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)取代在苯基的4位。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)是H，另一個(gè)是CH3。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中R1和R2中的每一個(gè)都是H，R5和R6中的一個(gè)是H，另一個(gè)是取代在苯基3位的Cl。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中R1和R2中的每一個(gè)都是H，R5和R6中的一個(gè)是H，另一個(gè)是取代在苯基4位的NO2。
33.如權(quán)利要求1所述的方法，其中A是H。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中Ar1是苯基。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中R1和R2分別取代在苯基的4位和5位。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)取代在呋喃基的2位。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中R1和R2中的每一個(gè)都是H。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)是H，另一個(gè)是COOCH3。
40.如權(quán)利要求33所述的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中R3和R4中的一個(gè)取代在呋喃基的2位。
全文摘要
本發(fā)明提供一種增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶或治療遺忘癥的方法。該方法包括對(duì)需要的受治療者使用如通式(I)所示的化合物，A是H、R或a；Ar
文檔編號(hào)A61K31/415GK1585637SQ02822278
公開(kāi)日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2002年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者符文美, 梁庚辰, 錢(qián)韋伶, 郭盛助, 李芳裕, 鄧哲明 申請(qǐng)人:卡爾斯拜德技術(shù)公司