專利名稱：滇南臭蛙天然抗氧化肽的改造體及其制備方法、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供兩種來源于滇南臭娃(Odorrana tiannanensis)的天然抗氧化肽的改造體0A-0TVC、OA-OTC及其制備方法、應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自由基指任何包含一個未成對電子的原子或原子團(tuán)。生物體與外界接觸和自身產(chǎn)生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、脂質(zhì)過氧自由基、二氧化氮、一氧化氮自由基、單線態(tài)氧和臭氧。在較高濃度下，活性氧自由基對生物細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、核酸、脂類和蛋白質(zhì)造成損傷。造成DNA損傷，進(jìn)一步引起復(fù)制錯誤、基因組不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)錄意外起始或終止，從而導(dǎo)致生物體變異或疾病發(fā)生；引起細(xì)胞膜流動性和通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變；引起蛋白質(zhì)氧化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和失活。
目前發(fā)現(xiàn)，活性氧自由基與多種人類疾病有關(guān),如癌癥、心腦血管疾病、缺血再灌注損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病和衰老等。為了抵抗活性氧自由基對機(jī)體的損害，在漫長的進(jìn)化過程中生物體形成多種不同的自由基清除系統(tǒng)，包括非基因編碼的小分子物質(zhì)，如尿酸、維生素C、維生素E、胡蘿卜烯類、硫辛酸和輔酶Q等；基因編碼的大分子抗氧化酶類，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶、過氧化物酶、硫氧還蛋白酶系統(tǒng)和谷胱甘肽酶系統(tǒng)；基因編碼的小分子抗氧化肽類，如從兩棲類蛙科動物皮膚中發(fā)現(xiàn)的各種小分子抗氧化多肽。各種不同類型的自由基清除劑在醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力，如維生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。我國擁有豐富的兩棲類動物資源，它是中國生物資源的重要組成部分，其中很多物種具有食用或藥用等價值，具有很大的開發(fā)利用潛力。兩棲動物由于長期生活在潮濕、陰暗、微生物大量滋生的環(huán)境下，在長期自然進(jìn)化過程中形成了三套防御機(jī)制(1)物理屏障，粘液腺分泌大量糖蛋白和蛋白聚糖，包裹在皮膚外表面，阻礙病原菌的侵入；(2)獲得性免疫系統(tǒng)，兩棲動物皮膚中含有抗體IgG ; (3)先天免疫系統(tǒng)，主要由大量的抗菌肽和抗氧化肽構(gòu)成。我國對兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對其皮膚活性肽類物質(zhì)的研究還鮮有報(bào)道。滇南臭蛙(Odorrana tiannanensis)屬于兩棲綱無尾目娃科娃屬，為中國的特有物種,分布于海南、云南等地，多生活于陰暗的水流湍急的山澗中。該物種的模式產(chǎn)地在云南河口。目前關(guān)于滇南臭蛙形態(tài)、發(fā)育和分子進(jìn)化已有報(bào)道，關(guān)于滇南臭蛙來源的天然抗菌-抗氧化多功能肽，我們前期工作已有報(bào)道。本發(fā)明的滇南臭娃(Odorrana tiannanensis)的天然抗氧化肽的改造體0A-0TVC.0A-0TC,分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，為線性分子，方便化學(xué)合成及基因工程制備。相比較已報(bào)道的其他抗氧化肽及改造前體，0A-0TVC、0A-0TC的抗氧化性更強(qiáng)，對DPPH，ABS自由基均具有極強(qiáng)的還原性，因此可以成為開發(fā)抗氧化藥物、食品添加劑、化妝品有效成分的優(yōu)良模板。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供兩種具有很強(qiáng)的抗氧化能力的，來源于滇南臭蛙(Odorranatiannanensis)天然抗氧化肽的改造體0A-0TVC、OA-OTC及制備方法及應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為改造體OA-OTVC : —種直鏈小肽，含有16個氨基酸殘基，分子量為1688. 06 Da,等電點(diǎn)為9. 85 ;其多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為纈氨酸-纈氨酸-賴氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-賴氨酸；改造體OA-OTC :—種直鏈小肽，含有14個氨基酸殘基，分子量為1489. 79Da，等電點(diǎn)為9. 62 ;其多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為賴氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-賴氨酸。根據(jù)二者的氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列；通過HPLC反相·柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于95% ;用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定其分子量。改造體抗菌肽的應(yīng)用，所述改造體抗菌肽用于制備抗氧化藥物、食品添加劑、化妝品有效成分的用途。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明根據(jù)滇南臭娃天然抗氧化肽odorranain-A-OT的氨基酸序列，利用分子改造方法設(shè)計(jì)odorranain-A-OT的改造體0A-0TVC、0A-0TC,該改造體具有極強(qiáng)的抗氧化活性，此外具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、制備方法簡單等有益特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例I來源于滇南臭娃(Odorrana tiannanensis)天然抗氧化肽的改造體0A-0TVC、0A-0TC的化學(xué)制備方法I、0A-0TVC、0A-0TC 的制備方法根據(jù)滇南臭娃(Odorrana tiannanensis)天然抗氧化肽改造體0A-0TVC、0A-0TC的氨基酸序列，用自動多肽合成儀(433A，AppliedBiosystems)合成其全序列,利用HPLC反相柱層析脫鹽。II、分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F)。III、純化的0A-0TVC、0A-0TC用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。測定結(jié)果為0A_0TVC、0A-0TC是滇南臭娃滇南臭娃(Odorrana tiannanensis)天然抗氧化肽odorranain-A-OT的兩種變異體。0A-0TVC、0A-0TC其均是直鏈多肽，分別含有16、14個氨基酸殘基，分子量分別為1688.06 Da、1489. 79Da，等電點(diǎn)分別為9. 85、9. 62。。0A-0TVC全序列為纈氨酸-纈氨酸-賴氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-賴氨酸；0A-0TC全序列為賴氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-賴氨酸。 實(shí)施例2 OA-OTVC, OA-OTC的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)I. DPPH自由基清除活性稱取一定量的DPPH (2，2' - 二苯代苦味?；诫?，用甲醇溶解，配成6 X 10_5 M的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。將92 μ I DPPH溶液和8 μ I樣品(0A-0TVC、OA-OTC, 2 mg/ml)混合，分別在室溫下避光靜置30 min，并分別于517 nm處測定吸光值?？瞻讓φ战M以樣品溶解介質(zhì)代替待測樣品。實(shí)驗(yàn)做三個平行，紫外分光光度計(jì)調(diào)零時使用甲醇。DPPH·清除率(%) = (AB — AA)/ABX100 (AB:空白對照組吸光值；AA:樣品組吸光值)。表I. DPPH抗氧化活性
權(quán)利要求
1.滇南臭蛙天然抗氧化肽的改造體，其特征在于，該改造體包括兩種=OA-OTVC和OA-OTC OA-OTVC :ー種直鏈小肽，含有16個氨基酸殘基，分子量為1688. 06 Da，等電點(diǎn)為9. 85 ；其多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為纈氨酸-纈氨酸-賴氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-賴氨酸； OA-OTC : ー種直鏈小肽，含有14個氨基酸殘基，分子量為1489. 79Da，等電點(diǎn)為9. 62 ；其多肽全序列ー級結(jié)構(gòu)為賴氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-賴氨酸。
2.權(quán)利要求I所述的改造體的化學(xué)合成方法，其特征在于，根據(jù)二者的氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列；通過HPLC反相柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于95% ；用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F-MS)測定其分子量。
3.權(quán)利要求I所述的改造體的應(yīng)用，其特征在于，改造體OA-OTVC和OA-OTC具有DPPH自由基清除活性和ABTS*+自由基正離子清除活性，用于制備抗氧化藥物、食品添加剤、化妝品。
全文摘要
滇南臭蛙天然抗氧化肽的改造體及其制備方法及應(yīng)用，改造體包括兩種OA-OTVC和OA-OTC，均是直鏈小肽，分別含有16、14個氨基酸殘基，分子量為1688.06 Da、1489.79Da ，等電點(diǎn)為9.85、9.62。多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為OA-OTVC纈氨酸-纈氨酸-賴氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-賴氨酸；OA-OTC賴氨酸-半胱氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-半胱氨酸-賴氨酸。該改造體抗氧化活性好，分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，可以用于制備抗氧化藥物、食品添加劑、化妝品等。
文檔編號A61K8/64GK102952177SQ20121046018
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月15日
發(fā)明者于海寧, 王義鵬, 廣慧娟 申請人:大連理工大學(xué)