專利名稱：一種長(zhǎng)棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多糖的制備方法，尤其涉及一種長(zhǎng)棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法。
背景技術(shù)：
多糖是天然產(chǎn)物中存在的除蛋白質(zhì)、核酸之外的又一生物活性大分子，作為信息分子決定一些細(xì)胞和分子的表型和抗原性結(jié)構(gòu)，控制細(xì)胞分裂或分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和衰老，是一種無細(xì)胞毒的免疫促進(jìn)劑。動(dòng)物體一系列生理和病理過程與糖鏈參與細(xì)胞間的識(shí)別有直接關(guān)系。一個(gè)血紅細(xì)胞表面就有50萬個(gè)糖蛋白分子，而人體內(nèi)免疫球蛋白IgG糖鏈上單糖組成及糖形的稍微改變就會(huì)引發(fā)某一疾病，如當(dāng)糖鏈中半乳糖低于正常人時(shí)就會(huì)產(chǎn)生類風(fēng)濕病。因此，近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)天然產(chǎn)物多糖的研究十分重視。天然多糖因其獨(dú)特的功能和很低的毒性，已在抗腫瘤藥、治療艾滋病等抗病毒藥、延緩衰老藥等幾個(gè)方·面得到開發(fā)和利用。在棗多糖的藥理活性研究方面，Yamada等的研究表明從棗中分離純化得到的多糖具有免疫活性；友田正司的研究表明日本大棗多糖具有抗腫瘤的藥理活性；ZhihuiZhao等的研究表明，棗果中的I種中性多糖及4種酸性多糖表現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性。國(guó)內(nèi)許多研究表明，棗多糖可增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活性；能促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖；并具有清除體內(nèi)氧自由基，抗衰老的作用，并且參與了細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。關(guān)于棗多糖提取的專利報(bào)道近年來主要有申琳和生吉萍“利用紅棗制取棗多糖的方法及棗多糖”(申請(qǐng)?zhí)朇N201010606048. 9)，李進(jìn)偉和范柳萍“一種金絲小棗酸性多糖提取及結(jié)構(gòu)表征”(申請(qǐng)?zhí)朇N201010580105. 0)，劉東鋒、郭琴及楊成東“一種拐棗多糖的制備方法”(申請(qǐng)?zhí)朇N201010558105. 0)，劉玉林、孫曙光及王中山“棗多糖精制方法”(申請(qǐng)?zhí)朇N201010102224. 5)，王青寧、趙秋萍、呂興連、張飛龍、李瀾及王正民“沙棗多糖的提取方法”(申請(qǐng)?zhí)朇N200910021709. 9)，趙玉英“廣棗多糖及其制取工藝”(申請(qǐng)?zhí)朇N200710117623. 7)，劉金福、張平平及李托平“冬棗多糖的提取方法”(申請(qǐng)?zhí)朇N200610014444. 6)。這些專利報(bào)道極大地豐富了長(zhǎng)棗多糖提取純化手段，但并沒有針對(duì)長(zhǎng)棗這一寧夏特有的優(yōu)勢(shì)品種進(jìn)行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種長(zhǎng)棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，其工藝步驟是一種長(zhǎng)棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法，以寧夏產(chǎn)靈武長(zhǎng)棗為原料，其工藝過程包括粉碎過篩、水浴浸提、脫色、分離純化、冷凍干燥，其分離純化過程為I)制備DEAE-52纖維素填充柱DEAE_52纖維素分別用0. 5 lmol/L的氫氧化鈉溶液、超純水、0. 5 lmol/L鹽酸溶液進(jìn)行堿洗一酸洗一堿洗一超純水洗處理，裝入填充柱；
2)將經(jīng)脫色和透析后的提取液通過裝有纖維素的填充柱，分別用雙蒸水和0. I
0.5mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，每管流速為3 4min，每管收集5ml，用分光度計(jì)測(cè)定其吸光度至無糖流出，按出峰情況收集組分；3)透析袋透析除鹽，濃縮后醇沉，離心凍干；4)過DEAE-52凝膠柱進(jìn)行純化，得到分級(jí)純化的長(zhǎng)棗單一組分多糖(LJU-0，LJU-I，LJU-2, LJU-3, LJU-4, LJU-5)；上述粉碎過篩是在高速粉碎機(jī)上進(jìn)行，將原料經(jīng)50 60°C干燥，晾涼后，運(yùn)用高速粉碎機(jī)將原料粉碎，將粉碎好的原料過80目篩，篩上部分返回重復(fù)粉碎、過篩；上述水浴浸提的溫度是80 100°C ；上述冷凍干燥是將分離出的多糖液體在真空濃縮機(jī)中濃縮至原體積的1/3左右，·再進(jìn)行真空冷凍干燥；上述脫色是將提取液反復(fù)經(jīng)過活性炭粉末砂芯柱進(jìn)行脫色，至液體顏色不再發(fā)生改變。再加無水乙醇沉出后凍干待用。本發(fā)明的特色在于長(zhǎng)棗多糖提取工藝中達(dá)到提高提取率、縮短提取時(shí)間、減少能耗、有效保存長(zhǎng)棗多糖生物活性等目的，并且純化得到一個(gè)單一組分多糖(LJU-3)，本發(fā)明彌補(bǔ)了長(zhǎng)棗多糖的含量及抗腫瘤活性不清的不足。應(yīng)用本發(fā)明獲得的產(chǎn)品進(jìn)行了抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)癌細(xì)胞的接種量為180 ii L/孔，恒溫培養(yǎng)約24小時(shí)后吸凈微孔中培養(yǎng)液并添加含不同濃度的待測(cè)化合物培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加20 u L5-氟尿嘧啶使其終濃度為100mg/L，陰性對(duì)照加入20 ii L RPMI1640完全培養(yǎng)液，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)。然后加入20 y L MTT (5mg/Ml)至每個(gè)微孔中，在37°C培養(yǎng)4小時(shí)。傾凈微孔中所有的液體，空氣自然干燥，每孔加入200 ii L酸性異戊醇(200 u L異戊醇加入0. 05MHC1)，于平板震蕩器上震蕩30min，490nm酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)每處理重復(fù)六次，結(jié)果為六組數(shù)據(jù)的平均值。在本發(fā)明中，對(duì)長(zhǎng)棗多糖抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(I)對(duì)LJU-3來講，在細(xì)胞培養(yǎng)液中，LJU-3以198 400mg/L的水平能顯著抑制人肝癌細(xì)胞株Bel7402，178 400mg/L能顯著抑制人胃癌細(xì)胞株BGC823、167 400mg/L能顯著抑制人鼻咽癌細(xì)胞株KB。(2)在 5O 400mg/L 范圍內(nèi)，LJU-0、LJU-U LJU-2, LJU-4 及 LJU-5 對(duì) Bel7402、BGC823及KB三種腫瘤細(xì)胞的抑制率均小于50%，說明它們對(duì)這三種腫瘤不敏感。結(jié)果表明，長(zhǎng)棗多糖能抑制癌細(xì)胞在體外的增殖，增殖的抑制率意味著對(duì)癌癥的抑制，實(shí)驗(yàn)證明長(zhǎng)棗多糖能顯著抑制人肝癌細(xì)胞株Bel7402，人胃癌細(xì)胞株BGC823及人鼻咽癌細(xì)胞株KB，這就是說長(zhǎng)棗多糖具有抗癌活性。本發(fā)明的技術(shù)效果是克服長(zhǎng)棗多糖抗腫瘤活性不清的不足，以提高長(zhǎng)棗得率，有效保存長(zhǎng)棗多糖生物活性。
具體實(shí)施例方式選取干燥的寧夏靈武長(zhǎng)棗，將原料經(jīng)50 60°C干燥，晾涼后，運(yùn)用高速粉碎機(jī)將原料粉碎，將粉碎好的原料過80目篩，將篩子上部的渣子重新放入粉碎機(jī)中重新粉碎。將一定質(zhì)量的棗粉樣品以固液比I :4在80 100°C水浴浸提2小時(shí)左右。離心過濾后，將濾渣重新進(jìn)行水浴浸提，反復(fù)進(jìn)行3次。將得到的清液反復(fù)經(jīng)過活性炭粉末砂芯柱進(jìn)行脫色，至液體顏色不再發(fā)生改變。加無水乙醇沉出后凍干待用。將DEAE-52纖維素分別用0. 5 lmol/L的氫氧化鈉溶液、超純水、0. 5 lmol/L鹽酸溶液進(jìn)行堿洗一酸洗一堿洗一超純水洗處理。將脫色和透析過的多糖液通過裝有纖維素的填充柱，透析所用的膜為纖維素半透膜，利用反滲透理論，將水和小分子去出；分別用雙蒸水和0. I 0. 5mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為I管/7分鐘，每管收集10ml，用分光度計(jì)測(cè)定其吸光度至無糖流出，按出峰情況收集組分。透析袋透析除鹽，濃縮后醇 沉，離心凍干。最后過DEAE-52凝膠柱進(jìn)行純化，得到分級(jí)純化的長(zhǎng)棗單一組分多糖。將分離出的多糖樣品在真空濃縮機(jī)中進(jìn)行濃縮至原體積的1/3左右，將濃縮好的糖液進(jìn)行真空冷凍干燥。
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法，以寧夏產(chǎn)靈武長(zhǎng)棗為原料，其工藝過程包括粉碎過篩、水浴浸提、脫色、分離純化、冷凍干燥，其特征在于分離純化過程為 1)制備將DEAE-52纖維素填充柱DEAE-52纖維素分別用0.5 lmol/L的氫氧化鈉溶液、超純水、0. 5 lmol/L鹽酸溶液進(jìn)行堿洗一酸洗一堿洗一超純水洗處理，裝入填充柱； 2)將經(jīng)脫色和透析后的提取液通過裝有纖維素的填充柱，分別用雙蒸水和0.I 0.5mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，每管流速為3 4min，每管收集5ml，用分光度計(jì)測(cè)定其吸光度至無糖流出，按出峰情況收集組分； 3)透析袋透析除鹽，濃縮后醇沉，離心凍干； 4)過DEAE-52凝膠柱進(jìn)行純化，得到分級(jí)純化的長(zhǎng)棗單一組分多糖(LJU-0，LJU-I,LJU-2, LJU-3, LJU-4, LJU-5)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于上述粉碎過篩是在高速粉碎機(jī)上進(jìn)行，將原料經(jīng)50 60°C干燥，晾涼后，運(yùn)用高速粉碎機(jī)將原料粉碎，將粉碎好的原料過80目篩，篩上部分返回重復(fù)粉碎、過篩。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于上述水浴浸提的溫度是80 100°C。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于上述冷凍干燥是將分離出的多糖液體在真空濃縮機(jī)中濃縮至原體積的1/3左右，再進(jìn)行真空冷凍干燥。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于上述脫色是將提取液反復(fù)經(jīng)過活性炭粉末砂芯柱進(jìn)行脫色，至液體顏色不再發(fā)生改變，再加無水乙醇沉出后凍干待用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)棗抗腫瘤活性多糖的分離純化制備方法，以寧夏產(chǎn)靈武長(zhǎng)棗為原料，其分離純化過程為1)制備將DEAE-52纖維素填充柱DEAE-52纖維素分別用0.5～1mol/L的氫氧化鈉溶液、超純水、0.5～1mol/L鹽酸溶液進(jìn)行堿洗—酸洗—堿洗—超純水洗處理，裝入填充柱；2)將經(jīng)脫色和透析后的提取液通過裝有纖維素的填充柱，分別用雙蒸水和0.1～0.5mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，每管流速為3～4min，每管收集5ml，用分光度計(jì)測(cè)定其吸光度至無糖流出，按出峰情況收集組分；3)透析袋透析除鹽，濃縮后醇沉，離心凍干；4)過DEAE-52凝膠柱進(jìn)行純化，得到分級(jí)純化的長(zhǎng)棗單一組分多糖(LJU-0，LJU-1，LJU-2，LJU-3，LJU-4，LJU-5)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102786603SQ20121024447
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者劉曉連, 盧君逸, 李亞蕾, 李文霞, 李海峰, 楊波, 柳楊, 章中, 羅瑞明 申請(qǐng)人:寧夏大學(xué)