專利名稱：A型肉毒結(jié)晶毒素的生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)該毒素所需的凍干保護(hù)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物毒素，所得制品屬新的生物制品，用于神經(jīng)科、眼科等領(lǐng)域的肌張力障礙性疾病，如眼瞼痙攣、面肌痙攣、斜視及痙攣性斜頸等的治療。
A型肉毒毒素系A(chǔ)型肉毒梭菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的一種毒力極強(qiáng)的神經(jīng)毒素，它能作用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢神經(jīng)肌肉接點(diǎn)，抑制突觸前膜釋放乙酰膽堿，從而引起肌肉松馳性麻痹。這種獨(dú)特的藥理作用，80年代初被美國(guó)學(xué)者列入臨床，對(duì)斜視、眼瞼痙攣、面肌痙攣及痙攣性斜頸等疾病進(jìn)行試驗(yàn)性治療，并取得滿意的療效。1989年12月，美國(guó)FOA正式批準(zhǔn)A型肉毒毒素(商品名Oculinum)作為新藥投產(chǎn)上市。1989年2月，我所研制的“注射用肉毒毒素”被批準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，1993年10月由衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新藥，1997年2月正式轉(zhuǎn)為準(zhǔn)字號(hào)[(97)衛(wèi)藥準(zhǔn)字(蘭IS-01號(hào)]投產(chǎn)。
目前美國(guó)采用肉毒梭菌全培養(yǎng)酸沉淀--毒素磷酸鹽緩沖液提取--低溫乙醇沉淀--硫酸銨濃縮及自然結(jié)晶等程序制備A型肉毒結(jié)晶毒素。以此種方法生產(chǎn)的A型肉毒毒素純度、質(zhì)量均較高，但在工藝、消耗、安全、穩(wěn)定性方面存在一定的問(wèn)題和局限性，列舉如下1、產(chǎn)毒培養(yǎng)基成分N-2 Amine(Sheffied).Yeast extract(Oifco)等均系專一廠家生產(chǎn)的干粉成品，價(jià)格昂貴。
2、以菌體全培養(yǎng)提純毒素，易造成實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和設(shè)施的芽胞(屬二類細(xì)菌)污染，存在嚴(yán)重的危險(xiǎn)和危害。
3、提純A型肉毒毒素的步驟之一，低溫乙醇沉淀，需特定的低溫廠房和設(shè)施。另外該工藝的純毒素收獲率較低，僅為17％。
4、產(chǎn)品以人血白蛋白作保護(hù)液冷凍干燥毒素，存在血源污染的危險(xiǎn)，凍干過(guò)程中毒素力(即單位)損失高達(dá)50-90％；凍干成品的穩(wěn)定性差，有效期短。
5、產(chǎn)品價(jià)格昂貴(100單位/支的成品、售價(jià)275美元)。
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述背景技術(shù)的不足及存在的問(wèn)題和局限性，結(jié)合自身的現(xiàn)有條件，設(shè)計(jì)并建立一種簡(jiǎn)單、方便易行、安全、保質(zhì)、保量的A型肉毒結(jié)晶毒素的提純方法、程序和生產(chǎn)工藝。并優(yōu)選一種用于A型肉毒結(jié)晶毒素稀釋、凍干的凍干保護(hù)液，以避免和克服人血白蛋白作稀釋、凍干保護(hù)液所致的危險(xiǎn)性。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的具體技術(shù)方案如下(1)、產(chǎn)毒培養(yǎng)基成份酪蛋白胰酶消化液50％酵母透析液 20％蒸餾水 30％葡萄糖A、R 1％其中酪蛋白胰酶消化液成份酪蛋白C、P 100g蒸餾水 1000ml胰酶粉(活力單位1100以上16.8活力單位/lg酪蛋白；(2)、產(chǎn)毒培養(yǎng)基形成a、將酪蛋白胰酶消化液與蒸餾水混合，加熱50-60℃，用20％氫氧化鈉溶液調(diào)正PH7.0，煮開后加入酵母透析液，再煮10分鐘，用20％氫氧化鈉再調(diào)PH至7.4；b、煮沸、濾紙過(guò)濾、分裝立瓶，于113℃30分鐘滅菌備用；c、另配56％葡萄糖溶液于113℃30分鐘滅菌，接種時(shí)用。
(3)、產(chǎn)毒培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)適應(yīng)培養(yǎng)后的A型肉毒梭菌(haLL株)菌種，接種于18.000-36.000ml的產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)5天。
(4)、除菌過(guò)濾經(jīng)鏡檢為純培養(yǎng)后，用無(wú)石棉除菌板或除菌濾膜過(guò)濾，得原毒素液，用小白鼠測(cè)定毒力，毒力應(yīng)在106LO50/ml左右。
(5)、毒素的精制提純
a、酸沉淀原毒素液加六偏磷酸鈉，使最終濃度達(dá)0.2％，用3當(dāng)量鹽酸調(diào)PH至3.5左右，2-8℃過(guò)夜；b、毒素提取棄上清，沉淀用蒸餾水洗1次，加適量PH6.0、0.2N磷酸鹽緩沖液，分2次溶解、提取，每次置室溫1小時(shí)，離心后分別取上清液合并之；c、酶處理及濃縮提取液按100ug/ml加入核糖核酸酶，35℃溫育3小時(shí)，加硫酸銨至60％飽和，2-8℃過(guò)夜，離心，沉淀用適量PH5.5、0.05N檸檬酸緩沖液溶解后，透析；d、層析透析液經(jīng)OEAE-A50離子交換層析，收集、合并OD260/OD280為0.5-0.6的過(guò)柱液；e、結(jié)晶合并液加硫酸銨至60％飽和，2-8℃過(guò)夜。離心，沉淀用適量PH6.8、0.05H磷酸鹽緩沖液溶解，再在含0.9H硫酸銨的上述緩沖液中透析，自然形成結(jié)晶。亦可重復(fù)上述過(guò)程，以形成第二次結(jié)晶；(6)、毒素的稀釋、凍干(1)、稀釋a、用磷酸鹽緩沖液溶解及透析結(jié)晶毒素，除菌過(guò)濾后測(cè)定毒力；b、用磷酸鹽緩沖液將已知毒力的毒素溶液稀釋至適當(dāng)濃度(105-106LO50/ml)；c、將適量的稀釋毒素加入到定量的凍干保護(hù)液中，使每毫升凍干保護(hù)液中毒素含量在效價(jià)要求的范圍(50-100LO50/ml)；(2)、分裝、凍干每安瓶定量分裝上述含凍干保護(hù)液的毒素稀釋液1毫升，以蛋白質(zhì)制品的凍干曲線對(duì)其進(jìn)行凍干。凍干成品應(yīng)無(wú)菌、水分含量不超過(guò)3％。
上述A型肉毒結(jié)晶毒素生產(chǎn)過(guò)程中所需的凍干保護(hù)液其成份明膠1％右旋糖酐5％蔗糖5％蒸餾水加至100ml配制方法
(1)、按配制量稱取明膠，加熱溶化后高壓(121℃)滅菌30分鐘；(2)、按比例加入右旋糖酐及蔗糖，待全部溶化后，濾球過(guò)濾，8P(113℃)消毒30分鐘，待用。
本發(fā)明的有益效果1、毒素收獲率由背景技術(shù)中的17％提高到33％，從而有效地降低了成本，保持了成品的低價(jià)，適合國(guó)情和消費(fèi)水平。
2、質(zhì)量好對(duì)比項(xiàng)目 美國(guó) 本發(fā)明所得制品形態(tài) 單一針狀結(jié)晶單一針、棒狀結(jié)晶純度 3.0×107LO50(±20％).mgpr2.5-3.0×107LO50/mgpr※OD260/OD280＜0.6 ≤0.55※此數(shù)越低毒素越純3、凍干保護(hù)液的應(yīng)用，使凍干過(guò)程中毒力損失降低至0-26％，并延長(zhǎng)了制品的有效期(本發(fā)明制品為3年，美國(guó)為2年)；4、本發(fā)明要求的廠房、設(shè)施、設(shè)備較簡(jiǎn)單，毒素提純可在常溫下進(jìn)行，而且簡(jiǎn)便易行，重復(fù)性好；5、用除菌毒素進(jìn)行提純，比背景技術(shù)用菌體全培養(yǎng)提純更為安全，避免了肉毒梭菌芽胞污染環(huán)境的危險(xiǎn)；6、產(chǎn)毒培養(yǎng)可用國(guó)產(chǎn)原料、自制,既可減少進(jìn)口，節(jié)約外匯，又可因地制宜，保證供應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種A型肉毒結(jié)晶毒素的生產(chǎn)工藝，其特征在于Ⅰ、產(chǎn)毒培養(yǎng)基成份酪蛋白胰酶消化液50％酵母透析液 20％蒸餾水 30％葡萄糖 A、R 1％其中酪蛋白胰酶消化液成份酪蛋白 C、P 100g蒸餾水 1000ml胰酶粉(活力單位1∶100以上)8.8活力單位/1g酪蛋白Ⅱ、產(chǎn)毒培養(yǎng)基形成(1)、將酪蛋白胰酶消化液與蒸餾水混合，加熱50-60℃，用20％氫氧化鈉溶液調(diào)正PH7.0，煮開后加入酵母透析液，再煮10分鐘，用20％氫氧化鈉再調(diào)PH至7.4；(2)、煮沸，濾紙過(guò)濾，分裝立瓶，于113℃30分鐘滅菌備用；(3)、另配50％葡萄糖溶液于113℃30分鐘滅菌，接種時(shí)用；Ⅲ、產(chǎn)毒培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)適應(yīng)培養(yǎng)后的A型肉毒梭菌(Hall株)菌種，接種于18.000-36.000ml的產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)5天；Ⅳ、除菌過(guò)濾經(jīng)鏡檢為純培養(yǎng)后。用無(wú)石棉除菌板或除菌濾膜過(guò)濾，得原毒素液，用小白鼠測(cè)定毒力，毒力應(yīng)在106LO50/ml左右；Ⅴ、毒素的精制提純(1)、酸沉淀原毒素液加六偏磷酸鈉，使最終濃度達(dá)0.2％，用3當(dāng)量鹽酸調(diào)PH至3.5左右，2-8℃過(guò)夜；(2)、毒素提取棄上清，沉淀用蒸餾水洗1次，加適量PH6.0、0.2H磷酸鹽緩沖液，分兩次溶解、提取，每次置室溫1小時(shí)，離心后分別取上清液合并之；(3)、酶處理及濃縮提取液按100ug/ml加入核糖核酸酶，35℃溫育3小時(shí)，加硫酸銨至60％飽和，2-8℃過(guò)夜，離心，沉淀用適量PH5.5、0.05H檸檬酸緩沖液溶解后，透析；(4)、層析透析液經(jīng)DEAE-A50離子交換層析，收集、合并OD260～OD280為0.5-0.6的過(guò)柱液；(5)、結(jié)晶合并液加硫酸銨至60％飽和，2-8℃過(guò)夜，離心，沉淀用適量PH6.8、0.05H磷酸鹽緩沖液溶解，再在含0.9H硫酸銨的上述緩沖液中透析，自然形成結(jié)晶，亦可重復(fù)上述過(guò)程，以形成第二次結(jié)晶；Ⅵ、毒素的稀釋、凍干(1)、稀釋a、用磷酸鹽緩沖液溶解及透析結(jié)晶毒素，除菌過(guò)濾后測(cè)定毒力；b、用磷酸鹽緩沖液將已知毒力的毒素溶液稀釋至適當(dāng)濃度(105-106LO50/ml)；c、將適量的稀釋毒素加入到定量的凍干保護(hù)液中，使每毫升凍干保護(hù)液中毒素含量在效價(jià)要求的范圍(50-100LO50/ml)；(2)、分裝、凍干每安瓶定量分裝上述含凍干保護(hù)液的毒素稀釋液1毫升，以蛋白質(zhì)制品的凍干曲線對(duì)其進(jìn)行凍干，凍干成品應(yīng)無(wú)菌、水份含量不超過(guò)3％。
2.一種生產(chǎn)A型肉毒結(jié)晶毒素所需的凍干保護(hù)液，其特征在于(1)、成分明膠1％右旋糖酐5％蔗糖5％蒸餾水加至100ml(2)、配制方法a、按配制量稱取明膠，加熱溶化后高壓(121℃)滅菌30分鐘；b、按比例加入右旋糖酐及蔗糖，待全部溶化后，濾球過(guò)濾，8P(113℃)消毒30分鐘，待用。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物毒素,所得制品屬新的生物制品,主要用于神經(jīng)科、眼科等領(lǐng)域的肌張力障礙性疾病如:眼瞼痙攣、面肌痙攣、斜視及痙攣性斜頸等的治療。其工藝為:產(chǎn)毒培養(yǎng)基－產(chǎn)毒培養(yǎng)－除菌過(guò)濾－毒素的精制提純－毒素的稀釋、凍干。利用本發(fā)明制取的制品具有毒素收獲率高、質(zhì)量好、有效期長(zhǎng)、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K9/19GK1215084SQ97118838
公開日1999年4月28日 申請(qǐng)日期1997年10月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月18日
發(fā)明者王蔭椿 申請(qǐng)人:衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所