專利名稱：基于樹狀大分子的ct/mri雙模態(tài)成像造影劑的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于CT/MRI雙成像造影劑的制備領(lǐng)域，特別涉及一種基于樹狀大分子的 CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法。
背景技術(shù)：
由于CT、MRI成像在醫(yī)學(xué)成像上各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，臨床上為了提高疾病早期診斷的靈敏度和準(zhǔn)確度，常常將兩者有機(jī)地結(jié)合，使當(dāng)前影像學(xué)檢查既擴(kuò)大了檢查的范圍，又提高了診斷水平。而將CT和MRI以互補(bǔ)形式作為醫(yī)療成像檢測手段，通常需要CT和MRI兩種成像造影劑。雖然多種CT或MRI成像造影劑各自能夠獲較好的造影效果，但是若采用兩種造影劑，一方面給臨床應(yīng)用造成了不便，另一方面也會(huì)增加造影劑對患者的毒副作用。因此，可以想象，一種多功能的造影劑系統(tǒng)，能夠完成多模態(tài)成像造影診斷，將會(huì)大大提高診斷的靈敏度與準(zhǔn)確度，而且會(huì)減輕對患者的因多次注射造成的痛苦和毒副作用，在臨床應(yīng)用中將具有極大的價(jià)值，可以提供更全面的診斷信息和疾病發(fā)展的動(dòng)態(tài)過程。雖然目前只有少數(shù)CT/MRI雙成像造影劑研制成功，如Alric等(C. Alric ； J. Taleb ；G. Le Duc ；et al. J. Am. Chem. Soc. 2008，130，5908-5915.)以 DTDTPA 穩(wěn)定納米金顆粒，再螯合Gd3+，取得了很好的雙模態(tài)成像造影效果。但其制備方法較為復(fù)雜，造影劑用量較高，血液循環(huán)時(shí)間較短，因而限制了其臨床應(yīng)用?？梢钥隙ǖ氖?，隨著CT和MRI以互補(bǔ)形式作為醫(yī)療成像檢測手段在臨床上的廣泛應(yīng)用，CT/MRI雙模態(tài)造影劑將成為醫(yī)學(xué)成像研究的熱點(diǎn)。聚酰胺胺(polyfemidoamine)，PAMAM)樹狀大分子是通過支化單元逐步重復(fù)反應(yīng)得到的具有樹狀高度支化結(jié)構(gòu)的大分子。它具有高度支化、高度單分散性，擁有可控的、規(guī)則的結(jié)構(gòu)和組成。它不僅由于表面擁有眾多的功能基團(tuán)而具有獨(dú)特的表面物理、化學(xué)性質(zhì)， 而且具有獨(dú)特的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)。表面大量的官能基團(tuán)，可以通過共價(jià)鍵對其進(jìn)行修飾與功能化，也可以通過靜電作用等作用力等穩(wěn)定或鰲合金屬離子，形成復(fù)合材料。另外其內(nèi)部的空腔結(jié)構(gòu)還可以包裹目標(biāo)分子，有選擇性地結(jié)合客體分子，十分適合于作為金屬納米顆粒的載體。例如 Shi X. Y.等(Shi, X. Y. ；Wang，S. H. ；Meshinchi, S. ；et al. Small 2007,3, 1245.)利用端基為氨基的第五代PAMAM樹狀大分子為模板原位還原制備了，金納米顆粒， 并在包裹納米金的樹狀大分子外圍修飾靶向分子、染料等，制備得到的金納米顆粒(平均直徑為3. 2nm)具有良好的生物相容性，可對癌癥細(xì)胞進(jìn)行有效地靶向和成像。檢索國內(nèi)外有關(guān)CT/MRI雙模態(tài)造影劑方面的文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明目前，還沒有發(fā)現(xiàn)基于樹狀大分子的包裹金納米粒子螯合釓的CT/MRI造影劑的制備與應(yīng)用方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，該方法制備過程簡單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，該雙模態(tài)成像造
3影劑具有良好的CT/MRI成像效果，為新型多功能造影劑的開發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明的一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，包括(1)在第五代聚酰胺-胺樹狀大分子(購于Dendritech公司)的DMSO溶液中，加入DOTA-NHS的DMSO溶液，反應(yīng)12_30h ；再加入EDC活化后的mPEG_C00H(購于上海炎翌生物科技有限公司)的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)2-4d，得到功能化樹狀大分子溶液；(2)在上述功能化樹狀大分子溶液中加入氯金酸溶液攪拌20-40min，再加入硼氫化鈉溶液還原納米金顆粒，攪拌反應(yīng)l_4h ；然后加入硝酸釓溶液攪拌2-15h，將釓離子螯合進(jìn)接枝在樹狀大分子上的DOTA內(nèi)，再加入三乙胺攪拌20-40min，最后加入乙酸酐，將樹狀大分子表面剩余的氨基乙?；?，攪拌反應(yīng)8-24h ；(3)將步驟( 所得的溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥處理，即得螯合釓包裹金納米粒子的功能化樹狀大分子{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs。所述步驟(1)中第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液的濃度為0. 0500-0. 500mmol/ L,其溶劑為DMSO ；DOTA-NHS溶液的濃度為2. 50-4. 485mmol/L,其溶劑為DMSO ；DOTA-NHS與樹狀大分子的摩爾比為5-20 1。所述步驟(1)中的DOTA-NHS購于CheMatech公司，其英文名稱是2， 2 ‘ ，2 〃 -(10-(2-(2,5-dioxopyrrolidin-l-yloxy)-2-oxoethyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecane-l,4,7-triyl)triacetic acid(2,2' ,2〃 -(10-(2_(2, 5_ 二氧代吡咯烷-1-氧基)-2-氧乙基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三)三乙酸)所述步驟⑴中EDC活化后的mPEG-COOH的DMSO溶液的制備方法為在 mPEG-COOH的DMSO溶液中加入EDC的DMSO溶液，然后攪拌2_4h ；其中mPEG-COOH的DMSO 溶液的濃度為8. 55mg/mL, EDC的DMSO溶液的濃度為17. 2mg/mL, mPEG-COOH與EDC的體積比為2 1。所述步驟(1)中EDC、mPEG-COOH和樹狀大分子摩爾比為20-300 5-20 1。所述步驟⑵中氯金酸溶液的溶劑為DMSO和水，其中DMSO和水的體積比為 1-3 1。所述步驟(2)中HAuCl4 · 4H20和樹狀大分子的摩爾比為50-250 1，NaBH4與 HAuCl4 · 4H20 的摩爾比為 2-5 1。所述步驟(2)中Gd(NO3)3 · 6H20 和 DOTA 的摩爾比為 1-5 1 ；N (C2H5) 3、Ac2O 和樹狀大分子的摩爾比為120-660 100-550 1。所述步驟O)中的硼氫化鈉溶液的溶劑為水和甲醇，其中水與甲醇的體積比為 2 I0所述步驟(3)中的透析為用纖維素透析膜(MWC0 = 14000)在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3天。本發(fā)明中將釓螯合劑DOTA-NHS接枝到末端為氨基的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子表面，DOTA-NHS采用在快速攪拌下逐滴滴加的方式加入到樹狀大分子溶液中，以保證樹狀大分子接枝DOTA的均一性。 本發(fā)明中使用1-20倍量EDC活化mPEG-COOH的羧基，增強(qiáng)與樹狀大分子反應(yīng)的活性，活化的mPEG-COOH也采用逐滴滴加的方式加入到樹狀大分子溶液中，以保證樹狀大分子接枝PEG的均一性。同時(shí)PEG的加入可以增加該材料的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，并增加后續(xù)包裹納米金的量，達(dá)到更加靈敏的CT造影效果。本發(fā)明中氯金酸溶液加入后，攪拌20-40min，使氯金酸分子與樹狀大分子充分混合，利用AuC14_與樹狀大分子氨基的親和力使得其進(jìn)入樹狀大分子內(nèi)部空腔，再以強(qiáng)還原劑NaBH4還原，得到樹狀大分子包裹的金納米顆粒，很好地防止了金納米顆粒的聚集。 HAuCl4 ·4Η20 NaBH4 樹狀大分子摩爾比為 50-250 100-1250 1 (NaBH4 與 HAuCl4 ·4Η20 的摩爾比彡2 1)，既保證納米金的膠體穩(wěn)定性，又有效提高納米金的含量。本發(fā)明中以乙?；瘶錉畲蠓肿颖砻媸Ｓ嗟陌被越档推浔砻骐妱荩岣卟牧系纳锵嗳菪?。以三乙胺保持溶液的堿性環(huán)境保證乙酰化反應(yīng)的順利進(jìn)行。本發(fā)明中( 中的透析過程采用纖維素透析膜MWCO = 14000 ；磷酸鹽緩沖液，蒸餾水。使用UV-Vis (紫外可見光譜)、TEM(透射電子顯微鏡)、CT成像及MRI成像表征本發(fā)明獲得的具有雙模態(tài)造影功能的樹狀大分子的結(jié)果分別如下(I)UV-Vis 測試結(jié)果UV-Vis測試結(jié)果表明本發(fā)明中制備得到的CT/MRI雙模態(tài)造影劑顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰位于528nm，參見說明書附圖2。這表明本發(fā)明中制備得到了金納米顆粒。O) TEM測試結(jié)果TEM測試結(jié)果顯示了金納米顆粒的尺寸及尺寸分布，參見說明書附圖3。金納米顆粒平均直徑約4. 55nm，尺寸分布較窄，具有良好的分散性。(3) CT成像測試結(jié)果CT成像測試結(jié)果表明制備的材料的X-射線衰減強(qiáng)度隨金濃度的提高呈線性上升趨勢，表現(xiàn)出良好的X-射線衰減特性，參見說明書附圖4。(4) MRI測試結(jié)果MRI測試結(jié)果表明隨著釓(III)濃度的提高，所制備的材料具有較大的^弛豫率。 參見說明書附圖5。(5)大鼠活體腎和膀胱CT成像800 μ L {(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs ([Au] = 0. 1164mol/L)尾部靜脈注射進(jìn)體重為210g的大鼠體內(nèi)，通過CT掃描檢測得到的圖片(附圖6，附圖7)，從圖中能夠清楚地看到大鼠的膀胱和腎，證明本方法合成的{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG2 0-Ac}DENPs具有較好的CT成像效果。(6)小鼠活體腎和膀胱MR成像將100 μ L {(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs ([Gd] = 12. 42mmol/L)尾部靜脈注射進(jìn)體重為15g的小鼠體內(nèi)，通過MR掃描檢測得到的圖片(附圖8，附圖9)，從圖中能夠清楚地看到小鼠的膀胱和腎，證明本方法合成的{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs具有較好的MR成像效果。本發(fā)明方法制備的螯合釓包裹金納米粒子的功能化樹狀大分子材料，其金納米顆粒尺寸分布較窄，具有良好的分散性。X-射線衰減強(qiáng)度測試結(jié)果表明，金納米顆粒的X-射線衰減強(qiáng)度信號(hào)較好，體內(nèi)試驗(yàn)也表明其具有良好的CT成像性能。磁共振成像測試結(jié)果表明，螯合的釓離子可以顯著地縮短T1弛豫時(shí)間，顯示信號(hào)增強(qiáng)，體內(nèi)試驗(yàn)也表明其良好的MR成像性能。以表面具有大量氨基，內(nèi)部具有大量空腔和結(jié)構(gòu)精確可控的聚酰胺-胺樹狀大分子為模板和穩(wěn)定劑，制備了功能化的基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑，本發(fā)明涉及了四個(gè)基本原理(1)充分利用聚酰胺-胺樹狀大分子的表面大量的可修飾化氨基，接枝釓螯合劑 DOTA和mPEG，既修飾了 MRI造影劑釓(III)螯合劑D0TA，又提高了該造影劑的血液循環(huán)時(shí)間和生物相容性。(2)充分利用聚酰胺-胺樹狀大分子的內(nèi)部空腔包裹穩(wěn)定納米金顆粒。在還原前， 其內(nèi)部空腔可以對々11(14_進(jìn)行絡(luò)合；還原后，可以起到防止金納米顆粒團(tuán)聚的作用。采用強(qiáng)還原劑NaBH4對金屬離子進(jìn)行快速還原，在樹狀大分子內(nèi)部空腔的約束下，產(chǎn)生穩(wěn)定的金納米顆粒。(3)金納米顆粒對X-射線有良好的衰減能力。X-射線衰減強(qiáng)度測試結(jié)果表明，該材料有較高的X-射線衰減強(qiáng)度及更好的成像對比度。說明樹狀大分子包裹金納米顆粒的造影劑可以作為一種充滿希望的CT造影劑。且小鼠活體CT成像測試表明，其具有良好的 CT成像效果。(4)釓(III)對MR成像有很好的造影效果。MR測試結(jié)果表明，該材料有較高的巧弛豫率及更好的成像對比度。說明樹狀大分子-釓磁共振成像造影劑可以作為一種充滿希望的T1造影劑。且小鼠活體MR成像測試表明，其具有良好的MR成像效果，是一種優(yōu)良的 T1造影劑。制備CT/MRI雙模態(tài)造影劑的關(guān)鍵要素就是找到一個(gè)合適的載體平臺(tái)以負(fù)載不同的造影元素，形成多功能造影劑復(fù)合體。聚酰胺胺(p0ly(amid0amine)，PAMAM)樹狀大分子是通過支化單元逐步重復(fù)反應(yīng)得到的具有樹狀高度支化結(jié)構(gòu)的大分子。它具有高度支化、 高度單分散性，擁有可控的、規(guī)則的結(jié)構(gòu)和組成。它不僅由于表面擁有眾多的功能基團(tuán)而具有獨(dú)特的表面物理、化學(xué)性質(zhì)，而且具有獨(dú)特的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)。表面大量的官能基團(tuán)，可以通過共價(jià)鍵對其進(jìn)行修飾與功能化，也可以通過靜電作用等作用力等穩(wěn)定或鰲合金屬離子，形成復(fù)合材料。所以PAMAM樹狀大分子可以有效用作一種納米平臺(tái)，修飾或裝載不同的造影元素，可以滿足多模態(tài)成像造影劑的要求。利用樹狀大分子所具備的優(yōu)異的單分散性、 表面大量官能團(tuán)的可修飾性、內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)所具有的載藥性和經(jīng)修飾后具備的良好的生物相容性，我們通過樹狀大分子對無機(jī)納米顆粒進(jìn)行修飾、組裝及生物功能化，以及各種小分子造影劑的接枝，制備出優(yōu)良的多功能分子影像學(xué)造影劑用于CT/MRI雙模態(tài)成像，應(yīng)用于疾病的早期診斷。本發(fā)明利用樹狀大分子的特定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，將釓螯合劑DOTA接枝在樹狀大分子表面以螯合釓實(shí)現(xiàn)MRI成像，然后將EDC活化的mPEG-COOH接枝在樹狀大分子表面以增加其血液循環(huán)時(shí)間，并提高生物相容性，最后在樹狀大分子內(nèi)部包裹納米金顆粒用于CT成像，并乙?；瘶錉畲蠓肿颖砻媸Ｓ喟被档捅砻嬲姾尚?，以降低其毒性，制備出優(yōu)良的 CT/MRI雙模態(tài)造影劑。有益效果(1)本發(fā)明的制備過程簡單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于制備其它功能化樹狀大分子的制備，以及MR和CT造影劑用于CT/MRI雙模態(tài)成像，具有很好的使用價(jià)值；(2)本發(fā)明所采用的制備程序可用于制備具有靶向性的MR和CT造影劑用于CT/ MRI靶向雙模態(tài)成像，具有很好的使用價(jià)值；(3)本發(fā)明制備得到的功能化的基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑具有良好的CT/MRI成像效果，為新型多功能造影劑的開發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明反應(yīng)方程式簡圖。圖2 為本發(fā)明制備的{(Au°)25Q-G5-D0TA(GdIII) 1Q-PEG2Q-AC}DENPs 的紫外吸收光譜圖。圖3 為本發(fā)明制備的{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs 的 TEM 圖片(a) 和粒徑分布直方圖(b)。圖4 為本發(fā)明制備的{ (Auci)25q-GS-DOTA (GdIII)1Q-PEG2(1-Ac} DENPs(I)和 {(Au0) 250-G5-DOTA10-PEG20-Ac} DENPs (2)的CT圖片(a)和X-射線衰減與金濃度的線性關(guān)系圖(b)。圖 5 為本發(fā)明制備的 G5-D0TA (GdIII)ici-PEG2ci-Ac(I)禾Π {(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII )10-PEG20-Ac}DENPS(2)的1\_權(quán)重自旋回波偽彩圖(a)和T1弛豫時(shí)間的倒數(shù)隨釓濃度變化的線性關(guān)系圖(b)；圖 6 為 800 μ L 的{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs ([Au] =0. 1164mol/ L)尾部靜脈注射進(jìn)大鼠體內(nèi)，通過CT掃描檢測得到的大鼠膀胱(如箭頭所示)的CT圖片， 從左至右依次為注射前5min，注射后5min，15min，30min，45min。圖 7 為 800 μ L 的{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs ([Au] =0. 1164mol/ L)尾部靜脈注射進(jìn)大鼠體內(nèi)，通過CT掃描檢測得到的大鼠腎(如箭頭所示)的CT圖片，從左至右依次為注射前5min，注射后5min，15min, 30min, 45min。圖 8 為 100 μ L 的{(Au0) 250-G5-DOTA (GdI II) 10-PEG20-Ac} DENPs ([Gd] = 12. 42mmol/ L)尾部靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，通過MR掃描檢測得到的小鼠膀胱(如箭頭所示)的MRI圖片，從左至右依次為注射前5min，注射后15min，30min，45min。圖 9 為 100 μ L 的{(Au0) 250-G5-DOTA (GdI II) 10-PEG20-Ac} DENPs ([Gd] = 12. 42mmol/ L)尾部靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，通過MR掃描檢測得到的小鼠腎(如箭頭所示)的MRI圖片， 從左至右依次為注射前5min，注射后15min，30min，45min。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1(1)用IOmL的DMSO溶解干重為22. OOmg的G5PAMAM樹狀大分子，邊攪拌邊逐滴滴加溶于4mLDMS0溶液的干重為6. 44mg的D0TA-NHS，其中DOTA-NHS 樹狀大分子摩爾比為10 1，反應(yīng)M小時(shí)。在鈿！^ mPEG-COOH的DMSO溶液(8. 55mg/mL)中，加入2mL EDC的 DMSO溶液(17. 2mg/mL)，攪拌反應(yīng)3小時(shí)后逐滴滴加到G5PAMAM樹狀大分子與DOTA-NHS的反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)72小時(shí)。(2)取步驟(1)反應(yīng)液10mL，加入IOmL DMSO和IOmL水，攪拌混勻后，加入2. 29mL HAuCl4水溶液(20mg/mL)混合，在室溫下攪拌30min，溶液變成淺黃色，隨后加入1. 236mL的 20mg/mL的NaBH4溶液(H2O CH3OH (體積比)=2 1)，溶液瞬間變成深紅色，在室溫下攪拌反應(yīng)池；(3)向步驟(2)的反應(yīng)液中加入0. 535mL Gd(NO3)3 · 6H20的水溶液(iang/mL)，攪拌反應(yīng)12小時(shí)，再加入39. 24 μ L三乙胺，攪拌反應(yīng)30min后，向反應(yīng)液中加入22. 3 μ L乙酸酐，在室溫下攪拌反應(yīng)M小時(shí)，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用纖維素透析膜(MWCO= 14000)逐次在磷酸鹽緩沖溶液4LX3和蒸餾水4LX3中透析3天，最后將純化后的產(chǎn)物冷凍干燥得到功能化的基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs。合成過程中對樹狀大分子表面修飾用核磁進(jìn)行表征，對各個(gè)峰進(jìn)行積分計(jì)算可知樹狀大分子載體表面修飾了 8. 8個(gè)DOTA分子，18個(gè)mPEG分子。對得到的產(chǎn)品{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs進(jìn)行紫外吸收表征如附圖2，納米金顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰在528nm，證明了金納米顆粒的形成，TEM圖片(附圖2)表明金納米顆粒直徑約4. 55nm,尺寸分布較窄，具有良好的分散性。進(jìn)一步以電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)測定產(chǎn)物中Au和Gd的含量，結(jié)果表明平均每個(gè)樹狀大分子的載金量為250個(gè)金原子，載釓量為27個(gè)Gd(III)離子，這些測試結(jié)果表明已成功制備了設(shè)計(jì)合成的功能化的樹狀大分子{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs。實(shí)施例2(1)用5mL的DMSO溶解干重為11. OOmg的G5PAMAM樹狀大分子，邊攪拌邊逐滴滴加溶于4mL DMSO溶液的干重為3. 22mg的D0TA-NHS，其中DOTA-NHS 樹狀大分子摩爾比為 10 1，反應(yīng) 18 小時(shí)。在 anL mPEG-COOH 的 DMSO 溶液(8. 55mg/mL)中，加入 ImL EDC 的 DMSO溶液(17. 2mg/mL)，攪拌反應(yīng)3小時(shí)后逐滴滴加到G5PAMAM樹狀大分子與DOTA-NHS的反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)72小時(shí)。(2)取步驟(1)反應(yīng)液6mL,加入IOmL DMSO和IOmL水，攪拌混勻后，加入115mL HAuCl4水溶液O0mg/mL)混合，在室溫下攪拌20min，溶液變成淺黃色，隨后加入0. 618mL的 20mg/mL的NaBH4溶液(H2O CH3OH (體積比)=2 1)，溶液瞬間變成深紅色，在室溫下攪拌反應(yīng)Ih ；(3)向步驟(2)的反應(yīng)液中加入0. 535mL Gd(NO3)3 · 6H20的水溶液(6mg/mL)，攪拌反應(yīng)12小時(shí)，再加入19. 62 μ L三乙胺，攪拌反應(yīng)20min后向反應(yīng)液中加入11. 2 μ L乙酸酐，在室溫下攪拌反應(yīng)M小時(shí)，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用纖維素透析膜(MWCO= 14000)逐次在磷酸鹽緩沖溶液4LX3和蒸餾水4LX3中透析3天，最后將純化后的產(chǎn)物冷凍干燥得到功能化的基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑{(Au°)25(1-G5-D0TA(GdIII)1(1-PEG2C1-AC} DENPs。合成過程中對樹狀大分子表面修飾用核磁進(jìn)行表征，對各個(gè)峰進(jìn)行積分計(jì)算可知樹狀大分子載體表面修飾了 8. 8個(gè)DOTA分子，18個(gè)mPEG分子。對得到的產(chǎn)品{(Au°)M0-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs進(jìn)行紫外吸收表征如附圖2，納米金顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰在528nm，證明了金納米顆粒的形成，TEM圖片(附圖3)表明金納米顆粒平均直徑為4. 55nm,尺寸分布較窄，具有良好的分散性。進(jìn)一步以電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)測定產(chǎn)物中Au和Gd的含量，結(jié)果表明平均每個(gè)樹狀大分子的載金量為250個(gè)金原子，載釓量為27個(gè)Gd(III)離子，這些測試結(jié)果表明已成功制備了設(shè)計(jì)合成的功能化的樹狀大分子{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs。實(shí)施例3以體外CT測試的HU值來檢驗(yàn)實(shí)施例1和對比例1合成的兩種材料{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs 與{(Au0) 250-G5-DOTA10-PEG20-Ac} DENPs 的 CT 成像效果。取實(shí)例1樣品29. 88mg溶解在580 μ L的PBS緩沖液中配制金濃度為0. IM的溶液，再分別稀釋到金濃度為0. 08Μ，0· 05Μ，0· 03Μ，0· 02Μ，0· OlM的溶液各200 μ L。取對比例1樣品26. 5Img 溶解在580 μ L的PBS緩沖液中配制金濃度為0. IM的溶液，再分別稀釋到金濃度為0. 08Μ, 0. 05Μ，0· 03Μ，0· 02Μ，0· OlM的溶液各200 μ L0用CT測試儀測試各個(gè)樣品的HU值并得出 X-射線衰減與金濃度的線性關(guān)系。附圖4(a)為樣品的CT圖片(其中1為{(AU°)25CI-G5-D OTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs 禾口 2 為{(Au0) 250-G5-DOTA10-PEG20-Ac} DENPs)，附圖 4 (b)為樣品1，2的X-射線衰減與金濃度的線性關(guān)系圖。從圖4(a)中可以看出相同濃度的樣品1比樣品2的CT圖片亮度高，HU值大，說明在Gd(III)離子的存在可以增強(qiáng)材料的CT造影效果。同樣圖4(b)中兩個(gè)材料的濃度和HU值線性關(guān)系良好，樣品1的HU值與金濃度的線性關(guān)系的斜率為5249大于樣品2 (4580)，進(jìn)一步說明Gd(III)離子的存在可以增強(qiáng)材料的CT 造影效果，證明本方法合成的{(Au°)25Q-G5-D0TA(GdIII) 1Q-PEG2Q-AC}DENPs具有較好的CT 成像效果。實(shí)施例4以體外MR測試的T1值來檢驗(yàn)實(shí)施例1和對比例2合成的兩種材料{(Au°) 250-G5 -DOTA(GdIII) 10-PEG20-Ac}DENPs 與 GS-DOTA(GdIII)1c1-PEG^l-Ac 的 MRI 成像效果。取實(shí)例 1樣品37. 35mg溶解在2. 9mL的PBS緩沖液中配制釓濃度為2. 7mM的溶液，再分別稀釋到釓濃度為2. 16mM, 1. 35mM,0. 81mM,0. 54mM,0. 27mM的溶液各lmL。取對比例2樣品2;3mg溶解在2. 9mL的PBS緩沖液中配制釓濃度為1. 3mM的溶液，再分別稀釋到釓濃度為1. 04mM, 0. 65Μ，0· 39Μ，0· 26Μ，0· 13Μ的溶液各ImL0用醫(yī)用3Τ MR測試儀測試各個(gè)樣品的T1值并得出1/ \的值與釓濃度的線性關(guān)系。附圖5(a)為樣品的1\_權(quán)重自旋回波偽彩圖(其中1為 G5-D0TA (GdIII) 10-PEG20_Ac，2 為{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20_Ac} DENPs)，附圖 5 (b) 為樣品1，2的T1弛豫時(shí)間的倒數(shù)隨釓濃度變化的線性關(guān)系圖。從圖5(a)中可以看出相同濃度的樣品1比樣品2MR圖片的T1值低，說明金納米粒子的存在使得材料的T1權(quán)重值較高，MR信號(hào)對比性差。同樣圖5(b)中兩個(gè)材料的濃度和1/ \值線性關(guān)系良好，但是樣品1 的縱向馳豫率U1)為4. S^iT1s-1大于樣品2的1. OSmT1s-1,進(jìn)一步說明金納米粒子的存在降低了材料的MR造影效果。實(shí)施例5將800μ L 實(shí)施例 1 或 2 中得到的{(Au0) 250-G5-DOTA (GdI II) 10-PEG20-Ac} DENPs ([Au] = 0. 1164mol/L)尾部靜脈注射進(jìn)體重為210g的大鼠體內(nèi)，用藥前5min對其通過CT掃描檢測得到大鼠膀胱和腎的圖片(附圖et^Smin，附圖Ttci-Smin)，用藥后5min，
915min，30min，45min再分別通過CT掃描得到大鼠膀胱和腎的CT圖片(附圖6tQ+5min， 6t0+15min, 6t0+30min, 6t0+45min,附圖 7t0+5min, 7t0+15min, 7t0+30min, 7t0+45min),從圖中可以看出，與用藥前的CT圖片相比，用藥后大鼠的膀胱和腎的CT信號(hào)有明顯的增強(qiáng)，膀胱和腎更加清晰，證明本方法合成的{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs具有較好的 CT成像效果。實(shí)施例6將IOOyL 實(shí)施例 1 或 2 中得到的{(Au0) 250-G5_DOTA (GdIII) 10-PEG20_Ac} DENPs ([Gd] = 12. 42mmol/L)尾部靜脈注射進(jìn)體重為15g的小鼠體內(nèi)，用藥前5min對其通過MR掃描檢測得到小鼠膀胱和腎的圖片(附圖8tQ-5min，附圖9tQ-5min)，用藥5min， 15min,30min,45min后再分別通過MRI掃描得到小鼠膀胱和腎的MR圖片(附圖8tQ+5min， 8t0+15min, 8t0+30min, 8t0+45min,附圖 9t0+5min, 9t0+15min, 9t0+30min, 9t0+45min),從圖中可以看出，與用藥前的MR圖片相比，用藥后小鼠的膀胱和腎的T1信號(hào)有明顯的增強(qiáng)，膀胱和腎更加清晰，證明本方法合成的{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs具有較好的 MR成像效果。對比例1(1)用5mL的DMSO溶解干重為11. OOmg的G5PAMAM樹狀大分子，邊攪拌邊逐滴滴加溶于4mL DMSO的干重為3. 22mg的D0TA-NHS，其中DOTA-NHS 樹狀大分子摩爾比為 10 1,反應(yīng) 18 小時(shí)。在 anL mPEG-COOH 的 DMSO 溶液(8. 55mg/mL)中，加入 ImL EDC 的 DMSO溶液(17. 2mg/mL)，攪拌反應(yīng)3小時(shí)后逐滴滴加到G5PAMAM樹狀大分子與DOTA-NHS的反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)72小時(shí)。(2)取步驟(1)反應(yīng)液6mL，加入IOmL DMSO和IOmL水，攪拌混勻后，加入115mL HAuCl4水溶液(20mg/mL)混合，在室溫下攪拌20min，溶液變成淺黃色，隨后加入0. 618mL的 20mg/mL的NaBH4溶液(H2O CH3OH (體積比)=2 1)，溶液瞬間變成深紅色，在室溫下攪拌反應(yīng)0. 5h ；(3)向步驟O)的反應(yīng)液中加入加入19. 62 μ L三乙胺，攪拌反應(yīng)20min后向反應(yīng)液中加入11. 2 μ L乙酸酐，在室溫下攪拌反應(yīng)M小時(shí)，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用纖維素透析膜 (MWC0 = 14000)逐次在磷酸鹽緩沖溶液4LX3和蒸餾水4LX3中透析3天，最后將純化后的產(chǎn)物冷凍干燥得到不含釓的成像造影劑對比產(chǎn)物{(Au0) 250-G5-DOTA10-PEG20-Ac} DENPs。電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)測定產(chǎn)物中Au和Gd的含量，結(jié)果表明平均每個(gè)樹狀大分子的載金量為250個(gè)金原子，載釓量為OfGd(III)離子，這些測試結(jié)果表明已成功制備了設(shè)計(jì)合成的不含釓的成像造影劑對比產(chǎn)物{(AU°)25(i-G5-D0TA1(i-PEG2(i-AC} DENPs。對比例2(1)用5mL的DMSO溶液溶解干重為11. OOmg的G5PAMAM樹狀大分子，邊攪拌邊逐滴滴加溶于4mL DMSO溶液的干重為3. 22mg的D0TA-NHS，其中DOTA-NHS 樹狀大分子摩爾比為 10 1，反應(yīng) 18 小時(shí)。在 2mL mPEG-COOH 的 DMSO 溶液(8. 55mg/mL)中，加入 ImL EDC 的DMSO溶液(17. 2mg/mL)，攪拌反應(yīng)3小時(shí)后逐滴滴加到G5PAMAM樹狀大分子與DOTA-NHS 的反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)72小時(shí)。(2)向步驟(1)的反應(yīng)液中加入0. 265mL Gd(NO3)3 · 6H20的水溶液(iang/mL)，攪拌反應(yīng)12小時(shí)，再加入39. 24 μ L三乙胺，攪拌反應(yīng)30min后向反應(yīng)液中加入22. 3 μ L乙酸酐，在室溫下攪拌反應(yīng)M小時(shí)，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用纖維素透析膜(MWCO= 14000)逐次在磷酸鹽緩沖溶液4LX3和蒸餾水4LX3中透析3天，最后將純化后的產(chǎn)物冷凍干燥得到不含金的成像造影劑對照產(chǎn)物G5-D0TA(GdIII) 10-PEG20-Aco 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)測定產(chǎn)物中Au和Gd的含量，結(jié)果表明平均每個(gè)樹狀大分子的載釓量為13個(gè)Gd(III)離子，0個(gè)金原子，這些測試結(jié)果表明已成功制備了設(shè)計(jì)合成的不含金的成像造影劑對照產(chǎn)物G5-D0TA(GdIII) 10-PEG20-Aco
權(quán)利要求
1.一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，包括(1)在第五代聚酰胺-胺樹狀大分子的DMSO溶液中，加入DOTA-NHS的DMSO溶液，反應(yīng)12-30h ；再加入EDC活化后的mPEG-COOH的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)2_4d，得到功能化樹狀大分子溶液；(2)在上述功能化樹狀大分子溶液中加入氯金酸溶液攪拌20-40min，再加入硼氫化鈉溶液，攪拌反應(yīng)l_4h ；然后加入硝酸釓溶液攪拌2-15h，再加入三乙胺攪拌20-40min，最后加入乙酸酐，攪拌反應(yīng)8-Mh ；(3)將步驟( 所得的溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥處理，即得螯合釓包裹金納米粒子的功能化樹狀大分子{(Au0) 250-G5-DOTA (GdIII) 10-PEG20-Ac} DENPs。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液的濃度為 0. 0500-0. 500mmol/L，其溶劑為 DMSO ；DOTA-NHS 溶液的濃度為 2. 50-4. 485mmol/L，其溶劑為DMSO ；DOTA-NHS與樹狀大分子的摩爾比為5_20 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中EDC活化后的mPEG-COOH的DMSO溶液的制備方法為在 mPEG-COOH的DMSO溶液中加入EDC的DMSO溶液，然后攪拌2_4h ；其中mPEG-COOH的DMSO 溶液的濃度為8. 55mg/mL, EDC的DMSO溶液的濃度為17. 2mg/mL, mPEG-COOH與EDC的體積比為2 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中EDC、mPEG-COOH和樹狀大分子摩爾比為 20-300 5-20 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟O)中氯金酸溶液的溶劑為DMSO和水，其中DMSO和水的體積比為 1-3 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟O)中HAuCl4 ·4Η20和樹狀大分子的摩爾比為50-250 LNaBH4 與HAuCl4 · 4Η20的摩爾比為2-5:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中Gd (NO3) 3·6H20和DOTA的摩爾比為1-5 1 ；N (C2H5) 3、Ac2O 和樹狀大分子的摩爾比為120-660 100-550 1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟O)中的硼氫化鈉溶液的溶劑為水和甲醇，其中水與甲醇的體積比為2 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的透析為用纖維素透析膜MWCO = 14000在磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水中透析3天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于樹狀大分子的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑的制備方法，包括(1)在第五代聚酰胺-胺樹狀大分子溶液中，加入DOTA-NHS溶液，再加入EDC活化后的mPEG-COOH溶液，攪拌反應(yīng)，得到功能化樹狀大分子溶液；(2)在上述功能化樹狀大分子溶液中加入氯金酸溶液和硼氫化鈉溶液，攪拌反應(yīng)；然后加入硝酸釓溶液攪拌，再加入三乙胺和乙酸酐，攪拌反應(yīng)8-24h；(3)將步驟(2)所得的溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥處理，即得。本發(fā)明的制備過程簡單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓；本發(fā)明制備得到的CT/MRI雙模態(tài)成像造影劑具有良好的CT/MRI成像效果，為新型多功能造影劑的開發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K49/12GK102294038SQ20111026655
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者史向陽, 溫詩輝 申請人:東華大學(xué)