專利名稱：蟑螂多肽的制備及其抗革蘭氏陽性及陰性菌醫(yī)藥用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體而言，本發(fā)明涉及一種具有防治細菌感染性疾病功能的蟑螂提取物有效部位及其制備方法和醫(yī)藥用途。該有效部位多肽類活性物質(zhì)可制備成水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑等形式，用于制備治療防治革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌感染相關疾病的藥物、日化用品或醫(yī)療器械。
背景技術：
自然界存在大量細菌。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡稱“金葡菌”)是格蘭氏陽性球菌，是一種最常見且是對人體健康影響極大的致病菌種，引起人的主要感染有癤子、膿皰、毒性表皮腐解、肺炎、骨髓炎、急性心肌炎、乳腺炎、膀胱炎、前列腺炎、菌血癥、中毒性休克綜合癥、淋巴結(jié)炎、咽炎、子宮頸炎、盆腔炎，以及肌肉、皮膚、尿殖道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膿腫?？辜谆髁值慕瘘S色葡萄球菌(MRSA)是20世紀80年代開始出現(xiàn)的耐藥菌株，它是醫(yī)院內(nèi)和臨床上微生物流行病的主要病源。鏈球菌(Streptococcus species)是 成鏈狀排列、兼性厭氧的格蘭氏陽性桿菌。醫(yī)學上常見的致病性鏈球菌大部分屬于3溶血型，它們存在于人的皮膚、呼吸道、消化道以及尿殖道的黏膜上，能夠引起皮膚、呼吸道以及軟組織感染如肺炎、菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、泌尿道炎癥以及關節(jié)炎等疾病。大腸桿菌(或稱大腸埃希氏桿菌)是中等大小桿菌，革蘭氏染色陰性，其大小為(1-3)微米X (0.5-0. 7)微米，有鞭毛、無芽胞，有的菌株可形成莢膜，需氧或兼性厭氧，生化反應活潑、易于在普通培養(yǎng)上增殖，適應性強。該菌對一般消毒劑敏感，但對抗生素及磺胺類藥等極易產(chǎn)生耐藥性。大腸桿菌病是由大腸桿菌埃氏菌的某些致病性血清型菌株引起的疾病總稱，其是由一定血清型的致病性大腸桿菌及其毒素引起的一種腸道傳染病。一年四季均可發(fā)生，臨床癥狀及解剖特點以下痢為主要特征，排出黃棕色水樣稀糞。急性致死性感染病例一般1-2天死亡，亞急性I周左右死亡。治療上常采用螺旋霉素、多粘菌素E、慶大霉素、硫酸卡那霉素、恩諾沙星等肌肉注射，每天2-3次連續(xù)3-5天(以上三者交替應用或合用效果更好)。大多數(shù)革蘭氏陽性菌的致病物質(zhì)為外毒素，而大多數(shù)革蘭氏陰性菌的致病物質(zhì)為其內(nèi)毒素。在抗感染藥物中，抗生素占90%。其它抗真菌藥物、抗病毒藥物和抗寄生蟲病藥物僅占10%。然而，在抗生素的應用中，大多數(shù)格蘭仕陽性菌對青霉素敏感，而革蘭氏陰性菌則大多對鏈霉素和氯霉素等敏感。因此，發(fā)現(xiàn)既能抑制革蘭氏陽性菌同時又能抑制革蘭氏陰性菌生長的抗菌物質(zhì)，將是光譜抗菌藥物開發(fā)的重要目標之一。本世紀以來，隨著隨著現(xiàn)代社會的日益發(fā)達，細菌感染的機會越來越大，手感人群活動反而越來越頻繁，造成大規(guī)模感染的幾率越來越大。因此也造成了抗生素的大量使用，甚至濫用。因此，抗生素的合理應用十分重要。隨著多種抗生素耐藥性的出現(xiàn)、以及超級細菌的初現(xiàn)端倪，使得現(xiàn)有一線使用的抗生素面臨不能滿足臨床需要而全面崩潰的局面。這使得歐美發(fā)達國家投入巨資研發(fā)新的抗生素藥物。除了醫(yī)師自覺抵制濫用抗生素之外，確實還需要儲存一大批針對變異的耐藥株的抗菌藥物，以便在真正發(fā)生大規(guī)模耐藥菌株流行傳播時人們不至于素手無策、坐以待斃。然而，隨著醫(yī)院臨床耐藥菌的增多，以及研發(fā)出的抗生素毒性和副作用越來越大，使得人們不得不將眼光轉(zhuǎn)向廣譜、低毒、使用安全的“綠色抗生素”。不斷研發(fā)出新的植物和動物天然綠色抗生素，是十幾億人口的人口大國必須執(zhí)行的一個既定政策。本研究團隊以前從植物中發(fā)現(xiàn)許多對革蘭氏陽性菌和/或陰性菌有效的植物提取部位和有效成分，更加增添了我們研發(fā)新的“綠色抗生素”、發(fā)現(xiàn)新的抗菌天然藥物的信心。(趙昱等，具抗病毒、抗炎、和/或抗菌作用的六棱菊屬提取物及其用途，ZL200510077457. 3)、(趙昱等，生姜中單萜苷類化合物及其抗菌用途和藥物組合物，CN101012255 ;蒲公英中的兩個黃酮苷及其抗格蘭氏陽性菌的醫(yī)藥用途，ZL200710067180. 5 ；蒲公英中的木質(zhì)素及其抗菌活性和醫(yī)藥用途，ZL 200710067458. 9 ;黑紫橐吾中的含氯原子艾里莫芬烷及其抗菌和細胞毒活性，ZL200710067460.6 ;蒲公英中的倍半萜內(nèi)酯及其抗格蘭氏陽性菌的用途，ZL200710067776. 5 ;黑紫橐吾素A及其抑制格蘭氏陽性菌的醫(yī)藥用途，ZL200710068539. 0 ;蒲公英木質(zhì)素抑制格蘭氏陽性菌的制藥用途，ZL 200810165728. 4)
本研究團隊另外一個開發(fā)的重點領域是昆蟲類抗菌肽資源?？咕氖亲陨鲜兰o80年代以來興起的新的抗菌藥物開發(fā)領域。其是指從生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的宿主產(chǎn)生的一類能夠抵御外界病原體感染的小分子多肽，由動物體內(nèi)的分泌物、血液、淋巴組織等分離得到的大量抗菌肽，其與傳統(tǒng)抗生素的作用機制不同，且對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有不同的選擇性。該研究方向引起了我們的興趣，本研究團隊著力于從抗感染能力強的種群中發(fā)現(xiàn)綠色抗生素，諸如抗菌肽類物質(zhì)和其他有成藥可能的小分子物質(zhì)基礎。蟑螂，為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，最常見為美洲大蠊(Periplaneta americana Linn.)。蟑螂入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其中把它列為中品,謂“味咸、寒；治血瘀癥堅寒熱、破積聚、喉咽閉、內(nèi)寒無子”(孫星衍等，《神農(nóng)本草經(jīng)》，商務印書館，1955:90)?！绑搿睘槠渌酌滓娪凇侗静菥V目拾遺》，也稱其為石姜、滑蟲；各地方有其不同的稱法，如偷油婆、茶婆子、灶螞子等。蜚蠊科(Blattidae)是一個龐大的昆蟲家族，在地球上已生存了 3.2億年，與恐龍屬同一時代出現(xiàn)的生物。無疑它是世界上生命力最強、最古老、至今繁衍最成功的昆蟲類群之一。1960年Princis曾報道蜚蠊在世界范圍內(nèi)約有3500種，我國已有記錄的共253種(馮平章，郭予元，吳福禎，中國蟑螂種類及防治，北京中國科學技術出版社，1997年4月)。蜚蠊主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)的室內(nèi)或野外，而美洲大蠊是其中少數(shù)幾種家居蜚蠊品種之一。美洲大蠊作為室內(nèi)害蟲主要棲息于廚房、食堂、倉庫等處損害食物、衣服、書籍等，取食并污染人的食物，傳播痢疾、傷寒、蛔蟲、蟯蟲等多種疾病。從廚房和倉庫等收集到的226只蟑螂體表及腸道內(nèi)檢出致病菌25種，感染率高達 99. 9% (Pai H. H.等，Isolation of bacteria with antibiotic resistancefrom household cockroaches(Periplaneta americana and Blattella germanica),ActaTropica, 2005,93 (3) :259)。蟑螂作為害蟲是城市衛(wèi)生防疫部門和海關檢疫部門重點防治對象之一。然而，在科技日新月異的今天，面對上千種針對它的各種殺滅劑，這一昆蟲群體依然十分活躍，這表明其體內(nèi)必應具有某些特殊的物質(zhì)和其特有的作用機制，這一現(xiàn)象引起了國內(nèi)外一些學者的關注。近幾年來隨著我國對傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源研究開發(fā)的重視，有些學者對這一幾千年來無法根絕的害蟲進行了應用開發(fā)方面的研究，并取得了可喜的成就，發(fā)掘出了這一傳統(tǒng)意義上的害蟲的正面價值。我們研究團隊以美洲大蠊醇提物制成的產(chǎn)品“康復新”，在燒傷、燙傷等外傷創(chuàng)面的良好療效。以美洲大蠊醇提物精制而成的“心脈龍注射液”，具強心升壓，改善微循環(huán)，興奮呼吸，利尿，增加心、腦、肺、腎的血流量?！靶拿}龍注射液”主治右心衰，也可治急慢性心衰、失血性休克、低血壓、室性早博、病竇性綜合癥、心腦缺血性疾病，為2004年通過中國國家食品與藥品監(jiān)督管理局SFDA審批的國家二類新藥(中藥)。藍江林等利用大腸桿菌、溴氫菊酯、昆蟲生理鹽水、紫外線、超聲波作為誘導源進行誘導，獲得具有抗菌活性的血淋巴，在經(jīng)誘導的美洲大蠊血淋巴中提取分離得到抗菌肽成分。對經(jīng)大腸桿菌誘導的美洲大蠊的血淋巴進行抑菌作用測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的數(shù)量在一定的測試時間內(nèi)逐漸減少。該研究還通過電鏡觀察表明經(jīng)誘導的美洲大蠊學血淋巴中的抗菌肽首先使細菌的外層及細胞質(zhì)膜損傷，形成開口，導致內(nèi)容物外泄而死亡，最后菌體崩解成碎片。因此認為美洲大蠊抗菌肽對大腸桿菌不是一般的抑菌作用，而是直接殺滅作用。(藍江林，周先治，卓侃等，美洲大蠊(Peripla neta americana L.)抗菌肽殺菌作用初步觀察，福建農(nóng)林大學學報(自然科學版)，2004，33(2) :166)。對蜚蠊科昆蟲澳洲大蠊(Periplaneta australasie Fabricus)全蟲(去翅及足)的油狀醇提取物進行的體內(nèi)篩選證明澳洲大蠊提取物對S-180及人食管癌小鼠異種移植均有顯著的抗癌作用(黃厚聘，程才芬，李淑芳，蟑螂油的抗癌作用，中草藥，1981，12(1) :35)。陳利銘發(fā)現(xiàn)蟑螂提取物AT2能增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，并能使脾臟重量增加，在體外可增加T淋巴細胞對Con A的轉(zhuǎn)化反應。AT2治療原發(fā)性肝癌49例，臨床觀察表明，本品具有緩解癥狀，使甲胎蛋白下降，延長患者生存期的功效(陳利銘，蟑螂提取物AT2抗癌作用的臨床及實驗研究，中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986，(11):648)。在臨床應用方面，蟑螂活蟲提取物治療原發(fā)性肺癌有良好效果。廖劍英以“康復新”治療惡性纖維組織細胞瘤，取得良好效果(廖劍英，康復新治療惡性纖維組織細胞瘤I例，大理學院學報，2003，2 (3) :92)。有相關報道表明蟑螂提取物在抗腫瘤的同時具有一定的增強免疫功能的作用(羅志宏，占漢章，李艷紅等，中藥康復新在頭頸部惡性腫瘤治療中的作用觀察，中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜，1998,6(3) :132 ;嚴奉祥等，中藥康復新的在體免疫藥理學特征，大理醫(yī)學院學報，1991，3(1):21)。對美洲大蠊在制藥方面的研究多集中于美洲大蠊中的粗提物，李樹楠等從美洲大蠊的醇提物中除去油脂，用二氧化碳吸附后除去色素和過敏成分，用于治療心血管疾病(國家發(fā)明專利CN 1067243C);劉耀北等用乙酸提取蟑螂提取物，對肝癌細胞BEL7404和BEL7721進行癌細胞增殖抑制試驗，發(fā)現(xiàn)粗提物可以有明顯抑制癌細胞生長的作用(國家發(fā)明專利CN 1199991C);廖吉等報道了用6號提取液從蜚蠊蟲體中制備降脂、調(diào)節(jié)膽固醇、調(diào)節(jié)血糖、防治腫瘤和預防心血管疾病、抗風濕作用的保健食品(國家發(fā)明專利CN1230183C)；嚴少宏等闡述了一種美洲大蠊粗浸膏的優(yōu)化提取方式(國家發(fā)明專利CN1255117C);徐燕和公開了一種類似的粗浸膏制備方法(國家發(fā)明專利CN 1548058A);嚴少宏等公開了一種美洲大蠊粗浸膏綜合利用的的提取方式(國家發(fā)明專利CN 1593467A)。以上專利都未公開美洲大蠊抗菌藥用有效部位的方面的應用。發(fā)明人所在研究團隊對蟑螂進行了十余年的研究；所研發(fā)的“康復新”、“心脈隆注射液”、“肝龍注射液”取得了 3只國家新藥證書，產(chǎn)品已經(jīng)上市銷售。在我們對美洲大蠊的后續(xù)研究中；我們還發(fā)現(xiàn)用醇水混合溶劑溶劑提取美洲大蠊蟲體具有體外抗單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)的功效(王曉雨，劉光明，宋麗艷等，“美洲大蠊有效部位的用途”，ZL200810060885.9)。但是，該專利中使用的是大孔樹脂作為分離材料；對于多肽類分子量并無選擇性；而對于化學實體應用于制備藥物時的質(zhì)量控制，希望得到分子量在一定范圍內(nèi)的多肽，以便利于質(zhì)量控制。而藍江林等研究的美洲大蠊抗菌肽是以大腸桿菌誘導美洲大蠊，使其血淋巴中產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，然后再從血淋巴中提取分離抗菌肽。該過程復雜，且無法提供足量的抗菌肽作為進一步研究開發(fā)的物質(zhì)基礎。因此，尋找美洲大蠊體內(nèi)固有的抗菌物質(zhì)以便進一步開發(fā)利用仍十分必要。我們?yōu)榱藢ふ铱咕钚愿鼜姾唾|(zhì)量更易于控制的總多肽類有效部位，嘗試應用先進的膜分離法對美洲大蠊提取物進行了活性篩選下的抗菌有效活性部位研究；并同時用革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌予以測試，最終發(fā)現(xiàn)了用<5KDa的生物膜進行分離，能得到新的廣譜抗菌活性有效部位；產(chǎn)率比用大孔樹脂法得到提高，且質(zhì)量控制更為精準。同時，我們還針對該活性部位進行抗菌實驗，最終發(fā)現(xiàn)用<5KDa的生物膜分離法得到的既能抗革蘭 氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌)、又能抗革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)雙重抗菌活性的蟑螂多肽類有效部位。經(jīng)查新發(fā)現(xiàn)，以往均無由美洲大蠊醇提物經(jīng)膜分離法得到的提取物作為主藥進行配制的藥物制劑的相關報道，更無運用上述制劑用于廣譜抗菌的文獻報道。從而構成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種蟑螂中提取的分子量小于5000道爾頓的活性物質(zhì)有效部位；本發(fā)明的另一目的是提供了一種制備蟑螂中提取的分子量小于5000道爾頓的活性物質(zhì)有效部位的方法；本發(fā)明的另一目的是提供了將美洲大蠊提取物有效部位用于制備既能抗革蘭氏陽性菌又能抗革蘭氏陰性菌感染的廣譜抗菌藥物、日化用品、醫(yī)療器械的用途；本發(fā)明的又一目的是提供了一種含有美洲大蠊提取物有效部位用于制備防治細菌感染的多種制劑形式，包括水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑。根據(jù)本發(fā)明人深入的研究，發(fā)現(xiàn)美洲大蠊的抗菌活性成分可以通過工藝優(yōu)化得到富集，本發(fā)明人采用水或水醇溶劑提取得到的美洲大蠊醇提物輔以孔徑大小一定的超濾膜進行超濾，得到分子量小于5000道爾頓的有效部位(即<5KDa部位)，具體而言，本發(fā)明中美洲大蠊具抗菌活性的有效部位的制備方法如下用水或有機溶劑及緩沖溶劑提取經(jīng)粉碎或未粉碎的美洲大蠊蟲體，濃縮提取回收溶劑，特定濃縮比/特定轉(zhuǎn)速和PH值下進行超濾膜分離純化；得到的分子量小于5KDa的多肽類活性有效部位經(jīng)減壓濃縮至無醇味，減壓濃縮或冷凍干燥，粉碎得產(chǎn)品。本發(fā)明中的動物藥材可以是蟑螂任一部位，即可以是美洲大蠊(Periplanetaamericana)頭、身、翅，也可以是它們的混合物，優(yōu)選全蟲?？梢允歉稍锶x，也可以是未經(jīng)干燥的全蟲或活體全蟲。本發(fā)明得到的美洲大蠊醇提物經(jīng)超濾膜分離得到的分子量小于5KDa的多肽類有效部位具有重要的生物活性，體外具有明顯的抑制革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌)以及抑制革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的活性；其抑制革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌的活性高于粗提物。急性毒性試驗進一步證實，ICR小鼠口服該有效部位具有相當?shù)陌踩浴Ｒ陨暇f明美洲大蠊醇提物經(jīng)經(jīng)超濾膜分離得到的分子量小于5KDa的多肽類有效部位有可能發(fā)展成為新的廣譜抗菌類藥物、日化用品或醫(yī)療器械。說明本發(fā)明所提供的以超濾膜分離制備方法得到分子量小于5000道爾頓的多肽類有效部位具有創(chuàng)造性和新穎性,據(jù)此完成本發(fā)明。本發(fā)明中所述及的美洲大蠊醇提物經(jīng)超濾膜分離得到的分子量小于5KDa的多肽類有效部位可以與藥學上 常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到具有廣譜抗菌功效的水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑、泡沫凝膠，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。本發(fā)明的美洲大蠊醇提物經(jīng)超濾膜分離得到的分子量小于5KDa的多肽類有效部位或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌抑制劑和/或其他治療類似革蘭氏陽性菌感染相關病癥的治療藥物及其原料藥如頭孢類、大環(huán)內(nèi)酯類、以及磺胺類如沙星等藥物品種聯(lián)合使用或交叉使用，制備得到具有抗病菌感染的組合物或復方制劑，可預期成為治療革蘭氏陽性菌感染疾病藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械。上述各類藥物組合物或者藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械可以采用片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，包括采用現(xiàn)已公認的藥劑學常識常規(guī)制備而得的各種緩釋、控釋劑型或納米制劑。本發(fā)明的美洲大蠊醇提物經(jīng)超濾膜分離得到的分子量小于5KDa的多肽類有效部位或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的大腸桿菌抑制劑和/或其他治療類似革蘭氏陰性菌感染相關病癥的治療藥物及其原料藥如螺旋霉素、多粘菌素E、慶大霉素、硫酸卡那霉素、恩諾沙星等藥物品種聯(lián)合使用或交叉使用，制備得到具有抗病菌感染的組合物或復方制劑，可預期成為治療革蘭氏陰性菌感染疾病藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械。上述各類藥物組合物或者藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械可以采用片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓齊U、膜劑、滴丸劑、水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，包括采用現(xiàn)已公認的藥劑學常識常規(guī)制備而得的各種緩釋、控釋劑型或納米制劑。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明使用超濾膜分離法制備出美洲大蠊醇提物中分子量小于5KDa的多肽類有效部位，其原料來源方便易得、制備步驟簡便、利于產(chǎn)業(yè)化。超濾膜分離法產(chǎn)率高，且生理活性更為廣泛，該多肽有效部位具有顯著的抑制的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的藥效活性，對于開發(fā)市場廣大的廣譜抗菌藥物、日化用品和醫(yī)療器械提供了新的物質(zhì)基礎，通過規(guī)范化養(yǎng)殖蟑螂又能給連片特困地區(qū)的農(nóng)民增加收入、脫貧，具有潛在的社會效益和經(jīng)濟效益。
具體實施方案為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面分別用實施例說明采用超濾膜分離法制備出美洲大蠊醇提物中分子量小于5KDa的多肽類有效部位，及其對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌抑制作用的藥理實驗結(jié)果，說明其在抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌研究領域中的新用途。本發(fā)明還用該活性提取物進行了 ICR小鼠的口服灌胃急性毒性試驗，說明該有效部位對動物的毒性，由此來反映在人體使用時的安全性。若無特別說明，本發(fā)明的百分比指的是重量百分比。必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。實施例I :美洲大蠊水提物經(jīng)超濾膜分離法富集分子量小于5KDa的多肽類有效部位(樣品A)的制備I. I美洲大蠊水提物的制備美洲大蠊藥材3公斤，加雙蒸水10000毫升，45° C浸泡提取I次，24小時；50° C浸泡提取I次，24小時；55°C浸泡提取I次，24小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得美洲大蠊水提物。I. 2采用5KDa超濾膜過濾正交試驗制備樣品A經(jīng)對影響膜分離效果的因素進行單因素試驗，確定影響因素是轉(zhuǎn)速、時間、pH值、 濃縮比，并最終確定影響因素范圍。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設計正交實驗方案，確定最佳工藝。I. 2. I不同pH值對超濾效果的影響將I. 2項下制備得到的美洲大蠊水提物溶解，采用一定濃度的氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)其PH值分別為8、9、10和11四個梯度，濃度為0. 3毫克/毫升(mg/mL)，轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘(r/min)，時間分別為10、20、30、40、50和60分鐘(min)、考察對超濾效果的影響。I. 2. 2不同濃縮比對超濾效果的影響將I. 2項下制備得到的美洲大蠊水提物溶解，采用不同量溶解，使其濃縮比分別為0. 2,0. 3,0. 4和0. 5mg/mL四個梯度，轉(zhuǎn)速為2500r/min, pH值為9，時間分別為10、20、30、40、50和60min、考察對超濾效果的影響。1.2. 3不同轉(zhuǎn)速對超濾效果的影響將I. 2項下制備得到的美洲大蠊水提物溶解，使其轉(zhuǎn)速分別為1500、2500、3500和4500r/min四個梯度，濃度為0. 3mg/mL, pH值為9，時間分別為10、20、30、40、50和60min、考察對超濾效果的影響。I. 2. 4不同時間對超濾效果的影響將I. 2項下制備得到的美洲大蠊水提物溶解，使其時間分別為10、20、30、40、50和60min六個梯度,濃度為0. 3mg/mL, pH值為9,轉(zhuǎn)速為2500r/min,考察對超濾效果的影響。通過以上單因素試驗，確定其主要影響因素及其范圍分別是濃縮比(0. 2,0. 3和0. 4mg/mL)、轉(zhuǎn)速(2500、3500 和 4500r/min)和 pH 值(9、10 和 11)。I. 2. 5用三因素三水平正交實驗驗證出最佳提取參數(shù)通過三因素三水平正交實驗，推斷出超濾提取最佳組合是轉(zhuǎn)速4500r/min、pH= 11 和濃度為 0. 3mg/mL。I. 2. 6分子量<5KDa多肽樣品制備美洲大蠊水提物300毫克,用水1000毫升溶解；調(diào)制其pH值為11后,傾入置有孔徑為5KDa的超濾膜的超濾裝置中，以4500r/min轉(zhuǎn)速超濾30分鐘。濾液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽樣品(65毫克)，收率21. 7%。I. 2. 7SDS-PAGE電泳檢測樣品A的分子量部分儀器與試劑三羥甲基氨基甲烷(Tris) =Solarbio公司；十二烷基硫酸鈉(SDS) :Sigma公司；甘氨酸Solarbio公司；丙烯酰胺Amresco公司；N，N'-亞甲基雙丙烯酸胺Amresco公司；TEMED Bio Basic Inc.公司;N_三輕甲基甲基甘氨酸(Tricine)Solarbio公司；P-巰基乙醇Bio Basic Inc.公司；溴酚藍生工生物工程(上海)有限公司；超低分子量標準蛋白標記(Marker，3. 3-20. IKDa) =Solarbio公司；考馬斯亮藍G-250 Solarbio公司；考馬斯亮藍R-250 Solarbio公司；3-(環(huán)己胺)-I-丙磺酸鈉(CAPS)Solarbio公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF) =Solarbio公司；HD_3型紫外檢測儀上海滬西分析儀器廠有限公司；HD-A型電腦采集器上海滬西分析儀器廠有限公司；QL-866型旋渦混合器海門其林貝爾儀器制造有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳系統(tǒng)Bio-Rad公司；TS-1型脫色搖床海門其林貝爾儀器制造有限公司；In Genius LHR型凝膠成像分析系統(tǒng)Gene公司。采用SDS-PAGE法，雙垂直電泳槽，分離膠的質(zhì)量分數(shù)為15%，濃縮膠的質(zhì)量分數(shù)為3. 5%，供試品上樣量為10微升，濃縮膠電壓為10mA，分離膠電壓為20mA。采用考馬斯亮藍染色法。與標準低分子量蛋白質(zhì)marker比較，確認由上述方法制備而得的美洲大蠊水提物超濾膜分離后得到的樣品95%以上為分子量<5KDa的物質(zhì)。 I. 2. 8SDS-PAGE電泳檢測樣品A的性質(zhì)采用Folin-酚試劑法(Lowry法)測定樣品A中蛋白質(zhì)的含量為65%。將樣品A按照標準方法水解后與標準氨基酸以HPLC法比對后確定，該分子量<5KDa多肽樣品由17種常見氨基酸組成。I. 3與用D-IOl大孔樹脂法得到的活性部位之收率比較I. 3. I按照專利ZL 200810060885. 9公開的內(nèi)容制備樣品B(I)美洲大蠊藥材3公斤，加55%乙醇10000毫升，室溫浸泡提取，提取3次，每次24小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得美洲大蠊醇提物。(2)取得到的美洲大蠊醇提物20克，用30克D-IOl大孔吸附樹脂吸附拌樣，上200克D-IOl大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫至無色，續(xù)用30 %乙醇-水溶液洗脫至無色，取洗脫液10毫升減壓濃縮至干，冷凍真空干燥，即得提取物(11-30)[美洲大蠊醇提物D-IOl大孔吸附樹脂柱層析30%醇洗液];續(xù)用60%乙醇-水溶液洗脫至無色，取洗脫液10毫升減壓濃縮至干，冷凍真空干燥，得提取物(11-60)[美洲大蠊醇提物D-IOl大孔吸附樹脂柱層析60%醇洗液]，即樣品B。I. 3. 2樣品B收率將上述方法制備得到的提取物11-30與11-60稱重，分別為2. 96克和724. 9毫克。針對美洲大蠊醇提物20克而言，提取物11-60 (即樣品B)的收率為3.6%。而按照本實施例之超濾膜法，300毫克美洲大蠊粗提物經(jīng)超濾膜操作后得到65毫克有效部位，收率為21. 7% ;顯而易見，以超濾膜法進行對多肽部位的富集，損失小，收率大大提高(為大孔樹脂方法制備得到的樣品之6倍)。I. 4與用D-IOl大孔樹脂法得到的活性部位的分子量之比較I. 4. I將上述I. 3項制備得到的樣品B (11-60 [美洲大蠊醇提物D-IOl大孔吸附樹脂柱層析60%醇洗液])按照本實施例I. 2. 7項所描述之SDS-PAGE電泳法檢測分子量，以超低分子量標準蛋白Marker (3. 3-20. IKDa)為對照，可知樣品B中分子量<5KDa的物質(zhì)占52% ;而5-15KDa者為38% ;>15KDa者占10%。與美洲大蠊水提物超濾膜分離后得到的有效部位樣品95%以上為分子量<5KDa的物質(zhì)相比，用D-IOl大孔樹脂法得到的活性部位分子量分布較為分散，質(zhì)量控制上不如用超濾膜方法得到的分子量集中的多肽部位容易受到控制。實施例2 :美洲大蠊醇提物經(jīng)超濾膜分離法富集分子量小于5KDa的多肽類有效部位(樣品C)的制備2. I美洲大蠊醇提物的制備美洲大蠊藥材3公斤，加55%乙醇10000毫升，室溫浸泡提取，提取3次，每次24小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得美洲大蠊醇提物。2. 2分子量<5KDa多肽活性物質(zhì)(樣品C)的制備依照實施例I中正交試驗優(yōu)選出的提取參數(shù)，取2. I制備得到的美洲大蠊醇提物 300毫克,用溫水1000毫升溶解；調(diào)制其pH值為11后,傾入置有孔徑為5KDa的超濾膜的超濾裝置中，以4500rpm轉(zhuǎn)速超濾30分鐘。濾液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽樣品(69暈克)，收率23%。2. 3SDS-PAGE電泳檢測樣品C的分子量儀器與試劑同實施例I。采用SDS-PAGE法，雙垂直電泳槽，分離膠的質(zhì)量分數(shù)為15%,濃縮膠的質(zhì)量分數(shù)為3. 5%,供試品上樣量為10微升,濃縮膠電壓為IOmA,分尚膠電壓為20mA。采用考馬斯亮藍染色法。與標準低分子量蛋白質(zhì)marker比較，確認由2. 2方法制備而得的樣品C其93%以上為分子量<5KDa的物質(zhì)。2. 4SDS-PAGE電泳檢測樣品C的性質(zhì)采用Folin-酚試劑法(Lowry法)測定2. 2方法所制備出之樣品C中蛋白質(zhì)的含量為66%。將樣品C按照標準方法水解后與標準氨基酸以HPLC法比對后確定，該分子量<5KDa多肽樣品由17種常見氨基酸組成。實施例3 :美洲大蠊丙酮-水提物經(jīng)超濾膜分離法富集分子量小于5KDa的多肽類有效部位(樣品D)的制備3. I美洲大蠊丙酮-水提物的制備美洲大蠊藥材3公斤，加70%丙酮水溶液10000毫升，室溫浸泡提取，提取3次，每次24小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得美洲大蠊丙酮-水提物。3. 2分子量<5KDa多肽樣品(樣品D)的制備依照實施例I中正交試驗優(yōu)選出的提取參數(shù)，取2. I制備得到的美洲大蠊丙酮-水提物300毫克，用溫水1000毫升溶解；調(diào)制其pH值為11后，傾入置有孔徑為5KDa的超濾膜的超濾裝置中，以4500rpm轉(zhuǎn)速超濾30分鐘。濾液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽樣品(67毫克)，收率為22. 3%。3. 3SDS-PAGE電泳檢測樣品D的分子量儀器與試劑同實施例I。采用SDS-PAGE法，雙垂直電泳槽，分離膠的質(zhì)量分數(shù)為15%,濃縮膠的質(zhì)量分數(shù)為3. 5%,供試品上樣量為10微升,濃縮膠電壓為IOmA,分尚膠電壓為20mA。采用考馬斯亮藍染色法。與標準低分子量蛋白質(zhì)marker比較，確認由3. 2方法制備而得的樣品D其90%以上為分子量<5KDa的物質(zhì)。3. 4SDS-PAGE電泳檢測樣品D的性質(zhì)采用Folin-酚試劑法(Lowry法)測定3. 2方法所制備的樣品D中蛋白質(zhì)的含量為61%。將樣品D按照標準方法水解后與標準氨基酸以HPLC法比對后確定，該分子量<5KDa多肽樣品由17種常見氨基酸組成。
實施例4 :美洲大蠊不同提取物中制備出的分子量<5KDa多肽樣品抑制格蘭氏陽性菌能力檢測4. I 原理采用“管碟法”研究試驗藥物的體外抗菌活性，利用加在牛津杯中的試驗藥物擴散到接種有試驗菌的培養(yǎng)基中，從而抑制細菌的生長。通過檢測在牛津杯周圍形成的抑菌圈的直徑大小來確定試驗藥物的抗菌活性。4. 2 檢測菌金黃色葡萄球菌26003-23，購自中國藥品生物制品檢定所。乙型溶血性鏈球菌32210，購自中國藥品生物制品檢定所。
4. 3試驗藥物及儀器4. 3. I試驗藥物DMSO DMS0 溶劑對照；陽性對照藥物諾氟沙星2. 5mg/mL ；測試樣品來自實施例1-3中制得的四種樣品(樣品A :1. 2. 6所述之美洲大蠊水提物經(jīng)超濾膜制備的分子量<5KDa多肽樣品；樣品B :1. 3. I所述之美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附樹脂柱層析60%醇洗液；樣品C :實施例2中依2. 2法制得的美洲大蠊醇提物中分子量<5KDa多肽樣品；樣品D :實施例3中依3. 2法制得的美洲大蠊丙酮_水提物中分子量<5KDa多肽樣品)。樣品用DMSO溶解并配置成2. 5mg/mL。4. 3. 2 儀器CO2培養(yǎng)箱美國Shellab公司產(chǎn)品；XD-2倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司產(chǎn)品；生物安全柜美國LABC0NC0公司產(chǎn)品；LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。4. 4方法與步驟4. 4. I制備M-H瓊脂、M-H肉湯及試驗菌液。4. 4. 2雙碟的制備(I)M-H瓊脂底層取滅菌M-H瓊脂液體自然冷卻凝固。(2) M-H瓊脂菌層取菌液150微升(ill)與30毫升(mL)的M-H瓊脂混勻。取約5mL含菌液瓊脂，均勻攤布在具有M-H瓊脂底層的平皿內(nèi)。4. 4. 3待培養(yǎng)基凝固后，在每個平皿中均勻放立加滿試驗藥液牛津杯。4. 4. 4 置 37°C培養(yǎng) 24 小時。4.4. 5用游標卡尺測量抑菌圈直徑。4. 5 結(jié)果樣品A-D及陽性對照藥物諾氟沙星抑菌試驗結(jié)果見表I。表I.樣品A-D及諾氟沙星(2. 5mg/mL)對標準致病菌的抑菌圈直徑(毫米mm)
權利要求
1.一種從蟑螂中提取的抗菌活性物質(zhì)用于制備防治細菌感染性疾病的藥物用途，其特征是所述活性物質(zhì)是分子量小于5000道爾頓的多肽；細菌是指革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌；所述藥物用途通過藥物制劑、醫(yī)療器械、日化用品形式體現(xiàn)。
2.根據(jù)權利要求I的藥物用途，其中細菌性感染性疾病是指革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌或乙型溶血性鏈球菌感染所致的病癥，或革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌感染所致病癥。
3.根據(jù)權利要求2的藥物用途，金黃色葡萄球菌感染所致的病癥是指癤子、膿皰、毒性表皮腐解、肺炎、骨髓炎、急性心肌炎、乳腺炎、膀胱炎、前列腺炎、菌血癥、中毒性休克綜合癥、淋巴結(jié)炎、咽炎、子宮頸炎、盆腔炎，以及肌肉、皮膚、尿殖道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膿腫中的一種或多種。
4.根據(jù)權利要求2的藥物用途，乙型溶血性鏈球菌感染所致的病癥是指皮膚、呼吸道 或軟組織感染引起的肺炎、菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、泌尿道炎癥或關節(jié)炎。
5.根據(jù)權利要求2的藥物用途，大腸桿菌感染所致病癥是指致病性大腸桿菌或其毒素引起的腸道炎癥或下痢。
6.根據(jù)權利要求I的藥物用途，其特征是所述藥物制劑、醫(yī)療器械、日化產(chǎn)品的形式是水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑。
7.一種制備權利要求I中所述活性物質(zhì)的方法，其特征為用超濾膜分離法截取蟑螂提取物中分子量小于5000道爾頓的物質(zhì)；其中蟑螂提取物是指蜚蠊科昆蟲蟑螂蟲體經(jīng)水或有機溶劑及緩沖溶液提取出的物質(zhì)。
8.一種具有抗革蘭氏陽性菌感染和/或抗革蘭氏陰性菌感染的藥物組合物，其特征是該藥物組合物含有治療有效量的根據(jù)權利要求I的活性物質(zhì)、藥用輔料、可藥用載體或外傷敷料。
9.一種具有抗革蘭氏陽性菌感染和/或抗革蘭氏陰性菌感染的飼料添加劑組合物，其特征是該飼料添加劑組合物含有根據(jù)權利要求I的活性物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及蟑螂多肽的制備及其抗革蘭氏陽性及陰性菌醫(yī)藥用途。具體而言，本發(fā)明涉及一種具有防治細菌感染性疾病功能的蟑螂提取物有效部位及其制備方法和醫(yī)藥用途。本發(fā)明的美洲大蠊提取物有效部位是分子量小于5000道爾頓的多肽類物質(zhì)，由蜚蠊科美洲大蠊(Periplaneta americana)蟲體鮮品或干品經(jīng)溶劑提取和膜分離法精制而成，該有效部位多肽類活性物質(zhì)具有明顯的抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌活性，可制備成水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑形式，用于制備防治革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌感染相關疾病的藥物、日化用品以及醫(yī)療器械。
文檔編號A61K35/64GK102743741SQ201210137410
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月6日 優(yōu)先權日2012年5月6日
發(fā)明者巫秀美, 楊榮新, 趙昱, 錢金栿, 高鵬飛 申請人:大理學院