專利名稱：一種新型多肽在干燥綜合征診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)診斷領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種新型多肽(SSP)的制備方法和及其在干燥綜合征診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干燥綜合征(Sj6gren’s Syndrome, SS)是一種以侵及淚腺和唾液腺等外分泌腺
為特征的全身性自身免疫疾病。該病最常見的臨床表現(xiàn)為眼干、口干，并可累及肺、腎臟、淋巴系統(tǒng)、血管及肝臟等器官。此病無明顯的地區(qū)分布差異，可發(fā)生于任何年齡，以40-60歲， 特別是絕經(jīng)后的女性居多，男女之比為1 9。在我國的患病率為0.77%，在老年人群中的患病率高達(dá)4%，全國有近1000萬患者。干燥綜合征可分為原發(fā)性干燥綜合征(Primary Sjogren，s syndrome)禾口繼發(fā)性干燥綜合征(Secondary Sjogren，s syndrome)兩類。該病單獨(dú)發(fā)生時(shí)，稱為原發(fā)性干燥綜合征；與其它診斷明確的自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)、系統(tǒng)性紅斑狼疫(systemic lupus erythematosus, SLE) 等合并存在時(shí)，稱為繼發(fā)性干燥綜合征。近年來，人們對干燥綜合征的病因及發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了大量研究，但至今無突破性進(jìn)展。目前在臨床診斷主要依據(jù)臨床癥狀和唇腺活檢及腮腺造影等有創(chuàng)檢查明確診斷，由于患者的醫(yī)從性差，常常延誤診斷，并喪失最佳的治療時(shí)機(jī)。雖然診斷標(biāo)準(zhǔn)中包括血清抗 SSA(Ro)抗體、抗SSB(La)抗體和抗核抗體(ANA)檢測，但它們均特異性和敏感性低，不能作為理想的診斷指標(biāo)。因此，尋找一種敏感性強(qiáng)、特異性高而又簡便易行的血清學(xué)檢測方法， 對干燥綜合征的早期診斷及治療具有重要意義。大量自身抗體的出現(xiàn)是自身免疫性疾病的重要特征之一，但由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，難以直接利用自身抗原檢測抗體?？乖砦?epitope)是抗原分子中識別、結(jié)合抗體的基礎(chǔ)，因此是檢測抗體的實(shí)際有效組分。以抗原表位肽或其模擬肽(mimotope)作為診斷工具有以下幾個(gè)優(yōu)勢1)可以提高診斷的靈敏度和特異性，避免了生物大分子易產(chǎn)生的非特異性結(jié)合[Deroo Set al (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4:75-115]； 2)擴(kuò)大疾病診斷的范圍，對于研究較少或難以體外應(yīng)用的自身抗原如核酸抗原、多糖抗原、 脂類抗原，以模擬肽作為天然抗原的替代物進(jìn)行診斷，也可以獲得與天然抗原表位一致的結(jié)果[Bruce G (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:1955 1960 Jinaping Q et al (1999) Hyridoma 18(1) =103-109] ；3)多肽制備、應(yīng)用的成本低、易于質(zhì)控。因此，自身抗原表位肽或其模擬肽[Meloen RH et al(2000)J Mol Recognit 13 :352-359]的獲得是制備自身抗體的多肽檢測試劑的基礎(chǔ)。基于噬菌體肽庫技術(shù)的抗原表位確定技術(shù)，僅需要以患者血清樣本為靶標(biāo)，而無需天然的自身抗原信息，可以實(shí)現(xiàn)快速和簡便篩選，并且成本低、結(jié)果可信度高。噬菌體肽庫技術(shù)的另一個(gè)突出特點(diǎn)是，通過篩選可以同時(shí)獲得某一疾病特異性的多個(gè)抗原表位肽，它們可能代表了天然抗原的主要免疫顯性基團(tuán)。天然生物大分子抗原通常由多個(gè)抗原表位組成，其中有一些在免疫反應(yīng)中起著主要作用，被稱為“免疫顯性基團(tuán)”， 針對完整抗原的抗體主要是針對這些表位的多種“單克隆抗體”組成。以SS患者血清樣品為靶標(biāo)，通過噬菌體肽庫篩選，獲得SS特異性的抗原表位肽，是獲得新型診斷試劑的基礎(chǔ)。基于以上研究及目前的現(xiàn)狀，申請人進(jìn)行了多方面的研究及探索，通過下述實(shí)驗(yàn)策略獲得了 SS特異性的抗原表位肽。具體而言，申請人從10例SS患者血清中制備和純化得到IgG，然后以線性十二肽庫與抗體孵育，經(jīng)篩選獲得了與抗體特異結(jié)合的噬菌體克隆。 之后通過ELISA確定陽性噬菌體克隆，測定陽性噬菌體克隆展示肽序列?；瘜W(xué)合成其中的一個(gè)表位肽，命名為SSP，通過ELISA檢測與患者血清的反應(yīng)情況，表明其能特異的與患者血清中的IgG結(jié)合，而不與健康人血清反應(yīng)。至此，申請人能夠特異性與SS患者血清中IgG結(jié)合的抗原表位肽，由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
具體地，本發(fā)明提供了 1. 一種干燥綜合征特異性的抗原表位，其具有下述的氨基酸序列(SEQ IDNO=I)YNATGPSPVSQff2. 一種核苷酸序列，其特征在于編碼權(quán)利要求1所述的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，其可作為組合物的一種組分。4.權(quán)利要求3的組合物，其特征在于，還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。5.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，其可作為組合物的一種組分。6.權(quán)利要求5的組合物，其特征在于，還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。7.權(quán)利要求1所述的抗原表位在干燥綜合征診斷的用途。8.權(quán)利要求2所述的核苷酸序列在干燥綜合征診斷的用途。


圖1 表示陽性噬菌體克隆的競爭ELISA結(jié)果。圖2 表示合成肽SSP與SS患者血清樣品、健康人血清樣品的結(jié)合。
具體實(shí)施例方式為了更清楚地闡述本發(fā)明，具體提供了下述闡述性的實(shí)施方案，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明并不僅僅限定于下述實(shí)施例，任何與本發(fā)明的實(shí)施例等同的變體也包括在本發(fā)明中。實(shí)施例1、噬菌體展示肽庫篩選SS特異性的抗體結(jié)合肽Ph. D. -12肽庫試劑盒購自NEB公司，庫容量為2. 7 X IO9,滴度為1. 5 X IO13/ μ 1.。 Escherichia coli ER2537為肽庫的宿主菌。篩選過程參見噬菌體展示肽庫使用說明書。 每輪篩選以SS患者血清中的總IgG包被(每孔10 μ g)，每孔投入1 X IO11噬菌體。噬菌體富集程度通過“投入/產(chǎn)出比”計(jì)算。經(jīng)過三輪篩選，挑取陽性克隆測序。陽性噬菌體克隆與總IgG抗體的特異性結(jié)合通過ELISA測定?？侷gG抗體(每孔10 μ g)包被96孔板 (Nunc公司)4°C過夜。傾去不結(jié)合的抗體，3% BSA 37°C封閉1小時(shí)。每孔投入IXlO9噬菌體37°C孵育2小時(shí)。洗滌液(PBS-0. 05% Tween 20)洗板5次，共3分鐘。HRP標(biāo)記的抗M13單抗(1 1000稀釋，Amersham Biosciences公司)37°C孵育1小時(shí)。洗滌方法同上，以TMB(Sigma)為底物檢測結(jié)合的抗M13單抗，450nm檢測光吸收，結(jié)果見圖1。由圖1 可知，這12個(gè)克隆均為陽性克隆。2、rEfb抗原表位的獲得及其活性驗(yàn)證對挑取的20個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行測序，獲得了 7條陽性克隆的展示肽序列(見表 1)。通過比對這些結(jié)合肽序列，申請人發(fā)現(xiàn)(見圖2，；3)。申請人據(jù)此合成了該肽段，其具體的氨基酸序列為YNATGPSPVSQW(SEQ ID NO :1)，命名為SSP。3、SSP與SS患者血清I gG結(jié)合檢測合成肽SSP (每孔0. 5 μ g)包被96孔板(Nunc公司)4°C過夜。傾去不結(jié)合的肽， 3% BSA 37°C封閉1小時(shí)。SS患者或健康人血清樣品1 400稀釋，加入不同孔中，37°C孵育1小時(shí)。洗滌液(PBS-0. 05% Tween 20)洗板5次，共3分鐘。1 1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 37°C孵育1小時(shí)。洗滌方法同上，以TMB(Sigma)為底物檢測結(jié)合的抗M13 單抗，450nm檢測光吸收，結(jié)果見圖2。表1噬菌體展示肽序列測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種干燥綜合征特異性的抗原表位，其具有下述的氨基酸序列 YNATGPSPVSQff
2.一種核苷酸序列，其特征在于編碼權(quán)利要求1所述的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，其可作為組合物的一種組分。
4.權(quán)利要求3的組合物，其特征在于，還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。
5.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，其可作為組合物的一種組分。
6.權(quán)利要求5的組合物，其特征在于，還可以包含藥學(xué)上可接受的載體。
7.權(quán)利要求1所述的抗原表位在干燥綜合征診斷的用途。
8.權(quán)利要求2所述的核苷酸序列在干燥綜合征診斷的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一條新型多肽用于干燥綜合征的診斷。這種多肽抗原的IgG型抗體，在干燥綜合征的診斷中具有很高的敏感性和特異性。
文檔編號A61P37/02GK102477081SQ20101055723
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者劉玉, 楊光, 柳川, 董潔, 高亞萍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所