專利名稱：一種家禽凍干活疫苗耐熱保護(hù)劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及家禽生物制品的凍干耐熱保護(hù)劑及制備方法。
背景技術(shù)：
冷凍干燥技術(shù)是生物學(xué)的一個重要應(yīng)用技術(shù)，常用于生物制品的科研和生產(chǎn)中， 以保持菌、毒種的生物學(xué)特性，穩(wěn)定生物原料和半成品的生物活性，延長成品的有效期。國外活疫苗凍干制品在2 8°C的保存期為12 36個月，但保護(hù)劑配方屬于專利，嚴(yán)格保密。我國同類產(chǎn)品在2 8°C的保存期與國外尚存在差距。我國現(xiàn)常用的獸醫(yī)生物制品保護(hù)劑主要為5%蔗糖脫脂牛奶和1. 5 3%明膠、5 10%蔗糖，制品要求低溫保存(_15°C )，2 8°C僅存3 6個月，在常溫下要求盡快用完，這就為獸醫(yī)生物制品的保存、 運輸、使用等帶來許多困難和不便，同時造成大量的能源浪費和資金流失。從現(xiàn)有的關(guān)于凍干耐熱保護(hù)劑的資料可以知道，國內(nèi)發(fā)明的一些耐熱凍干保護(hù)劑在2 8°C下可以保存M 個月，但是有的保護(hù)劑配方復(fù)雜、成本高、不利于推廣使用，例如中國專利CN1895675A “動物用凍干活疫苗耐熱保護(hù)免疫增強(qiáng)劑及其制備方法”、CN1528457A “雞馬立克氏病火雞皰疹病毒凍干苗耐熱保護(hù)劑及制備工藝”、CN1772302A “雞新城疫活疫苗耐熱凍干保護(hù)劑、 其制備方法及應(yīng)用”、CN1168503C “雞新城疫弱毒凍干疫苗耐熱凍干保護(hù)劑及制備工藝”、 CN1426816A “獸醫(yī)病毒類生物制品耐熱凍干保護(hù)劑及制備工藝”、CN1528458A “雞新城疫、 雞傳染性支氣管炎(H120、H5》二聯(lián)凍干疫苗耐熱凍干保護(hù)劑及制備工藝”等；有的保護(hù)劑配方簡單，成本低，但是只適用于一種疫苗，例如中國專利CN101491680A “雞傳染性法氏囊病活疫苗耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法”;有的專利保護(hù)劑成分不多，但是制備過程既需要高壓滅菌，又需要過濾除菌，例如中國專利CN101474410A ；有的專利配方相對簡單，制備過程也不復(fù)雜，但是成本高，例如中國專利CN101947321A“活疫苗用耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法及新城疫活疫苗”，其中配方中需要海藻糖、維生素C等，成本較高。因此迫切需要一種配方簡單、成本低、制備方法簡便，且可作為多種動物活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種凍干耐熱保護(hù)劑及其制備方法以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的耐熱凍干保護(hù)劑由以下質(zhì)量百分比的各組分組成磷酸二氫鉀 0. 003% -0. 006%,磷酸氫二鈉 0. 01% -0. 03%,氯化鉀 0. 003% -0. 005%,乳糖 7% -8%, 丙氨酸0. 1% -0.3%、組氨酸0.3% _0.5%，剩余成份為蒸餾水。本發(fā)明的凍干耐熱保護(hù)劑，可以由以下質(zhì)量百分比的各組分組成磷酸二氫鉀 0. 003 %、磷酸氫二鈉0.02%、氯化鉀0. 005 %、乳糖8 %、丙氨酸0.2%、組氨酸0.3%，剩余成份為蒸餾水。本發(fā)明的凍干耐熱保護(hù)劑還可以由以下質(zhì)量百分比的各組分組成磷酸二氫鉀0. 005%、磷酸氫二鈉0. 01%、氯化鉀0. 004%、乳糖7%、丙氨酸0. 3%、組氨酸0. 3%，剩余成份為蒸餾水。本發(fā)明提供了制備上述凍干耐熱保護(hù)劑的方法，是將上述各組分混合均勻，用孔徑0. 22 μ m的濾膜過濾除菌即得。本發(fā)明凍干耐熱保護(hù)劑的使用方法，是將本發(fā)明的凍干耐熱保護(hù)劑與家禽疫苗以 1 1的體積比例進(jìn)行配苗。本發(fā)明提供了耐熱保護(hù)劑在保護(hù)家禽凍干活疫苗中的應(yīng)用，是將本發(fā)明的凍干耐熱保護(hù)劑與家禽疫苗以11的體積比例進(jìn)行配苗。上述家禽疫苗為雞新城疫活疫苗、雞傳染性支氣管炎活疫苗或雞傳染性法氏囊活疫苗。本發(fā)明提供的耐熱凍干保護(hù)劑配方中的乳糖能防止有效物質(zhì)隨水蒸氣一起升華飛散，丙氨酸和組氨酸能將疫苗中的活病毒調(diào)整到活性最穩(wěn)定區(qū)域。本發(fā)明通過調(diào)整各種成分的含量，經(jīng)反復(fù)試驗最終確定了保護(hù)劑的配比。采用本發(fā)明制備的耐熱保護(hù)劑保護(hù)效果良好，且配方簡單，制備方法簡便、成本低，適用于多種動物活疫苗，在使用過程中對環(huán)境無污染。家禽活疫苗在2-8°C條件下可保存M個月，能達(dá)到《中華人民共和國獸醫(yī)生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的要求。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1一、試驗材料雞新城疫病毒抗原(La Sota株)和雞傳染性支氣管炎病毒抗原 (H120株)，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；SPF雞胚，由乾元浩南京生物藥廠提供。二、耐熱保護(hù)劑的制備按照下述質(zhì)量百分比的各組分磷酸二氫鉀0. 003%、磷酸氫二鈉0.02%、氯化鉀0. 005 %、乳糖8 %、丙氨酸0.2%、組氨酸0.3%，剩余成份為蒸餾水。配置方法為將上述比例的干物質(zhì)溶于蒸餾水中，用孔徑為0. 22μπι的濾膜過濾除菌即得到凍干耐熱保護(hù)劑。三、保護(hù)劑的毒性試驗用7日齡健康雛雞10只，分別進(jìn)行滴鼻、點眼、飲水及皮下注射10倍使用劑量，觀察20天，雛雞全部健活，且無任何不良反應(yīng)。四、疫苗的制備1、新城疫耐熱保護(hù)劑疫苗的制備將新城疫抗原在SPF雞胚上繁殖，收獲病毒液后，按照1 1的體積比與耐熱保護(hù)劑混合均勻，分裝后進(jìn)行冷凍干燥。同時設(shè)5%蔗糖脫脂牛奶保護(hù)劑對照。疫苗置2 8°C 條件下保存，同時將部分疫苗37°C保存7天。2、傳染性支氣管炎耐熱保護(hù)劑疫苗的制備將傳染性支氣管炎抗原在SPF雞胚上繁殖，收獲病毒液后，按照1 1的體積比與耐熱保護(hù)劑混合均勻，分裝后進(jìn)行冷凍干燥。同時設(shè)5%蔗糖脫脂牛奶保護(hù)劑對照。疫苗置 2 8 °C條件下保存，同時將部分疫苗37°C保存7天。
五、疫苗檢驗按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)(以下簡稱《規(guī)程》)對上述新城疫耐熱保護(hù)劑活疫苗和傳染性支氣管炎耐熱保護(hù)劑活疫苗進(jìn)行檢驗，包括1、產(chǎn)品的物理性質(zhì)2、無菌檢驗按照《規(guī)程》進(jìn)行檢驗，應(yīng)無菌生長。如有菌生長，應(yīng)進(jìn)行雜菌計數(shù)和病原性鑒定、禽沙門氏菌檢驗，應(yīng)符合規(guī)定。每羽份疫苗含非病原菌應(yīng)不超過1個。3、支原體檢驗按照《規(guī)程》進(jìn)行檢驗，應(yīng)無支原體生長。4、外源病毒檢驗按照《規(guī)程》進(jìn)行檢驗，應(yīng)無外源病毒污染。5、特異性檢驗(1)新城疫耐熱保護(hù)劑活疫苗的特異性檢驗將疫苗用生理鹽水作適當(dāng)稀釋(0. 1羽份/0. ImL)，與等量的抗新城疫病毒特異性血清混合，在室溫中和1小時，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚0. lmL。置37°C 孵育120小時。在M 120小時內(nèi)應(yīng)不出現(xiàn)特異性死亡及雞胚病變，至少有8個雞胚健活， 對雞胚液作紅細(xì)胞凝集應(yīng)試驗應(yīng)為陰性。(2)傳染性支氣管炎耐熱保護(hù)劑活疫苗的特異性檢驗將疫苗用生理鹽水作適當(dāng)稀釋(0. 1羽份/0. ImL)，與等量的抗傳染性支氣管炎病毒特異性血清混合，在室溫中和1小時，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚0. 2mL。 置37°C孵育144小時，在M 144小時內(nèi)應(yīng)不出現(xiàn)特異性死亡及雞胚病變，至少有8個雞胚健活。6、安全檢驗(1)新城疫耐熱保護(hù)劑活疫苗的安全性檢驗用7-10日齡SPF雛雞20只，隨機(jī)分成2組，每組10只。其中一組10只每只點眼或口服疫苗10羽份，作為免疫組，另外一組10只不接種，作為健康對照組。同樣條件下，兩組分別隔離飼養(yǎng)，觀察14日，均應(yīng)健活。如有非特異性死亡，兩組總和不應(yīng)超過3只，且免疫組死亡數(shù)不應(yīng)超過對照組。(2)傳染性支氣管炎耐熱保護(hù)劑活疫苗的安全性檢驗用7日齡SPF雞20只，10只各滴鼻接種疫苗10羽份，另10只作對照。觀察10 日，應(yīng)全部健活，且無呼吸異常及神經(jīng)癥狀。任何一組非特異性死亡雞應(yīng)不超過1只，否則重檢1次。7、剩余水分測定按照《規(guī)程》進(jìn)行檢驗，采用真空烘干法，應(yīng)不超過4%。8、病毒含量的測定(1)新城疫耐熱保護(hù)劑活疫苗中病毒含量測定凍干前病毒含量測定用滅菌生理鹽水按實際含病毒液的量進(jìn)行10倍系列稀釋， 取3個適宜稀釋度，分別尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0. lmL，置37°C繼續(xù)孵育，48小時以前死亡的雞胚棄去不計，在48 120小時死亡的雞胚，隨時取出，收獲雞胚液， 將同一稀釋度的雞胚液等量混合，分別測定紅細(xì)胞凝集價。至120小時，取出所有活胚，逐個收獲雞胚液，分別測定紅細(xì)胞凝集價，凝集價不低于1 160(微量法1 128)者判為感染，計算半數(shù)感染量(EID5tl)。凍干后病毒含量測定按瓶簽注明的羽份，將疫苗用滅菌生理鹽水稀釋至1羽份/0. lmL，再作10倍系列稀釋，其他方法同凍干前病毒含量測定。按照《規(guī)程》要求，每羽份病毒含量應(yīng)該不低于106_ ciEID5tlt5(2)傳染性支氣管炎耐熱保護(hù)劑活疫苗中病毒含量測定凍干前病毒含量測定用滅菌生理鹽水按實際含病毒液的量進(jìn)行10倍系列稀釋， 取3個適宜稀釋度，分別尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0. lmL，置37°C繼續(xù)孵育，24小時以內(nèi)死亡的雞胚棄去不計，根據(jù)接種后M 144小時的死胚及144小時的活胚中具有胎兒失水、蜷縮、發(fā)育小等特異性病痕的雞胚總數(shù)計算半數(shù)胚致死量(ELD5tl)。 凍干后病毒含量測定按瓶簽注明的羽份，將疫苗用滅菌生理鹽水稀釋至1羽份 /0. lmL，再作10倍系列稀釋，其他方法同凍干前病毒含量測定。按照《規(guī)程》要求，每羽份病毒含量應(yīng)該不低于103_ 5EID5tltl 9、檢驗結(jié)果，新城疫疫苗檢驗結(jié)果見表1，傳染性支氣管炎疫苗檢驗結(jié)果見表2表1新城疫疫苗檢驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種家禽凍干活疫苗耐熱保護(hù)劑，其特征在于，該凍干耐熱保護(hù)劑由以下質(zhì)量百分比的各組分組成磷酸二氫鉀0. 003% -0. 006%、磷酸氫二鈉0.01% -0. 03%、氯化鉀 0. 003 % -0. 005 %、乳糖 7% -8%,丙氨酸 0. 1% -0. 3%,組氨酸 0. 3% -0. 5%,剩余成份為蒸餾水。
2.如權(quán)利要求1所述的耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于，該凍干耐熱保護(hù)劑由以下質(zhì)量百分比的各組分組成磷酸二氫鉀0. 003 %、磷酸氫二鈉0.02%、氯化鉀0. 005 %、乳糖8 %、 丙氨酸0.2%、組氨酸0.3%，剩余成份為蒸餾水。
3.如權(quán)利要求1所述的耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于，該凍干耐熱保護(hù)劑由以下質(zhì)量百分比的各組分組成磷酸二氫鉀0. 005 %、磷酸氫二鈉0.01%、氯化鉀0. 004 %、乳糖7 %、 丙氨酸0.3%、組氨酸0.3%，剩余成份為蒸餾水。
4.一種制備權(quán)利要求1-3的凍干耐熱保護(hù)劑的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1-3之一所述的各組分混合均勻，用孔徑0. 22 μ m的濾膜過濾除菌即得。
5.權(quán)利要求1-3之一的凍干耐熱保護(hù)劑的使用方法，其特征是將權(quán)利要求1所述的耐熱保護(hù)劑與家禽疫苗以11的體積比例進(jìn)行配苗。
6.權(quán)利要求1-3之一的耐熱保護(hù)劑在保護(hù)家禽凍干活疫苗中的應(yīng)用，包括將權(quán)利要求 1所述的耐熱保護(hù)劑與家禽疫苗以11的體積比例進(jìn)行配苗。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述的家禽疫苗為雞新城疫活疫苗、雞傳染性支氣管炎活疫苗或雞傳染性法氏囊活疫苗。
8.含有權(quán)利要求1-3之一耐熱保護(hù)劑的動物用疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種家禽凍干活疫苗的耐熱保護(hù)劑及其制備方法。本發(fā)明的凍干耐熱保護(hù)劑由以下質(zhì)量百分比的組分組成磷酸二氫鉀0.003％-0.006％、磷酸氫二鈉0.01％-0.03％、氯化鉀0.003％-0.005％、乳糖7％-8％、丙氨酸0.1％-0.3％、組氨酸0.3％-0.5％，剩余成份為蒸餾水。通過將以上各組分混合均勻，用孔徑0.22μm的濾膜過濾除菌，即得本發(fā)明凍干耐熱保護(hù)劑。本發(fā)明耐熱保護(hù)劑對家禽凍干活疫苗的保護(hù)效果良好，可在2-8℃條件下保存24個月，病毒含量均高于《中華人民共和國獸醫(yī)生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的標(biāo)準(zhǔn)，且在使用過程中對環(huán)境無污染。
文檔編號A61K47/16GK102309759SQ201110268149
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者何海蓉, 劉玉云, 周建民, 楊培豫, 楊娟, 祁小莉 申請人:乾元浩生物股份有限公司