專利名稱：開發(fā)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白及靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白治療呼吸道融合病毒引起的發(fā)炎及降低病 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術及農(nóng)業(yè)化學。
背景技術：
一、呼吸道融合瘤病毒(Respiratory Syncytial Virus RSV)的介紹呼吸道融合瘤病毒(Respiratory Syncytial Virus RSV)是造成嬰兒及幼童嚴重的病毒性支氣管炎及病毒性肺炎等急性病毒性呼吸道疾病的主要原因。其是一種RNA病毒，和腿腺炎病毒，德國麻疫病毒同屬副黏液病毒(Paramyxovirus),在多種不同組織中培養(yǎng)都可產(chǎn)生特別的細胞融合現(xiàn)象(syncytial cytopathology),侵入呼吸道后會引起氣管上皮細胞壞死、黏液分泌、發(fā)炎細胞浸潤、黏膜下層水腫。呼吸道融合瘤病毒特別喜歡感染 具有纖毛的呼吸道表皮細胞，在呼吸道會造成細支氣管的阻塞與發(fā)炎以及黏膜下層細胞的浸潤，出現(xiàn)呼氣時間延長、肺膨脹不全(atelectasis)及肺炎等癥狀。在老年人及免疫不全的病人中，呼吸道融合瘤病毒同樣會引起嚴重的呼吸道疾病。從公共衛(wèi)生的觀點來看，世界各國的衛(wèi)生組織及政府的衛(wèi)生單位，都把制作呼吸道融合瘤病毒疫苗列為當前防治病毒感染的重要工作之一。呼吸道融合瘤病毒是副黏液病毒科(Paramyxoviridae),肺炎病毒屬(Pneumovirus),具有外套膜(envelope),其基因組為單股(-)RNA,由15，222個核酸組成，包含10段的mRNA。這些mRNA可以轉譯出11種已經(jīng)被確認存在的蛋白質(zhì)，包括4種核蛋白殼蛋白質(zhì)(nucleocapsid protein),分別命名為 nucleocapsid N protein、phosphoprotein P、 large polymerase subunit transcription elongation factorM2-1 ;3種穿透膜的外套醣蛋白質(zhì)，分別是fusion F protein、attachment G protein及small hydrophobic SH protein ;2 種非結構蛋白質(zhì) NS1、NS2 ;1 種基質(zhì)蛋白質(zhì) M protein以及目前推測為負調(diào)控因子的M 2-2等蛋白質(zhì)。目前功能不明確的有NS1、NS2及SH蛋白質(zhì)等。根據(jù)過去科學家們發(fā)展呼吸道融合瘤病毒疫苗的試驗結果，我們可以歸納出死毒疫苗(inactivated vaccine)引發(fā)的免疫反應是Th 2 T-helper cell—系列的反應,會使得下呼吸道(指支氣管、肺臟等部位)的病情更加嚴重，因為Th 2 T-helper cell產(chǎn)生的細胞激素IL-4、IL-IO等，會引起更嚴重的細胞浸潤現(xiàn)象，加重并且加速病情。以臺灣北部地區(qū)流行病學調(diào)查2001/01-2005/12每二年的春秋季為罹患此病高峰期(Lee et al.，2007)，目前并無特效藥多為支持性療法。并且若以glucocorticoids治療并無法改善其癥狀(Patelet al.，2008)。而利用我們在這次研究執(zhí)行中發(fā)現(xiàn)FlP-fve可能可以誘導出有效抑制病毒感染及減輕呼吸道疾病病情的Th I T-helper cell的反應，是符合我們所要求的發(fā)展臨床藥物的有效方法。二、真菌類免疫調(diào)節(jié)蛋白的功能在一些食用菇類，如靈芝、草菇及金針菇中所純化分離出來的蛋白質(zhì)，他們具有類似的胺基酸序列及免疫調(diào)節(jié)功能，我們以將此種類的蛋白質(zhì)，命名為真菌類免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(Fungal immunomodulatory proteins, FIPs) (Hsu et al. , 1997 ；Ko et al. , 1995 ；Lin et al.，1997)。尤其以靈芝在傳統(tǒng)中藥已成為翹楚，對維持人體健康，有莫大作用。過去研究發(fā)現(xiàn)它具有抗過敏發(fā)炎(Lee et al. , 2001)、保護肝臟功能(Shieh et al. ,2001) >抗腫瘤及增強免疫功能，但大多局限于粗萃取物(Cuella et al.，1996)研究，或小分子化合物研究(Lai et al. ,2001 ；Zhang et al.，2002)。直到1989年日本明治制藥從靈芝中純化得一免疫調(diào)節(jié)功能蛋白，LZ8 (Kino et al.，1989)，實驗結果發(fā)現(xiàn)LZ-8可以明顯的抑制全身性過敏反應，治療肝炎及預防糖尿病，我們實驗室最近發(fā)現(xiàn)靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白抑制肺癌細胞終端酶活性(Liao et al.，2006 ；Liao et al.，2007)并造成肺癌細胞衰老(Liaoet al. ,2008)可發(fā)展治療肺癌并已協(xié)助益生生技開發(fā)股份有限公司申請專利。LZ8具有mitogenic能力，且可抑制CFW老鼠由牛血清蛋白BSA所引起的anaphylaxis。本計劃主持人曾自另一可食用的菇類-金針菇(FlP-fve)發(fā)現(xiàn)與LZ8及免疫球蛋白的重鏈區(qū)的蛋白質(zhì)結構有相當程度的相似性，且二級結構多為b-Sheet，而測量其對于人類淋巴球細 胞增殖能力時，當FlP-fve濃度為100微克/毫升時(Ko et al.，1995)，其增殖能力達到最強。而注射FlP-fve蛋白質(zhì)于老鼠體內(nèi)，其劑量為8毫克/公斤體重時，具有抑制BSA所引起的systemic anaphylaxis反應。在老鼠足趾腫脹實驗中預先腹腔注射FlP-fve蛋白質(zhì),齊[J量為5毫克/公斤體重時，即可減小compound 48/80所引起的發(fā)炎反應。由以上實驗結果得知此蛋白質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)活性，經(jīng)進一步研究免疫調(diào)節(jié)的機轉是為促進IFN-Y及TNF-α基因的轉錄作用。其中真蕈類免疫調(diào)節(jié)功能蛋白研究較透澈的為靈芝，此免疫調(diào)節(jié)功能蛋白質(zhì)會促進 ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1)的表現(xiàn)(Haak-Frendscho et al.,1993)，并明顯增加IFN- Y，因此靈芝增加⑶2表現(xiàn)，引起rosette形成，所以靈芝可借著調(diào)節(jié)immunocompetent cell上adhesion分子來表現(xiàn)其藥性。而靈芝屬菌株中，依許瑞祥博士論文中分離區(qū)別鑒定 G. applanatum. ，G. formosanum. ，G. fornicatum. ，G. Iucidium,G. tropicum及G. tsugae等數(shù)種靈芝。每種菌種間其免疫調(diào)節(jié)活性差異相當大，目前G. Iucidium及G. tsugae與本研究者發(fā)現(xiàn)的FlP-fve已被證實具有免疫調(diào)節(jié)功能,另本研究團隊已同時在今年開發(fā)新的免疫調(diào)節(jié)功能蛋白能力。在蕈類植物中，他們的子實體或菌絲體中，有一些在蕈類植物中，它們的子實體或菌絲體中有一些親醣蛋白質(zhì)(lectins),會促進淋巴球的增殖；相反的,有些則會抑制淋巴球的增殖。包括松鸞科的Agaricus bisporus (Koyama et al. , 2002),分子量為64kDa,由4個次單元體構成，會抑制癌細胞U937增殖甚至造成細胞凋亡(Apoptosis)。這些親醣蛋白質(zhì)皆具有凝集細胞的能力。蕈類中親醣蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)上所結合的醣類多不相同，猴頭燕 Hericium erinaceum(Kawagishi et al. , 1994)上的醣類是屬于 sialic acid 結合，Laetiporus sulfurens (Yoshikawa et al. , 2001)是N_acetyllactosamine 結合,可倉泛促進細胞表面受體的結合，而親醣蛋白質(zhì)對于免疫調(diào)節(jié)功能方面，不同種親醣蛋白質(zhì)與不同種抗體或細胞結合能力不太一樣,如Agaricus bisporus會與Ig A結合(Irazoqui et al.,1997) ;L_selectin 促使 neutrophil 凝集；C. albicans 所純化得 manoprotein 亦會降低IL-8與其IL-8receptor結合能力，減緩由IL-8所造成的發(fā)炎反應(Kemeny et al. , 1998)。因此本研究主要擬探討此類凝集蛋白是否可透過減緩發(fā)炎反應的免疫調(diào)節(jié)功能免疫功能，減輕RSV的傷害。
三、金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白與靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白由金針燕(Flammulina velutipes)子實體經(jīng)由陽離子交換樹脂CM-52純化后所得到的蛋白FlP-fve (Fungal immunomodulatory protein),是具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)。由之前的實驗得知 FIP-fve可以使正常人類外圍血液的淋巴球(HPBMCs)以及Balb/c老鼠的脾臟細胞誘發(fā)IFN-Y的產(chǎn)生,并且對細胞有proliferation的能力。而由FlP-fve所誘發(fā)的IFN-Y是屬于Thl細胞所誘發(fā)的細胞激素，可以抑制Th2細胞所產(chǎn)生的細胞激素。重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白是由將靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因置入面包酵母菌，進一步純化得到13kDa的蛋白。因此在免疫系統(tǒng)上具有降低由Th2cytokine調(diào)控IgE、mast cell等所引起的過敏反應，包括慢性氣喘、呼吸道發(fā)炎等等。因此本篇研究以FlP-fve (100 μ g/ml)刺激 HPBMCs 使 p38 及 ERK(extracellular signal-regulated protein kinase)憐酸化最明顯，但不會活化 JNK (the c-Jun NH2-terminal kinase),并且預先處理 p38MAPkinase的抑制劑SB203580(10yM)可以抑制p38的磷酸化。同時證明以FlP-fve (100 μ g/ml)處理HPBMCs 48小時會明顯產(chǎn)生IFN- Y，而且誘導也會受到SB203580、LY294002 (PI3_kinase的抑制劑)以及U0126(MEKl/2的抑制劑)所抑制。除了由金針菇子實體純化的FlP-fve蛋白有誘發(fā)IFN-γ的能力以外，重組的FlP-fve融合蛋白(recombinant FlP-fve)也有FlP-fve將近一半的活性。本實驗說明了 FlP-fve調(diào)控IFN-Y的機制是可以透過p38 MAPkinase pathway及ERK的活化途徑,而不是經(jīng)由活化JNK途徑。FlP-fve所誘發(fā)高量的IFN-Y卻可以藉由抑制TH2細胞所產(chǎn)生的細胞激素的生成，并期望將來可以應用在基因免疫的預防治療上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白作為制備治療呼吸道融合病毒活性的藥物應用。本發(fā)明提供一種口服真蕈類免疫調(diào)節(jié)蛋白，包含金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白或靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白，可抑制RSV所導致的呼吸道過度反應。金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白可抑制RSV所誘導的NF- K B的磷酸化與進入細胞核?？诜疳樄矫庖哒{(diào)節(jié)蛋白可抑制RSV所誘導的發(fā)炎反應相關激素及降低病毒的表現(xiàn)量。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)金針菇蛋白FlP-fve具有降低RSV感染，進而減少NF- κ B路徑相關的發(fā)炎物質(zhì)產(chǎn)生的療效。


圖IA 為實驗動物 RSV (Respiratory Syncytial Virus)致敏及灌食 FlP-fve 實驗流程；圖IB為以12% SDS PAGE電泳膠圖呈現(xiàn)純化后結果。圖2為以空斑計數(shù)試驗觀察金針菇與靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白對于RSV所導致的細胞空斑的影響。圖3為以免疫熒光染色觀察FlP-fve對于RSV感染力的影響。圖4為以酵素免疫吸附試驗評估FlP-fve對于RSV感染力的影響。圖5為以RT-PCR偵測RSV和IL_4mRNA表現(xiàn)量。
圖6為以ELISA偵測IL-6分泌量。圖7為以西方墨點法評估FlP-fve對于RSV所導致的NF- κ B和I κ B α磷酸化的影響。圖8為以免疫熒光染色觀察FlP-fve對于RSV感染后NF- κ B進入細胞核情形的影響。圖9為經(jīng)由RSV刺激后，細胞內(nèi)的IKK復合體會將I κ B磷酸化，而被磷酸化的I κ B會降解，使NF- κ B被釋放，另一方面，NF- κ B也同時被IKK復合體磷酸化并進入細胞核中，NF-κ B進入細胞核后會鍵結到許多發(fā)炎物質(zhì)相關基因(例如IL-4)的轉錄位置上，基因表現(xiàn)就會被啟動，而使得被感染的細胞產(chǎn)生發(fā)炎反應。圖10為觀察金針菇與靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白對于感染RSV小鼠呼吸道過度反應的影響。圖11為觀察金針菇與靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白對于感染RSV小鼠肺部IL-6含量的影響。主要組件符號說明AHR呼吸道過度反應測定Methacholine (mg/ml)乙酸甲膽喊Penh肺功能指針Control 控制量RSV呼吸道融合病毒FIP-fve/RSV免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-gts/RSV 靈芝蛋白
具體實施例方式呼吸道融合病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病毒，由于其感染機制目前尚未明確，因此無法發(fā)展有效的疫苗或治療方式。FlP-fve為一個從金針燕(Flammulina velutipes)純化出來的免疫調(diào)節(jié)蛋白，分子量大小為13kDa，被歸類在真菌類免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIPs)，此類的蛋白具有調(diào)控IFN-Y增力口，減少過敏發(fā)炎的功效。本發(fā)明以金針菇蛋白FlP-fve處理于感染RSV病毒的HEp-2細胞株，并分別以下列方式來偵測病毒表現(xiàn)量I.空斑計數(shù)試驗(plaque assay)2.免疫突光染色法(Immunofluorescence)3.酵素免疫吸附試驗(ELISA)4.聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)5. BUXCO SYSTEM-AHR6.實驗動物七周大BALB/c母鼠由財團法人國家動物中心提供，并飼養(yǎng)于中山醫(yī)學大學實驗動物中心。請參閱圖1A,為實驗動物RSV(Respiratory Syncytial Virus)致敏及灌食FlP-fve實驗流程，圖IB為以12% SDS PAGE電泳膠圖呈現(xiàn)純化后結果，金針菇蛋白分子量位于13kDa。M表示marker, C表示粗萃取物，fve表示純化出的金針燕免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-fve。請參閱圖2，為以空斑計數(shù)試驗觀察金針菇與靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白對于RSV所導致的細胞空斑的影響。在12孔培養(yǎng)皿中種3X IO5顆HEp-2細胞，隔天分別前處理不同濃度的蛋白2小時后，再感染RSV I小時，并以O. 75%甲基纖維素覆蓋之，6天后以結晶紫染色觀察空斑形成的情形。請參閱圖3，為以免疫熒光染色觀察FlP-fve對于RSV感染力的影響。在人類肺癌上皮細胞A549中前處理200 μ g/ml金針菇蛋白2小時后，再感染不同劑量的RSV 48小時，并以專一性熒光抗體偵測RSV，藍色熒光部分為細胞核，綠色熒光為RSV。請參閱圖4，為以酵素免疫吸附試驗評估FlP-fve對于RSV感染力的影響。在人類肺癌上皮細胞A549中分別前處理0，50，100，200 μ g/ml金針菇蛋白2小時后，再感染不同劑量的RSV，72小時后以丙酮固定細胞，并使用專一性RSV抗體結合，最后以波長450nm偵 測吸光值。請參閱圖5，為以RT-PCR偵測RSV和IL_4mRNA表現(xiàn)量。在人類喉癌細胞HEp_2中分別前處理0，50，100 μ g/ml金針菇蛋白2小時后，再感染RSV (moi = O. 1),48小時后純化出mRNA并以RT-PCR的方式偵測其RSV和IL-4基因表現(xiàn)量。請參閱圖6，為以ELISA偵測IL-6分泌量。在人類喉癌細胞HEp_2中分別前處理0,100,400 μ g/ml金針菇蛋白2小時后，再感染RSV(moi = 3)，24小時后收取培養(yǎng)液并以ELISA的方式偵測其IL-6濃度。 請參閱圖7，為以西方墨點法評估FlP-fve對于RSV所導致的NF- κ B和I κ B α磷酸化的影響。在Α549肺癌上皮細胞中感染RSV，并給予200 μ g/ml金針菇蛋白，分別在4小時與8小時后分離出細胞中總蛋白，并以西方墨點法觀察磷酸化NF- κ B (P-NF- κ B)與磷酸化ΙκΒα (ρ-Ι κ B α )的蛋白表現(xiàn)量。請參閱圖8，為以免疫熒光染色觀察FlP-fve對于RSV感染后NF- κ B進入細胞核情形的影響。在人類肺癌上皮細胞Α549中前處理200 μ g/ml金針菇蛋白2小時后，再感染不同劑量的RSV 24小時，并以專一性熒光抗體偵測RSV，藍色熒光部分為細胞核，紅色熒光為 NF-κ B。請參閱圖9，為經(jīng)由RSV刺激后，細胞內(nèi)的IKK復合體會將I κ B磷酸化，而被磷酸化的I κ B會降解，使NF- κ B被釋放，另一方面，NF- κ B也同時被IKK復合體磷酸化并進入細胞核中，NF-κ B進入細胞核后會鍵結到許多發(fā)炎物質(zhì)相關基因(例如IL-4)的轉錄位置上，基因表現(xiàn)就會被啟動，而使得被感染的細胞產(chǎn)生發(fā)炎反應。而本研究的結果展現(xiàn)出FlP-fve可能具有降低RSV感染，進而減少發(fā)炎物質(zhì)產(chǎn)生的潛力。請參閱圖10，為觀察金針菇與靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白對于感染RSV小鼠呼吸道過度反應的影響。預先給予每只小鼠口服200ug的金針菇蛋白或50 μ g靈芝蛋白每12小時一次，48小時后以鼻腔滴定方式給予IO8PFU的RSV病毒，并持續(xù)給予口服蛋白，致敏后第6天將小鼠暴露在不同濃度分別為O (saline)、5、10、20和40mg/ml的霧狀methacholine中，并進行小鼠呼吸道過度反應測定(AHR)。請參閱圖11，為觀察金針菇與靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白對于感染RSV小鼠肺部IL-6含量的影響。預先給予每只小鼠口服200 μ g的金針菇蛋白或50 μ g靈芝蛋白每12小時一次，48小時后以鼻腔滴定方式給予108PFU的RSV病毒，并持續(xù)給予口服蛋白，致敏后第6天收集小鼠肺部灌洗液并以ELISA偵測IL-6濃度。通過以上實驗發(fā)現(xiàn)在處理FlP-fve后能夠有效抑制RSV病毒的感染。另一方面，過去有研究指出，RSV會刺激細胞中I κ B α的磷酸化和降解，而促使NF- κ B進入細胞核中并結合到基因的轉錄因子鍵結區(qū)上，使細胞產(chǎn)生發(fā)炎反應。在本發(fā)明中，以西方墨點法偵測I κ B α和NF- κ B蛋白的磷酸化，發(fā)現(xiàn)處理FlP-fve后，兩者磷酸化蛋白的表現(xiàn)量都有被抑制的情形，進一步以共軛焦顯微鏡觀察NF- κ B在細胞中的分布情況，結果顯示，F(xiàn)lP-fve能明顯減少由RSV所導致的NF- κ B進核，而NF- κ B相關的發(fā)炎因子IL-4表現(xiàn)量也明顯下降。綜合以上實驗結果，發(fā)現(xiàn)金針菇蛋白FlP-fve具有降低RSV感染，進而減少NF- κ B路徑相關的發(fā)炎物質(zhì)產(chǎn)生的療效。最后，以BALA/C小鼠進行動物模式，發(fā)現(xiàn)口服金針菇蛋 白的小鼠，可抑制以鼻腔滴定RSV病毒后所引發(fā)的氣喘現(xiàn)象。
權利要求
1.口服真蕈類免疫調(diào)節(jié)蛋白，包含金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白或靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白，可抑制RSV所導致的呼吸道過度反應。
2.金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白可抑制RSV所誘導的NF-K B的磷酸化與進入細胞核。
3.口服金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白可抑制RSV所誘導的發(fā)炎反應相關激素及降低病毒的表現(xiàn)量。
全文摘要
本發(fā)明以金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve處理于感染RSV病毒的HEp-2細胞株，發(fā)現(xiàn)在處理FIP-fve后能夠有效抑制RSV病毒的感染。另一方面，以西方墨點法偵測IκBα和NF-κB蛋白的磷酸化，發(fā)現(xiàn)處理FIP-fve后，兩者磷酸化蛋白的表現(xiàn)量都有被抑制的情形，進一步以共軛焦顯微鏡觀察NF-κB在細胞中的分布情況，結果顯示，F(xiàn)IP-fve能明顯減少由RSV所導致的NF-κB進核，而NF-κB相關的發(fā)炎因子IL-4表現(xiàn)量也明顯下降。綜上發(fā)現(xiàn)金針菇蛋白FIP-fve具有降低RSV感染，進而減少NF-κB路徑相關的發(fā)炎物質(zhì)產(chǎn)生的療效。最后，以BALA/C小鼠進行動物模式，發(fā)現(xiàn)口服金針菇蛋白的小鼠，可抑制以鼻腔滴定RSV病毒后所引發(fā)的氣喘現(xiàn)象。
文檔編號A61K36/074GK102949707SQ201110249738
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權日2011年8月23日
發(fā)明者柯俊良, 張語琦 申請人:柯俊良