專利名稱：使用人參皂苷Ro或含有該皂苷的植物提取物促進(jìn)膠原蛋白合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用人參皂苷R0或其中存在有該皂苷的植物提取物制備化妝品或藥物組合物，特別是皮膚科藥物組合物，以刺激膠原蛋白特別是膠原蛋白I和膠原蛋白III的合成。另外還進(jìn)一步涉及含有人參皂苷R0或其中存在有該皂苷之植物提取物的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基。
人參屬植物的許多品種都是已知的，其中最好已知品種是—人參(panax ginseng(C.A.Meyer))，其為最常作為藥用的人參屬植物。
—三七(Panax notoginseng)，—人參三七(Panax pseudo-ginseng)(himalaicus亞種)—竹節(jié)人參(Panax japonicus)(major變種，angustifolius變種)，—西洋參(Panax quinquefolium)，—Panax trifolius—Panax zingiberensis，和—Panax stipuleanatus。
其中人參(Panax ginseng)似乎是最富含皂苷并最為有效的。
人參屬植物主要原產(chǎn)于三個國家—日本—中國—朝鮮。
在這些不同地區(qū)培養(yǎng)的品種可能稍有差異并接觸到不同的地理氣候條件。
但發(fā)現(xiàn)例如品質(zhì)最好的人參是產(chǎn)在中國的，其次是產(chǎn)自日本的。
人參塊莖在4至6年內(nèi)成熟。6年令塊基達(dá)到最佳品質(zhì)。
發(fā)現(xiàn)在植物的不同部分有完全不同的皂苷含量。最常用的根部，并且一般是有最大活性的。
發(fā)現(xiàn)在根的末端(日本語稱為ninjin)和發(fā)根(日本語稱為Ken-injin)中有最高的皂苷含量。
在人參屬植物中最常遇到的皂苷達(dá)瑪烷型的。但在人參皂苷中有一種具有下示齊墩果烷結(jié)構(gòu)的特殊皂苷，即人參皂苷R0或稱Chikusetsusaponin V 其中第3位的取代基R1由兩個連接在一起的糖，即由符號 代表的β-D-葡糖醛酸吡喃糖苷和β-D-吡喃葡糖基組成，28位上的取代基R2是由符合Glc代表β-D-吡喃葡糖基。
如文獻(xiàn)(MORITA T.，KASAI R.，KOHDA H.，TAHAKAO.，ZHOU J.，TSUNG-REN Yang，Chemical and Morphologicalstudy on Chinese Panax japonicus C.A.MEYER，Chem.Pharm.Bull.，1983，31，9-3205-2309)中所述，在Panax japonicus(日本產(chǎn)的)和中國產(chǎn)的竹節(jié)人參、以及P.japonicus var.mayor和P.japonicus var.angustifolius中有很高比例的這種人參皂苷。
在日本，竹節(jié)人參也稱為Chikusetsu Ninjin。1979年KONDON.，MARUMOTOY.，和SHOJIJ.(Studies on the constituents ofPanacis Japonici Rhizoma IV，The structure of chikusetsusaponin V.，Chem.Pharm.Bull.(1971)19(6)，1103-1107)描述了Chikuset-susaponin V的結(jié)構(gòu)。
可以按照J(rèn).SHOJI在Advances in Chinese Medicinal MaterialResearch 1985，p.455 et seq，中所述的方法提取這種天然分子。
下列文獻(xiàn)中已描述了人參皂苷，特別是人參皂苷R0在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用—Li，Jingbo等人在白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報1992，18(1)，24-26中描述了包括人參皂苷R0在內(nèi)的不同人參皂苷的抗病毒活性；—日本專利JP04 005 235(1992)中描述了使用人參皂苷治療肝炎；—日本專利JP55 122 721描述了使用人參皂苷R0作為抗糖尿病劑；—Kuo S.C.等人(Planta Med.1990，56(2)，164-167)描述了其作為血小板凝集抑制劑的應(yīng)用；—Planta Med.1990，56(1)，19-23描述了其作為抗炎劑的應(yīng)用。
另一些文獻(xiàn)中還描述竹節(jié)人參提取物在化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用。對此可列出下列文獻(xiàn)—日本專利JP61 047 411中描述了使用這種提取物促進(jìn)頭發(fā)生長，—日本專利JP62 093 217中描述了使用竹節(jié)人參提取物作毛發(fā)強(qiáng)壯劑；—日本專利JP61 289 008涉及含竹節(jié)人參根之提取物連同粘多糖的化妝品組合物。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，人參皂苷R0和含有該皂苷的植物提取物對膠原蛋白，特別是I和III型膠原蛋白(以下分別縮寫為“膠原蛋白I”和“膠原蛋白III”)的合成具有令人驚奇的刺激活性，因而使之特別適用于對抗皮膚老化作用以及強(qiáng)化皮膚或改善傷口愈合。
事實上，皮膚外觀特別是皮膚機(jī)械性質(zhì)的改變基本上是由于皮膚成分的改變所致。
現(xiàn)已知道，I型膠原蛋白占皮膚總膠原蛋白的80-90％，其余大約10-15％的皮膚總膠原蛋白主要是III型膠原蛋白。I型和III型膠原蛋白與皮膚內(nèi)纖維的形成有著很密切的關(guān)系(BOREL J.P.，MONBOISSE J.C.，C.R.Soc Biol.(1993)，181，124-142；LAPIERE C.M.，Br.J.Dermatol.(1990)，122，5-11)。
已報導(dǎo)在人老化期間皮膚中膠原蛋白I和III的比例顯著降低(DUMAS M.，CHAUDAGNE C.，BONTE F.，MEYBECK A.，Mech.Ageing Dev.(待出版)，VIEELLARO-ZUCCARELLUL.，GARBELLI R.，DAL POZZO ROSSI V.，Cell Tissue Res.，(1992)，268，505-511)。有人觀察到，隨著年令增長編碼膠原蛋白的I和III之基因的表達(dá)降低，從而進(jìn)一步證實了上述結(jié)果(CHENY.Q.，MAUVIER R.，TAN E.M.，VITTOJ.，J.Invest.Derma-tol.(1993)，100，535)。
局部應(yīng)用糖皮質(zhì)醇等治療處理也可誘導(dǎo)皮膚中膠原蛋白I和III之比例的降低(OIKARINEN A.，AUTIO P.，KIISTALA U.，RISTELLI L.，RISTELI J.，J.Invest.Dermatol.，(1992)，98，220-225)。
因此，不管其初始原因如何，即不管是隨天然老化發(fā)生的，還是因藥物或紫外光照射等病理條件誘發(fā)的，均可按照本發(fā)明刺激膠原蛋白合成，以減緩甚至停止膠原蛋白I和III之比例的降低。
因此本發(fā)明的主要目的是解決技術(shù)問題，其在于提供一種在防止或治療皮膚老化作用及強(qiáng)化皮膚或改善傷口愈合中具有良好效力的化妝品或藥物組合物，特別是皮膚科藥物組合物的新的配方。
根據(jù)第一個特征，本發(fā)明涉及使用人參皂苷R0或其中存在有該皂苷的植物提取物制備用刺激膠原蛋白，特別是膠原蛋白I和/或膠原蛋白III合成的化妝品或藥物組合物，特別是皮膚科藥物組合物。
根據(jù)一個附加特征，上述組合物可用于預(yù)防或治療因光化學(xué)原因或自發(fā)(按年月順序)發(fā)生的皮膚老化作用。
根據(jù)另一個附加特征，上述組合物可用于促進(jìn)皮膚組織系統(tǒng)的形成。
根據(jù)再一個附加特征，該組合物可用于愈合皮膚傷口。
如果組合物包括含有人參皂苷R0的植物提取物，則該植物提取物較好得自日本的竹節(jié)人參、中國的竹節(jié)人參、竹節(jié)人參mayer變種或竹節(jié)人參angustifolius變種，特別是得自這些植物的根。
根據(jù)本發(fā)明的一個特別優(yōu)越的附加特征，上述提取物是經(jīng)用乙醇等極性溶劑在回流下提取而從根中制得的。
根據(jù)另一個附加特征，可經(jīng)用石油醚提取，然后再次用極性溶劑如乙醇提取，并用丙酮沉淀而從根中制得植物提取物。
根據(jù)另一個附加特征，可用產(chǎn)生含至少1％人參皂苷R0之提取物的任何方法制得植物提取物。
可按照本發(fā)明使用的化妝品組合物可用于刺激膠原蛋白，特別是膠原蛋白I和/或膠原蛋白III的合成，并含有作為活性成分的化妝品有效量的人參皂苷R0或其中存在有該皂苷的植物提取物。
該組合物特別適用于促進(jìn)皮膚組織系統(tǒng)的合成，強(qiáng)化皮膚及愈合皮膚傷口。
因此其特別適于阻止皮膚老化或堅固皮膚。
這種組合物可優(yōu)先用作例如防正皺紋出現(xiàn)或降低皺紋深度的組合物。
可按照本發(fā)明使用的藥物組合物可用于改善傷口愈合或治療伴隨有膠原蛋白不足的有害病理狀態(tài)。
根據(jù)另一個特征，本發(fā)明進(jìn)一步涉及化妝品處理或治療處理，特別是對哺乳動物，尤其是人進(jìn)行皮膚科處理的方法，所說方法的特征在于給所說的哺乳動物投用化妝或治療有效量的人參皂苷或其中有該皂苷的植物提取物，以刺激膠原蛋白特別是膠原蛋白I和/或膠原蛋白的合成，特別是促進(jìn)皮膚組織系統(tǒng)的合成或堅固皮膚。
根據(jù)該方法的一個優(yōu)選實施方案，以改善愈合或治療不同起因的膠原蛋白不足的有效量投用人參皂苷R0或其中有該皂苷的植物提取物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將從本說明書全文和權(quán)利要求中更清楚地了解到本發(fā)明方法的其他附加特征。
在下述各特征中，較好基于所說組合物之總重量以0.001至5％(重量)的濃度使用人參皂苷R0。
這一濃度較好為所說組合物總重量的0.001至1％(重量)。
根據(jù)本發(fā)明的一個特別有價值的附加特征，本發(fā)明的組合物還含有百 (Centella asiatica)提取物、asiatic acid、madecassic acid或積雪草苷。
其中還最好包含馬栗提取物、假葉樹提取物、madecassoside、常春藤皂苷、sericoside，α-羥基酸、α-酮戊二酸、抗壞血酸、脯氨酸、L-羥基脯氨酸、賴氨酸、羥基賴氨酸、甘氨酸或forskolin，其衍生物或含有這些成分的植物提取物。
其中最好還包括膠原蛋白抑制劑或膠原蛋白酶生物合成的抑制劑，例如視黃酸。
在本發(fā)明的框架內(nèi)，較好用對膠原蛋白合成提供刺激作用的常規(guī)方法投用人參皂苷或其中存在有該皂苷的植物提取物。給藥的最簡單的方法是局部給藥，特別是當(dāng)旨在合成皮膚組織系統(tǒng)，堅固皮膚和愈合皮膚傷口時。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選附加方面，將人參皂苷R0或其中存在有該皂苷的植物提取物摻入到化妝品和藥物上可接受的，特別是皮膚科可接受的賦形劑、載體中。這樣的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且也可見于如下述有通用范圍的化妝品組合物或藥物組合物，特別是皮膚科藥物組合物的實施例中。
根據(jù)另一個特征，本發(fā)明涉及使用人參皂苷R0或其中存在有該皂苷的植物提取物作為刺激膠原蛋白I和/或膠原蛋白III合成的藥劑。
本發(fā)明特別涉及使用人參皂苷R0或其中存在有該皂苷的植物提取物作為用于改善成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中膠原蛋白I和/或III合成之培養(yǎng)基的成分。
該藥劑可用于任何成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中，特別是其中成纖維細(xì)胞被包含于基質(zhì)，特別是聚合物基質(zhì)中的培養(yǎng)基中。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及刺激膠原蛋白I和/或膠原蛋白III合成的方法，該方法包括將人參皂苷或含有該皂苷的植物提取物引入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中。
在該方法中，最好將0.001至0.1％的人參皂苷R0導(dǎo)入由E199-C表示的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基是將濃度為2mmol/L的L-谷氨酰胺加入E199培養(yǎng)基(GIBCO)中制得的。
上述含有人參皂苷R0的植物提取物也可用于制備上述培養(yǎng)基。
從下列幾個實施例的解釋性描述將會進(jìn)一步了解本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點，這些實施例只是舉例說明本發(fā)明，因而不能以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
除非特別指出，實施例中的百分比都是重量百分比。就提取物來說，其量以干重表示。實施例1提取物的制備對竹節(jié)人參(C.A.Meyer)的根進(jìn)行提取。
將根研碎后，在回流下用甲醇提取4小時以得到褐色漿狀物。產(chǎn)率約為33％，人參皂苷的含量約為25％。實施例2提取物的制備使用竹節(jié)人參((C.A.Meyer)的根。
在Soxhlet裝置中，用140ml石油醚將38.56g研碎的根提取12小時。
在Soxhlet裝置中，用130ml甲醇將殘留物再次提取20小時。
在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，將130ml甲醇真空濃縮到45ml。
冷卻后，在孔隙度0.45微米的Millex SR上過濾溶液。
將所得到的溶液一次加到500ml無水丙酮中，濾出所得到的米色沉淀物，用無水丙酮洗并在烘箱中45℃干燥之。
結(jié)果得到13g淺米色粉末(產(chǎn)率15.9％)。人參皂苷的含量約為35％。
實施例3證明對膠原蛋白I合成的刺激作用a)方法處理和不處理從—50歲婦女面部收集的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物，用ELISA方法檢測膠原蛋白I的合成。
a.1)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物在由E199-C培養(yǎng)基和10％胎牛血清組成的培養(yǎng)基中，在含5％CO2的飽和濕度大氣環(huán)境下，于37℃將成纖維細(xì)胞人工培養(yǎng)至單層融合。
用含有0.1％胰蛋白酶和0.02％EDTA，并緩沖至pH 7.2的等滲溶液使細(xì)胞脫粘附后，將細(xì)胞接種于96孔微滴定板(FALCON)中，在含2％血清的199-C培養(yǎng)基中每孔接種104個細(xì)胞。
24小進(jìn)后換培養(yǎng)基，在有或沒有試驗產(chǎn)物的情況下，加入沒有血清并含25μM抗壞血酸鈉的同樣培養(yǎng)基(保溫培養(yǎng)基)，保溫48小時。以不同的濃度將溶解于DMSO中的產(chǎn)物加到培養(yǎng)基中。
a.2)膠原蛋白I的檢測借助ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)檢測在有或沒有人參皂苷產(chǎn)物的情況下，保溫48小時后分泌到培養(yǎng)基中的膠原蛋白I的量。
收集保溫培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到含有蛋白酶抑制劑的微量滴定板(Nunc Immunoplate)小孔內(nèi)。4℃保溫24小時以使膠原蛋白粘附在塑料表面上。然后用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗平板。
加入血清白蛋白4℃下保溫24小時以防止非特異性抗體—塑料結(jié)合，然后于22℃下經(jīng)1.5小時加入抗人膠原蛋白I免抗體(In-stitut Pasteur，Lyon，F(xiàn)rance)。用PBS淋洗后，加入與堿性磷酸酶結(jié)合的抗兔IgG羊抗體(INTERCHIM，Montlucon，F(xiàn)rance)以顯示結(jié)合的抗體，其中存在磷酸對位硝基苯酯時所說的堿性磷酸酶將催化產(chǎn)生在405nm有吸收的對位硝基苯酚。
使用在相同實驗條件下用純化的人膠原蛋白(Institut JacquesBoy，F(xiàn)rance)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所得到的光密度轉(zhuǎn)化成膠原蛋白毫微克數(shù)。
a.3)統(tǒng)計學(xué)說明借助Student t試驗比較由經(jīng)處理的未經(jīng)處理的細(xì)胞分泌的膠原蛋白量(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。顯著性水平定為0.05。
同時，借助MTT試驗檢驗存活率。
2.4)細(xì)胞存活率試驗在保溫期結(jié)束時，除去培養(yǎng)基并進(jìn)行MTT試驗。于37℃將細(xì)胞與100μl含有(加在無酚紅的E199-C培養(yǎng)基中)0.5mg/ml四唑鎓鹽的溶液一起保溫3小時。然后向各孔內(nèi)加入100μl異丙醇，以溶解由活細(xì)胞的線粒體琥珀酸脫氫酶生成蘭色甲衍生物。在540nm處檢測所生成的該被溶解衍生物的光密度。
b)所得到的結(jié)果b.1)應(yīng)用上述方法研究人參皂苷R0濃度對膠原蛋白I合成之刺激作用的影響。
表1中給出了用分別含有每毫升0.1、2.5和10μg人參皂苷R0的組合物所測得的結(jié)果。
表1
表1清楚地表明了對膠原蛋白I合成的刺激作用(S顯著性在0.05水平)。
b.2)從分別按照實施例1和實施例2所述方法制得的提取物開始，與用人參皂苷R0進(jìn)行實驗所得到的結(jié)果差不多。
這些結(jié)果總結(jié)于下列表2中。
表2
實施例4證明對膠原蛋白III合成的刺激作用a)方法與上述刺激膠原蛋白I合成的實驗方法相同，但其ELISA法針對膠原蛋白III(人)，培養(yǎng)基處理時間是72小時而不是48小時。
b)結(jié)果在R0存在下，膠原蛋白III的合成受到刺激2.5μg/ml時+33％10μg/ml時+81％下面給出各種化妝品或藥物組合物，特別是皮膚科藥物組合物的實施例，但這些實施例同樣不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例5促進(jìn)皮膚組織系統(tǒng)形成的化妝品組合物人參皂苷R00.3g乙醇2.0g防腐劑 0.2g1.25％Carbopol 940凝膠加至100g應(yīng)用在需要防止或?qū)蛊つw“松馳”作用的部位每天敷用兩次。實施例6強(qiáng)化皮膚的化妝品組合物人參皂苷R00.6g透明質(zhì)酸 0.1g百 提取物0.4g賦形劑＋防腐劑 加至100g應(yīng)用在待處理部位每天按摩兩次，共4周。實施例7用于愈合皮膚傷口的軟膏人參皂苷R01g維生素A棕櫚酸鹽 0.05g氧化鋅 0.1g甘油 1g軟膏賦形劑 加至100g實施例8傷口愈合粉末按照法國專利FR 2685 635中所述的方法制備包含復(fù)合固體顆粒的粉末。該粉末具有下列組成(重量比)—尼龍粉末(由平均直徑約為20μm的顆粒組成的載體顆粒)97—蛻皮甾酮(ecdysterone)1—人參皂苷R02在無菌清潔損傷組織后，將此粉末局部施用于潰瘍型損傷部位，每天2至3次。實施例9促進(jìn)成纖維細(xì)胞的膠原蛋白產(chǎn)生量的培養(yǎng)基人參皂苷R010mg視黃酸 0.3mg抗壞血酸 1.8mg脯氨酸 25mg甘氨酸 20mg賴氨酸 20mgE199-C培養(yǎng)基 加至100mg
權(quán)利要求
1.應(yīng)用人參皂苷R0或其中存在有該皂苷之植物提取物制備刺激膠原蛋白，特別是膠原蛋白I和/或膠原蛋白III的合成的化妝品或藥物組合物特別是皮膚科藥物組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，特征在于所說的組合物可用于防止或治療皮膚老化作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，特征在于所說的組合物可用于促進(jìn)皮膚組織系統(tǒng)的形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，特征在于所說的組合物可用于強(qiáng)化皮膚。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，特征在于所說的組合物可用于愈合皮膚傷口。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項的應(yīng)用，特征在于基于組合物的總重量，人參皂苷的濃度為0.001至5％(重量)，較好為0.001至1％(重量)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項的應(yīng)用，特征在于組合物包含百 提取物、亞細(xì)亞酸、羥基積雪草酸、亞細(xì)亞皂甙、馬栗提取物、假葉樹提取物、羥基積雪草甙、常春藤皂苷、sericoside、α-羥基酸、α-酮戊二酸、抗壞血酸、脯氨酸、L-羥基脯氨酸、賴氨酸、羥基賴氨酸、甘氨酸或弗司扣林、其衍生物或含有這些成分的植物提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任何一項的應(yīng)用，特征在于組合物包含膠原蛋白酶抑制劑或膠原蛋白酶生物合成的抑制劑，例如視黃酸。
9.使用人參皂苷R0或其中存在有該皂苷的植物提取物作為刺激膠原蛋白I和/或III合成的制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，特征在于使用人參皂苷或其中存在有該皂苷的提取物作為成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基的成分。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任何一項的應(yīng)用，特征在于所說的植物提取物選自日本的竹節(jié)人參、中國的竹節(jié)人參、竹節(jié)人參mayer變種及竹節(jié)人參angustifolius變種的提取物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項的應(yīng)用，特征在于所說的提取物是在回流條件下用極性溶劑例如甲醇提取而從根中制得的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任何一項的應(yīng)用，特征在于所說的提取物是經(jīng)用石油醚提取，然后再用極性溶劑例如甲醇提取，并用丙酮沉淀而從根中制得的。
14.美容處理哺乳動物，特別是人的方法，特征在于給所說的哺乳動物使用美容有效量的人參皂苷R0或其中存在有該皂苷的植物提取物，以刺激膠原蛋白特別是膠原蛋白I和/或膠原蛋白III的合成，特別是促進(jìn)皮膚組織系統(tǒng)的合成或強(qiáng)化皮膚。
15.刺激膠原蛋白I和/或膠原蛋白III的合成的方法，特征在于其包括向成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中引入人參皂苷R0或其中存在有該皂苷的植物提取物。
全文摘要
應(yīng)用人參皂苷R
文檔編號A61K8/00GK1146153SQ95192639
公開日1997年3月26日 申請日期1995年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月18日
發(fā)明者A·梅貝克, F·邦特, M·杜馬斯, C·喬達(dá)格尼 申請人:Lvmh研究公司