專利名稱：一種抗菌及免疫調節(jié)多肽類藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及一種抗菌及免疫調節(jié)多肽類藥物，具體涉及一種具有抗革蘭陰性菌作用及免疫調節(jié)作用的載脂蛋白E模擬肽。
背景技術：
感染性疾病是常見病及多發(fā)病，尤以兒童容易罹患；有數(shù)據(jù)顯示，僅在2008年全球就有880萬5歲以下兒童死亡，其中由于感染導致死亡人數(shù)為579萬，占總死亡人數(shù)68%。有研究發(fā)現(xiàn)，細菌是感染性疾病最常見的致病微生物[Black R. E. etal.Lancet, 375(2010), 1969-1987]。目前，臨床治療中，選擇敏感的抗菌藥物是治療細菌感染成敗的關鍵。隨著細菌耐藥性的不斷增加[Yang C. et al.中華預防醫(yī)學雜志.45:727-731; 2011. ; ZhangR.Braz J Infect Dis. 15:505-506; 2011.]，臨床治療耐藥菌引起的感染將越來越困難；臨床已分離到泛耐藥或全耐藥的革蘭陰性細菌(如鮑曼不動桿菌)[Zhang R. Braz J InfectDis. 15:505-506; 2011.]，因此，研究開發(fā)針對耐藥菌的新型抗菌藥物是當前亟需解決的任務之一?？咕氖侵笍V泛存在于生物體內具有抵御外來入侵病原體侵害、清除體內突變細胞的小分子多肽。研究報道，已相繼從細菌、真菌、兩棲類、高等植物、哺乳動物乃至人類中發(fā)現(xiàn)并分離獲得具有類似性質的活性多肽，其中，某些抗菌肽對部分真菌、原蟲和病毒具有明顯殺傷作用(張曉鞏，等?？咕淖饔脵C制的研究進展，生理科學進展，42 :11-15;2011。)。由于抗菌肽具有理化性質穩(wěn)定、抗菌譜廣，不易產(chǎn)生耐藥性等特點，已漸成為抗生素的最佳替代品。研究表明，抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素在抗菌機制、作用方式上存在明顯不同，由于抗菌肽發(fā)揮抗菌作用時不涉及特定的受體，主要是離子的物理作用，所以不產(chǎn)生耐藥性，是抗耐藥菌藥物的重要來源；但抗菌肽天然資源有限，而可大量獲得產(chǎn)量的化學合成和基因工程手段有望成為獲取抗菌肽的替代方法。有研究表明，嚴重侵襲性細菌感染如膿毒血癥其致病機制中除細菌本身對人體造成損害外，細菌成分或代謝產(chǎn)物所誘發(fā)的人體過度炎癥反應是重要致病機制之一；其中，脂多糖(LPS)是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要成分，LPS與單核-巨噬細胞膜表面的可溶性白細胞分化抗原(S⑶14)、Toll樣受體4/髓樣蛋白2 (TLR4/MD-2)結合，能激活細胞內炎癥介質表達的信號轉導系統(tǒng)，激活單核-巨噬細胞、內皮細胞等，釋放促炎癥介質，如腫瘤壞死因子α (TNF-α)、白介素I (IL_1)、白介素6 (IL_6)等，誘發(fā)全身炎癥反應綜合癥(SRIS)、膿毒癥性休克(septic shock)甚至多器官功能衰竭綜合癥(MODS)[Shi Dff. et al. Inflamm Res. 60:841-849;2011. Di Sole F. et al. Am J Physiol CellPhysiol. 301:C1290-C1292;2011.];因此，阻斷由LPS所誘發(fā)的炎癥反應是治療革蘭陰性桿菌感染引起的膿毒血癥的關鍵之一；而傳統(tǒng)的激素治療由于其單純的免疫抑制存在使感染擴散風險，因此有必要尋找對抗LPS誘導的炎癥因子表達的免疫調節(jié)劑。載脂蛋白E (ApoE)模擬肽是源于ApoE受體結合部位氨基酸殘基序列的多肽，目前已報道的ApoE模擬肽主要有二種具有抗微生物作用的ApoE模擬肽和具有免疫調節(jié)作用的ApoE模擬肽。具有抗微生物作用ApoE模擬肽目前報道較少，如ApoE133-162模擬肽被證實有體外抗菌活性[Azuma M. et al. Peptides. 21:327-330; 2000.],另一種 ApoE 模擬肽ApoEdp的體外研究證明其具有更為廣泛的抗微生物作用，對細菌、病毒均有殺滅效果[Dobson CB. et al. J Infect Dis. 193:442-450; 2006.];但上述二種 ApoE 模擬肽的 50%最低抑菌濃度(MIC5tl)偏高，其體內抗菌活性及對耐藥菌的抗菌作用尚未確定。國外研究報道，用ApoE模擬肽(C0G，acetyl-133-149-amide)治療多發(fā)性硬化癥模型小鼠，小鼠巨噬細胞釋放一氧化氮(NO)、TNF-α、IL-6受阻，小鼠臨床癥狀改善[Li FQ. et al. J Pharmacol Exp Ther. 318:956-965; 2006. ] ApoE 模擬肽 COGl 12可抑制枸櫞酸桿菌誘導的成年小鼠結腸細胞(YAMC)炎癥反應[Stephens TA. et al. JImmunol, 181:6859-6871; 2008.]。所述ApoE模擬肽C0G1410具有體外抑制小鼠腹腔巨曬細胞及神經(jīng)膠質細胞株(BV2) TNF-α表達的作用[Wang H. et al. Anaesth Intensive Care. 37:38_45; 2009.]，但迄今為止，尚未見具有抗膿毒血癥ApoE模擬肽的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種抗菌及免疫調節(jié)多肽類藥物，具體涉及一種具有抗革蘭陰性菌作用及免疫調節(jié)作用的載脂蛋白E模擬肽。本發(fā)明基于現(xiàn)有的ApoE模擬肽抗感染及免疫調節(jié)作用的研究現(xiàn)狀，設計了一種新型ApoE模擬肽(ApoE23)，并通過體內及體外實驗，驗證其抗菌作用及對LPS誘導的細胞因子表達的調節(jié)作用；并通過對B組鼠傷寒沙門菌膿毒血癥小鼠靜脈注射ApoE23，觀察其對細菌性膿毒血癥的治療作用；結果表明，所述的ApoE模擬肽(ApoE23)具有抗革蘭陰性菌作用及免疫調節(jié)作用，可進一步用于制備抗革蘭陰性桿菌及抗泛耐藥革蘭陰性桿菌多肽類藥物，以及制備具有免疫調節(jié)作用多肽類藥物。本發(fā)明遵循以下原則設計合成肽序列(I)序列來源為ApoE N端低密度脂蛋白受體(LDLR)結合位點序列；(2)氨基酸數(shù)量不低于9個；(3)選擇富含堿性氨基酸殘基片段；(4)選擇有形成a螺旋偏好的氨基酸殘基；(5)以呈現(xiàn)兩親性螺旋為優(yōu)選。更具體的，本發(fā)明提供一條ApoE模擬肽(ApoE23)，其序列為(如SEQ ID N0:1所示)LRKLRKRLVRLASHLRKLRKRLL。本發(fā)明中，所述ApoE23采用固相合成法合成，高效液相色譜法(HPLC)純化，質譜及電噴霧質譜對合成肽純度、氨基酸殘基組成及分子量進行測定證實合成產(chǎn)物是目的肽，采用圓二色譜技術結合K2D3軟件進行合成肽二級結構分析證實ΑροΕ23 α螺旋結構占21. 61%，β折疊結構占7. 32% ;通過a螺旋輪法檢測其親水氨基酸殘基及疏水氨基酸殘基分布特點，結果表明，ApoE23的α螺旋為兩親性α螺旋；本發(fā)明中，采用體外試驗檢測ΑροΕ23對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、泛耐藥鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌及念珠菌的抗菌活性；結果表明，ΑροΕ23有明顯的體外抗大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及泛耐藥鮑曼不動桿菌作用；ΑροΕ23抗金黃色葡萄球菌的MIC50值大于抗大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及泛耐藥鮑曼不動桿菌的MIC5tl值；結果顯示，在研究使用的ApoE23濃度范圍內，對屎腸球菌及念珠菌無抗菌作用；本發(fā)明進行了 ApoE23下調LPS誘導免疫細胞TNF-α、IL-10、IL-6表達實驗，結果表明，ΑροΕ23下調LPS誘導的THP-I細胞(人單核細胞株)及人外周血單個核細胞(PBMC)的 TNF- α、IL-6、IL-10 表達；本發(fā)明進一步進行了 ΑροΕ23對細菌性膿毒血癥小鼠治療作用實驗，實驗采用ΑροΕ23治療B組鼠傷寒沙門菌膿毒血癥模型小鼠，結果表明，所述ΑροΕ23能明顯降低膿毒血癥小鼠死亡率，降低膿毒血癥小鼠血漿TNF- α、IL-6及LPS濃度，改善膿毒血癥小鼠肺臟、肝臟、小腸及脾臟的炎性損害。實驗結果表明，本發(fā)明的載脂蛋白E模擬肽ApoE23具有抗革蘭陰性菌作用及免疫調節(jié)作用，可下調LPS誘導的THP-I細胞(人單核細胞株)及人外周血單個核細胞(PBMC) 的TNF-α、IL-6、IL-10表達；能明顯降低膿毒血癥小鼠死亡率，降低膿毒血癥小鼠血漿TNF-α、IL_6及LPS濃度，改善膿毒血癥小鼠肺臟、肝臟、小腸及脾臟的炎性損害；能殺滅大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、泛耐藥的鮑曼不動桿菌(對碳青霉烯類、喹諾酮類、頭孢類耐藥)和金黃色葡萄球菌，可用于制備抗革蘭陰性桿菌及抗泛耐藥革蘭陰性桿菌多肽類藥物，以及可用于制備具有免疫調節(jié)作用多肽類藥物。本發(fā)明的載脂蛋白E模擬肽ApoE23的優(yōu)點有(I)抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素在抗菌機制、作用方式存在明顯不同，由于抗菌肽作用不涉及特定的受體，主要是離子的物理作用，因此不產(chǎn)生耐藥性，是抗耐藥菌藥物重要來源；所述ApoE23作為一種抗菌肽具有較強的抗革蘭陰性桿菌包括耐藥菌活性，其序列來源于人來ApoE,不易誘導機體產(chǎn)生抗體,因此可進一步制備優(yōu)質抗菌藥物；(2)細胞因子表達失衡是炎癥性疾病如動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)及感染誘發(fā)的系統(tǒng)性炎癥反應綜合征(SIRS)的病理基礎，調節(jié)不同類型細胞因子表達可糾正免疫紊亂狀態(tài)；本發(fā)明經(jīng)體外實驗結果表明，所述ApoE23對LPS誘導的免疫細胞TNF-α、IL-6、IL-10表達均有調節(jié)作用，可進一步制備治療炎癥性疾病及自身免疫性疾病的免疫調節(jié)藥物；(3)所述的ApoE23具有的抗菌及免疫調節(jié)雙重功能，可顯著降低細菌性膿毒血癥小鼠死亡率，可進一步制備治療膿毒血癥的藥物。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的載脂蛋白E模擬肽ApoE23進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內。


圖I為ApoE23的α螺旋輪圖。圖2為ΑροΕ23的二級結構分析圖。
具體實施例方式實施例I ΑροΕ23 二級結構、親水性及疏水性分析
α螺旋的每一圈具有3. 6個殘基，相當于每個殘基旋轉100°，因此其側鏈是以100°的間隔從螺旋軸上向外伸出；如圖I所示，圖中出現(xiàn)了一個親水面和一個疏水面，顯示ΑροΕ23形成的α螺旋為兩親性α螺旋。所述ΑροΕ23合成采用固相合成法，經(jīng)HPLC純化后得到單一吸收峰，純度均超過95%，達到藥用純度；經(jīng)脫鹽處理含鹽量不超過28% ;采用電噴霧質譜(ESI-MS)測量樣品組分的質量電荷比(Μ/Ζ)來計算樣品的分子量，通過質譜及氨基酸分析對合成肽進行定性、定量分析；對合成產(chǎn)品檢測結果與理論值相符。采用多肽的圓二色性及不對稱分子對左右圓偏振光吸收的不同來進行結構分析，將190-240nm波長范圍內連續(xù)測得的ApoE23吸光度數(shù)據(jù)平均抽取51個數(shù)值輸入 K2D3[Louis-Jeune C.,et al. Proteins: Structure, Function, andBioinformatics. 80:374-381; 2012]蛋白質二級結構分析軟件得到ApoE23的K2D3分析圖及預測的α螺旋、折疊比例；結果顯示，ΑροΕ23的α螺旋結構占21. 61%，β折疊結構占7. 32% (如圖2所示)。
實施例2 ΑροΕ23的體外抗菌作用試驗在96孔細胞培養(yǎng)板進行，分對照組、5種不同濃度的ΑροΕ23干預組及空白對照組；對照組僅加100 μ L的LB細菌混懸液，ΑροΕ23干預組設5種ΑροΕ23濃度(O. 5 μ mol/L、I μ mol/L、I. 5 μ mol/L、2 μ mol/L及2. 5 μ mol/L);每組設2個平行孔，每孔細菌終濃度5X104CFU/ml，終體積100 μ 1，空白對照組不加任何溶液；將試驗板放入濕盒，37°C培養(yǎng)過夜，混勻后在酶標儀上比色測各孔吸光度，波長630nm;試驗細菌分別為大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)及泛耐藥鮑曼不動桿菌(臨床分離株，對頭孢類、碳青霉烯類、喹諾酮類抗菌藥物耐藥)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、屎腸球菌(臨床分離株)及白色念珠菌(臨床分離株);體外抗菌試驗結果表明，ApoE23對三種致病菌有明顯抗菌活性，MIC50值均為I I. 25 μ mol/L ;所述ApoE23對金黃色葡萄球菌有抗菌活性，MIC50值為4. 0-4. 5 μ mol/L,ApoE23對革蘭陽性的屎腸球菌、酵母樣真菌如白色念珠菌在2-5 μ mol/L的濃度范圍內無抗菌作用。實施例3 ApoE23下調LPS誘導免疫細胞TNF- α、IL-10, IL-6表達試驗在96孔細胞培養(yǎng)板進行，分對照組(僅加DMEM細胞懸液)、LPS誘導組(細胞懸液+LPS)、ApoE23干預組(細胞懸液+ApoE23)、LPS+ApoE23干預組(細胞懸液+LPS+ApoE23，LPS加入后30分鐘加入ApoE23);試驗用細胞分別為人單個核細胞株(THP-I)組及采用淋巴細胞分離液分離得到的健康人外周血單個核細胞(PBMC)組；每組終體積100 μ L，細胞數(shù)5Χ 105，LPS最終濃度I μ g/mL, ApoE23最終濃度為5 μ mol/L ;反應板放入細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6小時、24小時及48小時后收集培養(yǎng)細胞上清液及細胞；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定不同組上清液中TNF- α、IL-6、IL-10濃度，采用定量PCR法檢測不同組THP-I人 PBMC 的 TNF- α、IL-6、IL-IOmRNA 表達；結果表明，ΑροΕ23具有顯著下調LPS誘導的人PBMC及ΤΗΡ-1細胞TNF- α、IL-6mRNA及蛋白表達作用，下調THP-I細胞IL-10 mRNA及蛋白表達作用、下調人PBMC IL-10蛋
白表達。實施例4 ApoE23對細菌性膿毒血癥小鼠治療作用
細菌性膿毒血癥小鼠死亡率觀察試驗將15只C57BL小鼠(斷奶后2周，體重10-12g)隨機分為感染對照組(5只)、膿毒血癥ApoE23治療組(5只)、膿毒血癥生理鹽水治療組(5只)；膿毒血癥ApoE23治療組每只小鼠腹腔注射O. 5ml B組鼠傷寒沙門菌菌懸液(I. 8 X IO6CFU)后立即尾靜脈注射O. Iml ApoE23注射液(I. 5mg/kg);膿毒血癥生理鹽水治療組每只小鼠腹腔注射O. 5ml B組鼠傷寒沙門菌菌懸液(I. 8X IO6CFU)后立即尾靜脈注射O. Iml醫(yī)用無菌生理鹽水；感染對照組小鼠僅腹腔注射O. 5ml醫(yī)用無菌生理鹽水；將三組小鼠放置無菌層流室觀察48小時，期間喂養(yǎng)按照常規(guī)進行，記錄每組小鼠的死亡數(shù)量及死亡時間。ApoE23治療作用機制試驗將小鼠分為三組(同死亡率觀察試驗)，每組15只小鼠，采用同死亡率觀察試驗相同處理后再將每組小鼠分為Ih組、3h組及24h組，每小組各5只；分別于試驗后lh、3h及24h收集不同時間點分組小鼠的抗凝血、肺臟、肝臟、脾臟、小腸；采用免疫比濁法測定不同組小鼠血漿LPS濃度，采用ELISA法測定不同組小鼠血漿TNF-a、IL-6濃度，采用細菌培養(yǎng)法對不同組小鼠脾臟進行細菌培養(yǎng)及菌落計數(shù)；肺臟、肝臟及小腸制作病例切片，HE染色后顯微鏡下觀察炎性改變。
結果表明，膿毒血癥ApoE23治療組24小時死亡率為0，48小時小鼠死亡為40% ；膿毒血癥生理鹽水治療組C57BL小鼠24小時死亡率60%，48小時死亡率為100% ;非感染組5只小鼠在試驗24小時、48小時及72小時均無異常表現(xiàn)，死亡率為O。對不同組小鼠血漿LPS、TNF- α、IL_6、脾臟細菌菌落進行測定，結果表明，ApoE23明顯降低B組鼠傷寒沙門菌感染小鼠血漿LPS、IL-6、TNF-α濃度及脾臟細菌數(shù)量；所述ApoE23治療改善感染小鼠脾臟、肺臟、小腸、肝臟炎性損傷。
權利要求
1.一種載脂蛋白E模擬肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列I所示，為LRKLRKRLVRLASHLRKLRKRLL。
2.按權利要求I所述的載脂蛋白E模擬肽，其特征在于，所述的模擬肽采用固相合成法合成，高效液相色譜法純化，通過質譜及電噴霧質譜測定證實合成肽的純度、氨基酸殘基組成及分子量；所述模擬肽的合成肽二級結構中α螺旋結構占21.61%，β折疊結構占7. 32% ； α螺旋為兩親性α螺旋。
3.權利要求I的載脂蛋白E模擬肽在制備抗菌及免疫調節(jié)多肽類藥物中的用途。
4.按權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的多肽類抗菌藥物是抗革蘭陰性桿菌及抗泛耐藥革蘭陰性桿菌多肽類藥物。
5.按權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的，免疫調節(jié)多肽類藥物下調LPS誘導的THP-I細胞及人外周血單個核細胞的TNF-α、IL_6、IL-IO表達。
6.按權利要求4所述的用途，其特征在于，所述的多肽類抗菌藥物殺滅大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、泛耐藥的鮑曼不動桿菌和金黃色葡萄球菌。
7.按權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的泛耐藥的鮑曼不動桿菌是對碳青霉烯類、喹諾酮類或頭孢類耐藥的鮑曼不動桿菌。
8.權利要求I所述的載脂蛋白E模擬肽在制備治療細菌性膿毒血癥藥物中的用途。
9.按權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的藥物降低膿毒血癥死亡率，降低膿毒血癥血漿TNF- α、IL-6及LPS濃度，改善膿毒血癥肺臟、肝臟、小腸及脾臟的炎性損害。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及一種抗菌及免疫調節(jié)的載脂蛋白E模擬肽類藥物。所述載脂蛋白E模擬肽ApoE23具有序列1的結構。本發(fā)明經(jīng)體內及體外實驗，結果表明，所述載脂蛋白E模擬肽可下調LPS誘導的THP-1細胞及人外周血單個核細胞的TNF-α、IL-6、IL-10表達；能明顯降低膿毒血癥小鼠死亡率，降低膿毒血癥小鼠血漿TNF-α、IL-6及LPS濃度，改善膿毒血癥小鼠肺臟、肝臟、小腸及脾臟的炎性損害；能殺滅大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、泛耐藥的鮑曼不動桿菌和金黃色葡萄球菌，該載脂蛋白E模擬肽可進一步制備抗革蘭陰性桿菌及抗泛耐藥革蘭陰性桿菌多肽類藥物和制備免疫調節(jié)的多肽類藥物以及抗膿毒血癥的藥物。
文檔編號A61P31/04GK102887948SQ20121030696
公開日2013年1月23日 申請日期2012年8月24日 優(yōu)先權日2012年8月24日
發(fā)明者王傳清, 楊昌生, 楊毅 申請人:復旦大學附屬兒科醫(yī)院