專利名稱：一種治療肝癌的中藥癌毒方及其在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中醫(yī)藥領域的細胞生物學、分子生物學技術，具體地說是涉及治療肝癌的中藥癌毒方及其在制備抗肝癌藥物中的應用。
背景技術：
肝癌是嚴重危害人類生命健康的重大疾病之一，是我國最常見的惡性腫瘤之一， 近年來死亡率增加了 41. 17%，其發(fā)病率和死亡率還正在逐年升高。肝癌具有發(fā)現(xiàn)晚、發(fā)展快、治療難、預后差等特點，被稱為“癌中之王”，由于其早期癥狀隱匿，多數(shù)患者就診時已屬中晚期，能手術切除者甚少，即使手術切除，術后5年復發(fā)率仍高達60%以上，小肝癌復發(fā)率也高達40%-50%。西醫(yī)治療肝癌以直接對抗某一病理環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，而許多患者或為彌漫性肝癌、 或伴有腹水、腎功能不全，難以接受手術、肝動脈栓塞化療、冷凍等治療。以中醫(yī)理論為基礎治療肝癌則是對機體整體調節(jié)，發(fā)揮多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點的綜合作用，無論是在抑制、 殺傷癌細胞，調節(jié)機體免疫功能，還是改善癥狀、提高生存質量、延長生命上都顯示出獨特的優(yōu)勢。長期以來，中醫(yī)藥在治療肝癌方面取得了一定的臨床療效，尤其以中醫(yī)理論為基礎形成的中藥復方治療肝癌更能充分發(fā)揮辨證論治和對機體整體調節(jié)的優(yōu)勢，中醫(yī)藥抗肝癌作用越來越得到國際社會的關注和承認，但中醫(yī)藥治療肝癌存在的核心問題是其作用機理不清，尤其是對創(chuàng)新性理論指導下形成的名老中醫(yī)抗肝癌效驗方的現(xiàn)代機制研究還不夠。我國著名中醫(yī)藥專家周仲瑛教授根據(jù)近六十年的臨床實踐，提出了“癌毒”學說， 他認為癌毒是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵，是在腫瘤發(fā)病過程中體內產生的一種特殊的病理因素，癌毒是腫瘤患者在正虛的基礎上，因體內邪盛而生毒，癌毒與痰濁、瘀血、濕濁、熱毒等病理因素同時膠結存在、互為因果，亦可兼夾轉化、共同為病。癌毒一旦形成，阻滯體內，則病變乖戻，一方面大量耗傷人體氣血津液，一方面導致臟腑氣血功能失調，誘生痰濁、瘀血、 濕濁、熱毒等多種病理因素，并耗氣傷陰，發(fā)生各種復雜證候，表現(xiàn)出邪毒囂張、難以消除、 易于傳變、病情篤重、病勢兇險、正氣虛敗、預后極差等證候特點。近年來，隨著Toll樣受體(TLRs)的發(fā)現(xiàn)及其豐富生物學功能的進一步揭示，以及 Toll樣受體/核因子-κΒ (TLRs / NF-κΒ)信號通路的部分闡明，為探討中醫(yī)藥抗癌機制開啟了新的思路與方法。本研究以TLRs / NF-κ B通路為切入點進行癌毒方抗癌機制研TLRs是新近發(fā)現(xiàn)的存在于生物機體中的一大類非常重要的模式識別受體(PRR)， 可表達于多種免疫細胞及上皮細胞，機體多種免疫防御反應(包括腫瘤免疫)均需要不同TLRs的參與。根據(jù)TLRs的信號傳遞是否包含髓樣分化因子88 (MyD88)，TLRs信號通路又分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性兩種途徑，再通過一系列反應，激活核因子-K B(NF--k B)，激活的NF-K B進入細胞核內，調控多種重要的細胞因子、粘附分子和趨化因子的表達，在機體的免疫應答、炎癥反應、細胞增殖、分化及凋亡調控等方面發(fā)揮重要的作用。目前研究比較多的是TLRs / NF-K B通路對炎癥性疾病、自身免疫性疾病、肝臟疾病、哮喘、冠狀動脈粥樣硬化等的影響。近年來，人們發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞表面也表達TLRs， 它們可被存在于局部的配體激活，刺激腫瘤細胞分泌過量腫瘤相關蛋白及細胞因子，這些因子可刺激腫瘤細胞生長、血管和淋巴管生成、腫瘤的浸潤轉移、導致T細胞和NK細胞功能失調等，即腫瘤細胞表面表達的TLRs可能與腫瘤細胞生長、免疫逃逸及化療耐藥相關。 如在人類部分黑色素瘤細胞中，透明質烷碎片能夠通過TLR4誘導產生細胞因子和MMP，這些物質恰能促進腫瘤生長，而產生的MMP又能溶解細胞間質產生透明質烷，這種正反饋調節(jié)形成惡性循環(huán)，加速腫瘤惡化；Kelly等研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌能通過TLR4-MyD88通路激活NF-κ B，誘導致炎細胞因子產生，促進腫瘤生長，同時在試驗中還發(fā)現(xiàn)卵巢癌可能通過 TLR4-MyD88-NF- κ B通路抵抗抗腫瘤藥物紫杉醇誘導的凋亡。研究表明，TLRs / NF-κ B通路有雙重作用，既可能通過增強宿主免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用，又可能起保護腫瘤細胞，逃脫免疫監(jiān)視的作用。一些研究發(fā)現(xiàn)中藥可通過影響免疫細胞中TLRs / NF-K B通路而發(fā)揮抗腫瘤作用，而中藥直接對腫瘤細胞此通路影響的研究，目前國內外未見報導。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療肝癌的中藥癌毒方及其在制備抗肝癌藥物中的應用。本發(fā)明的目的是通過以下的技術方案來實現(xiàn)
癌毒方是在我校著名中醫(yī)專家周仲瑛教授的“癌毒”理論指導下確立的中醫(yī)藥治療肝癌的處方。本方主要由白花蛇舌草、山慈菇、蜈蚣、八月扎等組成，全方共奏清熱化痰、祛瘀散結、消癌解毒之功效，在繼承名老中醫(yī)經驗的基礎上，如何將其有效驗方進一步總結與驗證，是名老中醫(yī)傳承工作一項重要的課題。中藥癌毒方其特征在于它是由下列重量配比的原料藥所制成蛇舌草3-20g ；僵蠶3-10g ；蜈蚣l-3g ；八月扎3-12g ；太子參3-15g ；麥冬3_12g ；山慈菇3_10g。上述的中藥癌毒方在制備治療肝癌藥物中的應用。癌毒方的藥理實驗
本發(fā)明是以肝癌&移植瘤小鼠為材料，觀察癌毒方的抗肝癌作用機制，本研究以 TLRs / NF-K B通路作為新靶點，從細胞因子表達的源頭TLRs入手，觀察癌毒方對肝癌模型鼠細胞TLRs/NF- κ B通路關鍵環(huán)節(jié)TLR4、NF- κ B、髓樣分化因子88 (MyD88)的影響探討抗癌作用機制。具體實驗如下 1材料與方法藥物配制
癌毒方按上述處方劑量比例配制而成，為周仲瑛教授原創(chuàng)組方，其中藥制劑購自安徽省亳州市中西藥有限公司，由南京中醫(yī)藥大學藥理教研室煎制，濃縮成生藥量為2g/ml濾液，保存?zhèn)溆?。順鉬注射液購自南京制藥廠有限公司(批號20091118)，注射用生理鹽水購自南京小營藥業(yè)集團有限公司(批號2009090403)。VEGF-ELISA試劑盒購買自美國Pierce 公司。實驗動物及分組
清潔級ICR小鼠，雄性，體重18士2g，共72只。購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，飼料均購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。H22肝癌種鼠由南京市鼓樓醫(yī)院動物房提供，頸椎脫白法處死H22肝癌種鼠，用碘酒、酒精消毒腹部，抽取種鼠腹水5 ml，加入10 ml的生理鹽水稀釋，75%酒精消毒待接種的ICR小鼠右腋下皮膚，按每鼠0. 2 ml接種小鼠右腋皮下。整個操作在60 min內完成，接種M h后稱重，隨機分為5組，每組10只，即對照組(生理鹽水灌胃)，順鉬組(順鉬腹腔注射，0.001 g/kg/d)，癌毒方高、中、低劑量組(癌毒方10、30、90 g/kg/d灌胃)，以上劑量依據(jù)成人臨床擬用量，通過體表面積換算得出，造模后第2 d小鼠每天給藥1次，連續(xù)10 d。觀測癌毒方對荷H22肝癌小鼠生長的抑制
癌毒方給藥前、給藥期間用游標卡尺測量小鼠的右前肢直徑進行記錄，以腫瘤大小的變化和給藥時間繪制移植瘤生長曲線，并在給藥期間觀察各給藥組小鼠體重的變化。給藥后第10天處死小鼠，隨機嚴格剝離干凈皮下腫瘤組織，使用電子秤稱量(精確到0.01 g)稱瘤重后，計算各組瘤體平均重量及腫瘤抑制率，按以下公式計算抑瘤率抑瘤率(<%)=(對照組瘤重均數(shù)一癌毒方組瘤重均數(shù))/對照組瘤重均數(shù)X100%。流式細胞術檢測H22移植瘤細胞周期及凋亡峰(亞二倍體峰)
取處死的小鼠H22移植瘤組織并剪碎研磨，400目尼龍網(wǎng)過濾成單細胞懸液，1000 r/ min離心5 min，快速棄去上清液，加入PBS 0.5 ml，在混懸儀上緩慢注入2 ml 4°C、75%的冷乙醇，細胞固定后在20°C保存，1800 r/min離心10 min去掉乙醇，加PBS 2 ml, 1000 r/ min離心棄上清液，加PBS調細胞密度為1 X 106個/ml，使終體積約為0. 5 ml，加PI染液混勻，30 min后上機檢測，分析各組H22移植瘤細胞亞二倍體凋亡峰，研究該方對腫瘤細胞周期及細胞凋亡的影響。法檢測癌毒方對TLR4、MyD88及NF- κ B蛋白表達的影響
取處死的小鼠Η22移植瘤組織，于冰PBS中充分洗滌，留取約200mg組織置于Iml冰預冷裂解緩沖液，勻漿后冰浴30min，充分裂解。離心4°C，10000Xg，10min。將上清分裝，存于_70°C備檢。用Bradford方法測定蛋白濃度。將樣本用裂解緩沖液稀釋相同濃度，取等量上樣緩沖液于試管中，蛋白量為50ug， 并于95-100°C 5min后冰上冷卻上樣。電泳條件濃縮膠40V，分離膠80V，約濁溴酚蘭至底部。取出凝膠，置于轉移緩沖液中平衡15min。平放底部電極(陽極)，在上面分別放置濾紙、PVDF膜、凝膠和濾紙，排除各層氣泡后將上方電極(陰極)放于夾層物上。按恒流 200mA通電，電轉移lh。PVDF膜在5%脫脂奶粉封閉液中封閉(室溫，Ih)，棄去封閉液，不洗。按約O.lml/cm2的量加入封閉液和適量一抗(用封閉液稀釋，稀釋比1:400)。搖床搖蕩孵育G°C，過夜)。PBST漂洗濾膜4次，每次lOmin。將膜與HRP結合的二抗(辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG抗體，二抗用封閉液稀釋，稀釋比1:10000)室溫下?lián)u蕩孵育lh，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次lOmin。進行顯影和圖像分析。統(tǒng)計學方法
實驗數(shù)據(jù)以Jf 士 s表示，采用SPSSI7.0統(tǒng)計軟件，根據(jù)方差齊性采用單因素方差分析和q檢驗比較各組間差異，以P<0. 05或P<0. 01為差異有統(tǒng)計學意義。實驗結果
癌毒方對H22肝癌移植瘤的抑制作用表1各組小鼠實體瘤重比較(jf 士s)
權利要求
1.一種治療肝癌的中藥癌毒方，其特征在于它是由下列重量配比的原料藥所制成 蛇舌草3-20g ；僵蠶3-10g ；蜈蚣l-3g ；八月扎3-12g ；太子參3_15g ；麥冬3_12g ；山慈S 3-10g。
2.權利要求1所述的中藥癌毒方在制備治療肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療肝癌的中藥癌毒方及其在制備抗肝癌藥物中的應用，癌毒方系根據(jù)國醫(yī)大師周仲瑛教授的癌毒理論由蛇舌草、僵蠶、蜈蚣、八月扎、太子參、麥冬、山慈菇按一定重量配比制成，全方驅邪消癌解毒為主，輔以扶正，本發(fā)明以肝癌H22移植瘤小鼠為材料，藥理實驗結果表明癌毒方的抗癌作用結果低、中、高劑量組抑瘤率分別為24.5%、42.8%，21.1%，顯示出抑制H22瘤塊生長作用；低、中、高劑量組瘤塊細胞凋亡率分別為47.16%、60.52%、57.59%，顯示出誘導腫瘤細胞凋亡作用；能阻斷TLR4高表達，阻斷TLR4胞內信號轉導的MyD88依賴性途徑，抑制下游NF-кB蛋白表達。實驗表明癌毒方可用于制備抗肝癌的藥物。
文檔編號A61K35/64GK102357202SQ20111031373
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月17日 優(yōu)先權日2011年10月17日
發(fā)明者吳勉華, 周紅光, 王明艷, 程海波, 陳海彬 申請人:南京中醫(yī)藥大學