專利名稱：一種載TGF-β3的緩釋組織工程膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療領(lǐng)域，具體的說，涉及從一種醫(yī)療用的緩釋抗粘連的組織工程膜的制備方法。
背景技術(shù)：
手指屈指肌腱損傷后發(fā)生粘連愈合，導(dǎo)致手指的功能恢復(fù)效果不理想，是手外科領(lǐng)域亟待解決的一大難題。在肌腱愈合過程釋放的細(xì)胞因子中，TGF-β (TransformingGrowth Factor beta)認(rèn)為是組織纖維化,瘢痕形成、肌腱粘連的關(guān)鍵因子。TGF-0 3做為體內(nèi)TGF-β I的同分異構(gòu)體，可以下調(diào)TGF-β I和TGF-β 2的水平，起到TGF-β I抗體的效 果，達(dá)到抑制瘢痕的形成的作用。但是TGF-β 3在體內(nèi)肌腱局部含量少，肌腱愈合環(huán)境內(nèi)TGF-β 3的濃度無法保持，無法起到明顯抗粘連作用。

發(fā)明內(nèi)容
為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種具有緩釋作用的抑制組織愈合處粘連形成的載TGF-β 3的緩釋組織工程膜的制備方法。本發(fā)明目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種載TGF-03的緩釋組織工程膜的制備方法，其關(guān)鍵在于按如下步驟進(jìn)行( I)殼聚糖不對稱膜a、致密層的形成殼聚糖溶于I %的醋酸水溶液，配制成2%的殼聚糖溶液，4°C離心5min，去除雜質(zhì)，靜置除氣泡后待用；將I. Oml上述溶液澆入直徑9cm培養(yǎng)皿中，室溫放置24h自然晾干形成致密層；b、多孔層的形成再將3ml的殼聚糖溶液傾入放置致密層的培養(yǎng)皿中，-20°C預(yù)凍Ih后冷凍干燥形成多孔層得到殼聚糖不對稱膜；(2)殼聚糖微球的制備殼聚糖120mg溶于2%的醋酸水溶液4-6ml，配成2%的殼聚糖溶液，靜置除氣泡后待用；150ml燒杯中加入80ml液體石蠟，調(diào)整攪拌速度至lOOOrpm，滴加乳化劑Span-804ml ;用無菌注射器將殼聚糖溶液逐滴加至液體石蠟中，攪拌乳化至顏色呈均一穩(wěn)定乳白色；加入0. 4ml的50%戊二醛溶液與殼聚糖交聯(lián)固化，攪拌固化I小時(shí)，靜置固化20分鐘，淡黃色微球沉淀于杯底；傾去上層油相，大量石油醚反復(fù)清洗，倒去上層石油醚，得微球，石油醚室溫?fù)]發(fā)30分鐘，得較干燥微球；(3)載TGF-β 3的殼聚糖緩釋膜制備將步驟(I)殼聚糖不對稱膜裁成直徑為Icm的圓片，準(zhǔn)確稱量TGF-β 3，按殼聚糖微球0. 5mg含TGF-0 3 IOmg懸于IOOul的90%酒精，加入殼聚糖膜多孔層，使微球均勻吸附到殼聚糖膜的孔隙中得到載TGF-β 3的殼聚糖緩釋膜。
上述用無菌注射器將殼聚糖溶液逐滴加至液體石蠟中，在37度水浴下IOOOrpm攪拌乳化至顏色呈均一穩(wěn)定乳白色。上述加入0.4ml的50%戊二醛溶液與殼聚糖交聯(lián)固化，在37度水浴下IOOOrpm攪拌固化I小時(shí)。載TGF-β 3的殼聚糖微球的體外緩釋實(shí)驗(yàn)，如圖2所示精確稱量TGF-β 3，殼聚糖微球20mg，置于Ep管，加入Iml的PBS，EP管置于搖床，I小時(shí)后離心，取上清液，_20°C保存離心液，將微球重懸于Iml的PBS中，繼續(xù)置于搖床。于實(shí)驗(yàn)開始后2h, 4h, 6h, 12h, 24h, 36h, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d, 7d重復(fù)上述操作。將各次離心后的液體作為待測樣品，用ELISA試劑盒檢測樣品OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中TGF-β 3的含量，繪制TGF-β 3的累計(jì)釋放曲線，前12小時(shí)緩釋較快，于24小時(shí)基本達(dá)到平衡。有益效果本發(fā)明載TGF-β 3的緩釋組織工程膜，能夠達(dá)到很好的緩釋效果，持續(xù)釋放TGF-β 3，具有持續(xù)很好的抗菌作用，同時(shí)由于是膜狀應(yīng)用范圍很廣也很靈活，用于骨 科中肌腱粘連的防治效果非常好。說明書附I為本發(fā)明載TGF- β 3的緩釋組織工程膜結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為TGF-β 3的累計(jì)釋放曲線圖；圖3為本發(fā)明載TGF-β 3的緩釋組織工程膜電鏡圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一種載TGF- β 3的緩釋組織工程膜的制備方法，按如下步驟進(jìn)行( I)殼聚糖不對稱膜a、致密層的形成殼聚糖溶于I %的醋酸水溶液，配制成2%的殼聚糖溶液，4°C離心5min，去除雜質(zhì)，靜置除氣泡后待用；將I. Oml上述溶液澆入直徑9cm培養(yǎng)皿中，室溫放置24h自然晾干形成致密層；b、多孔層的形成再將3ml的殼聚糖溶液傾入放置致密層的培養(yǎng)皿中，_20°C預(yù)凍Ih后冷凍干燥形成多孔層2得到殼聚糖不對稱膜；(2)殼聚糖微球的制備 殼聚糖120mg溶于2 %的醋酸水溶液4_6ml，配成2%的殼聚糖溶液，靜置除氣泡后待用；150ml燒杯中加入80ml液體石蠟，調(diào)整攪拌速度至lOOOrpm，滴加乳化劑Span-804ml ;用無菌注射器將殼聚糖溶液逐滴加至液體石蠟中，攪拌乳化至顏色呈均一穩(wěn)定乳白色(攪拌I小時(shí)，lOOOrpm, 37度水浴)；加入0. 4ml的50 %戊二醛溶液與殼聚糖交聯(lián)固化，攪拌固化I小時(shí)(lOOOrpm, 37度水浴)，靜置固化20分鐘，淡黃色微球沉淀于杯底；傾去上層油相，大量石油醚反復(fù)清洗，倒去上層石油醚，得微球，石油醚室溫?fù)]發(fā)30分鐘，得較干燥殼聚糖微球；(3)載TGF-β 3的殼聚糖緩釋膜制備將步驟(I)殼聚糖不對稱膜裁成直徑為Icm的圓片，準(zhǔn)確稱量TGF-β 3，按殼聚糖微球O. 5mg含TGF-β 3 IOmg懸于IOOul的90%酒精，加入殼聚糖膜多孔層，使微球均勻吸
附到殼聚糖膜的孔隙中得到載TGF-β 3的殼聚糖緩釋膜，如圖I所示，I為致密層、2為多孔層、3為殼聚糖微球。電鏡掃描如圖3所不。
權(quán)利要求
1.一種載TGF-￠3的緩釋組織工程膜的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行 (1)殼聚糖不對稱膜的制備 a、致密層的形成 殼聚糖溶于I %的醋酸水溶液，配制成2 %的殼聚糖溶液，4°C離心5min，去除雜質(zhì)，靜置除氣泡后待用dfl.Oml上述溶液澆入直徑9cm培養(yǎng)皿中，室溫放置24h自然晾干形成致密層； b、多孔層的形成 再將3ml的殼聚糖溶液傾入放置致密層的培養(yǎng)皿中，-20°C預(yù)凍Ih后冷凍干燥形成多孔層得到殼聚糖不對稱膜； (2)殼聚糖微球的制備 殼聚糖120mg溶于2 %的醋酸水溶液4-6ml，配成2 %的殼聚糖溶液，靜置除氣泡后待用；150ml燒杯中加入80ml液體石臘,調(diào)整攪拌速度至IOOOrpm,滴加乳化劑Span-80 4mI ；用無菌注射器將殼聚糖溶液逐滴加至液體石蠟中，攪拌乳化至顏色呈均一穩(wěn)定乳白色；力口入0. 4ml的50 %戊二醛溶液與殼聚糖交聯(lián)固化，攪拌固化I小時(shí)，靜置固化20分鐘，淡黃色微球沉淀于杯底；傾去上層油相，大量石油醚反復(fù)清洗，倒去上層石油醚，得微球，石油醚室溫?fù)]發(fā)30分鐘，得較干燥微球； (3)載TGF-P3的殼聚糖緩釋膜制備 將步驟(I)殼聚糖不對稱膜裁成直徑為Icm的圓片，準(zhǔn)確稱量TGF-P 3，按殼聚糖微球0.5mg含TGF-P 3 IOmg懸于IOOul的90%酒精，加入殼聚糖膜多孔層，使微球均勻吸附到殼聚糖膜的孔隙中得到載TGF-P 3的殼聚糖緩釋膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述載TGF-P3的緩釋組織工程膜的制備方法，其特征在于所述用無菌注射器將殼聚糖溶液逐滴加至液體石蠟中，在37度水浴下IOOOrpm攪拌乳化至顏色呈均一穩(wěn)定乳白色。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述載TGF-P3的緩釋組織工程膜的制備方法，其特征在于所述加入0. 4ml的50%戊二醛溶液與殼聚糖交聯(lián)固化，在37度水浴下IOOOrpm攪拌固化I小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種載TGF-β3的緩釋組織工程膜的制備方法，包括(1)殼聚糖不對稱膜的制備；(2)殼聚糖微球的制備；(3)載TGF-β3的殼聚糖緩釋膜制備。本發(fā)明載TGF-β3的緩釋組織工程膜，能夠達(dá)到很好的緩釋效果，持續(xù)釋放TGF-β3，具有持續(xù)很好的抗粘連作用，同時(shí)由于是膜狀應(yīng)用范圍很廣也很靈活，用于骨科中抗粘連的治療效果非常好。
文檔編號A61L31/04GK102657897SQ20121015835
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者張正治, 杜全印, 熊雁, 王子明, 王愛民, 蔣科 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院