專利名稱：多糖顆粒疫苗的制作方法
多糖顆粒疫苗
背景技術(shù)：
綴合疫苗通常通過(guò)將抗原與載體蛋白共價(jià)連接來(lái)產(chǎn)生。所產(chǎn)生的免疫原然后經(jīng)常施用于細(xì)菌多糖用于預(yù)防細(xì)菌疾病。使用綴合疫苗的一個(gè)缺點(diǎn)是抗原與蛋白化學(xué)綴合有困難。因此，不需要蛋白與碳水化合物直接綴合的實(shí)質(zhì)綴合疫苗將是高度合意的，其中抗原和蛋白以與目標(biāo)細(xì)胞緊密締合的方式存在。通過(guò)PRINT 技術(shù)(Liquidia Technologies, North Carolina)制造的微粒和納米粒提供控制其化學(xué)組成、粒徑、顆粒形狀、表面官能度以及其他物理和化學(xué)特性的微粒和納米粒。在本發(fā)明中使用該技術(shù)使得抗原與載體蛋白能夠共包裝以刺激免疫反應(yīng)。PRINT 顆粒之前已被描述于，例如 US 2009-0028910,WO 2008/11886UW0 2009/111588,US2009-0165320、US 2007-0275193、US 2007-0264481、US 2008-0131692、WO 2008/127455、US 2008-0181958、US 2009-0098380 和 WO 2009/132206 ;每一篇通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。本文進(jìn)一步描述PRINT 顆粒。 發(fā)明概沭
本發(fā)明的目的之一在于制備可與多種多糖(PS) —起利用的單顆粒組合物。備選地，如果單顆粒組合物不或不能容納選擇的PS，那么另一目的是對(duì)給定適應(yīng)證或靶標(biāo)開(kāi)發(fā)一批可容納目標(biāo)PS的顆粒組合物。本發(fā)明一個(gè)方面是一種包含含有實(shí)質(zhì)上均勻組合物的模塑顆粒的免疫原性組合物，其中所述實(shí)質(zhì)上均勻組合物包含免疫原性量的與多糖締合的載體蛋白。本發(fā)明一個(gè)特定方面是一種包含含有非交聯(lián)組合物的模塑顆粒的免疫原性組合物，所述非交聯(lián)組合物包含約10-20 丨％的聚合物、約60-70 wt%的蛋白和約10-25 wt%的多糖。本發(fā)明另一個(gè)方面是一種優(yōu)化多糖疫苗性能的方法，所述方法是通過(guò)使模塑的二維陣列顆粒的免疫原性多糖或免疫原性蛋白組分的類型或化學(xué)計(jì)量學(xué)變化和測(cè)試所述顆粒的性能。本發(fā)明另一個(gè)方面是一種用于制造多糖疫苗的系統(tǒng)，其包括選擇與蛋白和多糖相容的基質(zhì)組合物和通過(guò)在聚合物模具中模塑組合物從所述組合物形成顆粒，其中所述組合物包含約90-99. 9 wt%的蛋白和約10-0. I wt%的多糖。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，多糖是肺炎球菌多糖。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，載體蛋白和/或多糖呈基質(zhì)的形式。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒是非交聯(lián)的或交聯(lián)的。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫原性組合物另外包含選自以下的基質(zhì)實(shí)質(zhì)上非免疫原性蛋白、糖、聚合物和疏水物。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，免疫原性組合物另外包含聚合物，其中所述聚合物物理上迫使載體蛋白與多糖締合。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，多糖或載體蛋白被吸附在顆粒表面上。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，載體蛋白占90 wt%-99. 9 wt%,和多糖占10 wt%_0. Iwt%。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，載體蛋白包含90 wt%-99. 9 wt%的卵白蛋白、CRM或HSA，和多糖包含10 wt%-0. I wt%的肺炎球菌多糖14。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，聚合物包含約16 wt%的PLGA。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白包含約66 wt%的卵白蛋白、CRM或HSA。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，多糖包含約18 wt%的肺炎球菌多糖14。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，基質(zhì)組合物包含不降低蛋白或多糖免疫原性的組分和處理。發(fā)明詳沭
如本文所述，已制造和/或預(yù)期多種顆粒組合物以形成實(shí)質(zhì)綴合PS疫苗顆粒。制造的顆粒通常包含由載體蛋白與目標(biāo)PS的組合組成的顆粒，其中用交聯(lián)劑處理該組合。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，在自收獲陣列收獲顆粒之前發(fā)生交聯(lián)劑處理。在另一個(gè)例示性實(shí)施方案中，在自陣列收獲顆粒之后發(fā)生交聯(lián)劑處理。在另一個(gè)例示性實(shí)施方案中，將添加劑加入顆?；|(zhì)中，而不是共價(jià)交聯(lián)顆粒，該添加劑提供足以將載體蛋白與PS的締合保持所需時(shí)間的結(jié)合力(例如但不限于電荷-電荷相互作用、吸附、疏水相互作用、相分離、聚合物等)。在另一個(gè)例示性實(shí)施方案中，用包被步驟處理蛋白和PS的顆粒以包裝蛋白和PS。在又一個(gè)例示性實(shí)施方案中，顆粒由非抗原或免疫原性(本文亦稱為無(wú)活性)多糖或蛋白物質(zhì)(例如聚合物)組成，且表面吸附有蛋白和目標(biāo)PS。可在必要時(shí)任選向顆?；|(zhì)中引入添加劑，以維持蛋白、PS或完整蛋白/PS顆粒，添加劑例如但不限于脂質(zhì)、氨基酸、疏水物、聚合物、小分子、脂肪酸、表面活性劑等。用于本發(fā)明的顆粒的其他多糖和/或蛋白混合物技術(shù)和復(fù)合物可發(fā)現(xiàn)于“Formation andcharacterization of amphiphilic conjugates of whey protein isolate (WPI)/xanthan to improve surface activity (形成和表征乳清蛋白分離物(WPI)/黃原膠的兩親性綴合物以改善表面活性)，”A. Benichou等，F(xiàn)ood Hydrocolloids 21 (2007)379 - 391，其通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。顆粒制造 PRINT 顆粒
在例示性實(shí)施方案中，可在PRINT 顆粒中包含合成的生物相容性聚合物。根據(jù)這樣的實(shí)施方案，一些實(shí)例包括但不限于包含一個(gè)或多個(gè)可交聯(lián)的半胱氨酸殘基的合成多肽、包含一個(gè)或多個(gè)二硫基的合成多肽、直鏈或支鏈聚亞烷基二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酰胺、聚異丙基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙交酯/乙交酯、其組合等。根據(jù)另外的例示性實(shí)施方案，可與本發(fā)明的顆粒組合使用的合成聚合物包括但不限于包含半胱氨酸殘基的合成多氨基酸、包含二硫基的合成多氨基酸、修飾以包含游離巰基的聚乙烯醇、修飾以包含游離二硫基的聚乙烯醇、修飾以包含游離巰基的聚甲基丙烯酸羥乙酯、修飾以包含游離二硫基的聚甲基丙烯酸羥乙酯、修飾以包含游離巰基的聚丙烯酸、修飾以包含游離二硫基的聚丙烯酸、修飾以包含游離巰基的聚乙基噁唑啉、修飾以包含游離二硫基的聚乙基噁唑啉、修飾以包含游離巰基的聚丙烯酰胺、修飾以包含游離二硫基的聚丙烯酰胺、修飾以包含游離巰基的聚乙烯吡咯烷酮、修飾以包含游離二硫基的聚乙烯吡咯烷酮、修飾以包含游離巰基的聚亞烷基二醇、修飾以包含游離二硫基的聚亞烷基二醇、其組合等。生物相容性材料/聚合物可為生物可降解的。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫細(xì)胞靶向的微粒和/或納米粒的預(yù)定幾何學(xué)包括實(shí)質(zhì)上球形的、實(shí)質(zhì)上非球形的、實(shí)質(zhì)上病毒狀的、實(shí)質(zhì)上細(xì)菌狀的、實(shí)質(zhì)上蛋白狀的、實(shí)質(zhì)上細(xì)胞狀的、實(shí)質(zhì)上棒狀的、實(shí)質(zhì)上手性狀的、實(shí)質(zhì)上直角三角形、實(shí)質(zhì)上平碟狀的等。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，顆粒具有小于約100微米的最寬尺寸，例如約I nm-約50微米，例如約50 nm-約10微米、例如約100 nm-約I微米、例如約100 nm-約500 nm。在其他實(shí)施方案中，顆?？删哂蓄A(yù)定的幾何學(xué)特性。根據(jù)一些例示性實(shí)施方案，幾何學(xué)特性包括具有兩個(gè)實(shí)質(zhì)上平直和實(shí)質(zhì)上平行的邊的形狀、預(yù)定的曲率半徑、兩邊之間的預(yù)定角度、具有預(yù)定寬度的實(shí)質(zhì)上的平面、兩個(gè)實(shí)質(zhì)上的平面、實(shí)質(zhì)上平行的兩個(gè)實(shí)質(zhì)上的平面、實(shí)質(zhì)上平行且配置為離開(kāi)受控間距的兩個(gè)實(shí)質(zhì)上的平面、其中兩個(gè)實(shí)質(zhì)上的平面以預(yù)定角度鄰接的兩個(gè)實(shí)質(zhì)上的平面等。在更另外的例示性實(shí)施方案中，顆粒被配置為球形、球體樣或球形化的形狀。根據(jù)這樣的實(shí)施方案，當(dāng)在模腔中時(shí)、從模腔收獲后并在收獲陣列上時(shí)、或者從模腔收獲后并在收集或溶液中時(shí)，顆粒在給定溫度或之上可自發(fā)球形化(包含生物或敏 感組成的組合物的相對(duì)低的熔點(diǎn))。在一些實(shí)施方案中，顆粒的形狀沒(méi)有控制顆?；瘜W(xué)組成、PS比、載體蛋白比或第三方基質(zhì)組成比關(guān)鍵。PRINT 技術(shù)通常使用由材料(例如硅酮、基于全氟聚醚的彈性體(PFPE)或其他基于烴的材料)制備的低表面能模具，以在主模板上復(fù)制微米級(jí)或納米級(jí)結(jié)構(gòu)。PRINT 模具中使用的聚合物在室溫通常為液體，并通常光化學(xué)交聯(lián)為能夠高分辨復(fù)制微米級(jí)或納米級(jí)結(jié)構(gòu)的彈性體固體。然后當(dāng)與主模板接觸時(shí)，液體聚合物被“固化”，藉此在主模板上形成該結(jié)構(gòu)的復(fù)制映像。通過(guò)固化(熱或光化學(xué))或通過(guò)玻璃化和或結(jié)晶冷卻，可發(fā)生與主模板接觸的模具的固化。當(dāng)自主模板移除聚合物模具，聚合物形成包含主模板的微米級(jí)或納米級(jí)特征的腔或凹陷復(fù)制的有圖案模板，固化液體聚合物中的微米級(jí)或納米級(jí)腔可用于高分辨微?；蚣{米粒制造。PRINT 技術(shù)能夠制造同時(shí)控制結(jié)構(gòu)(例如，形狀、尺寸和組成)和功能(例如，表面結(jié)構(gòu))的單分散有機(jī)和無(wú)機(jī)納米粒。PRINT 技術(shù)是能夠形成以下顆粒的第一種常規(guī)獨(dú)特方法i)尺寸單分散且形狀均勻；ii)可被模塑為任何形狀；iii)可基本上由任何基質(zhì)材料組成；iv)可在極其溫和的條件下形成(與易碎載物相容)；v)順應(yīng)功能化后化學(xué)(例如，生物綴合活性物質(zhì)和/或靶向組分)；和“)其最早在可訪問(wèn)的2-D陣列中制造顆粒(其開(kāi)創(chuàng)組合方法，因?yàn)轭w?？杀弧皸l形碼化”)。在形成順應(yīng)本文所列的PRINT 方法的預(yù)聚物混合物中，當(dāng)設(shè)計(jì)PRINT 納米粒載體系統(tǒng)時(shí)，待考慮的技術(shù)方面包括1)顆粒載物或基質(zhì)材料與聚合物PRINT 模具材料的相容性，2)載物釋放所需的顆粒降解概況，3)靶向方法，4)顆粒模量和5)第1-4點(diǎn)的組合?？赏ㄟ^(guò)經(jīng)由合理選擇單體來(lái)調(diào)節(jié)預(yù)聚物基質(zhì)的親水性以匹配載物的親水性，解決載物/預(yù)聚物基質(zhì)相容性。本文討論顆粒降解和靶向。可通過(guò)改變顆粒內(nèi)的交聯(lián)程度和/或引起其物理纏結(jié)的顆粒成分，調(diào)節(jié)顆粒的模量和穩(wěn)健性(robustness)。最后,視需要,可通過(guò)加入共單體或共溶劑以改變單體溶液的物理性質(zhì)，優(yōu)化用于PRINT 制造的顆粒配方。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒包含蛋白基質(zhì)和PS，其中顆?？蔀榻宦?lián)的。在一些特定實(shí)施方案中，當(dāng)在收猶陣列中時(shí)或在顆粒制造后的溶液中收集后，使蛋白和PS顆粒組合物經(jīng)受交聯(lián)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白基質(zhì)是顆粒組合物中的主要組分。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，PS基質(zhì)是顆粒組合物中的主要組分。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒組合物中包含聚合物以物理保持多糖與蛋白締合。在又一個(gè)特定實(shí)施方案中，聚合物組分是顆粒的主要組分，且蛋白和多糖被吸附到聚合物顆粒的表面。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白組分是顆粒的主要組分，且多糖被吸附到蛋白顆粒的表面。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，PS組分是顆粒的主要組分，且蛋白被吸附到PS顆粒的表面。在另一個(gè)例示性實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒包含蛋白、PS和其他第三方基質(zhì)組分，其中該組分不限于蛋白、非免疫原性蛋白、非抗原、糖、聚合物、疏水分子、小分子、鹽等。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒是共價(jià)交聯(lián)的，而在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒不是共價(jià)交聯(lián)的。在另一個(gè)例示性實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒包含核心，核心包括但不限于載體蛋白或者載體蛋白與第三方基質(zhì)組分的混合物，其中顆粒的表面已被修飾以降低溶解度，并在表面上亦包含一種或多種目標(biāo)多糖。表面修飾可包括但不限于顆粒制造后用例如PS和疏水分子的混合物包被顆粒表面。
在另一個(gè)例示性實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒包含核心，核心包括但不限于載體蛋白和PS或者載體蛋白或蛋白、PS與第三方基質(zhì)組分的混合物，其中顆粒的表面已被修飾以降低溶解度。表面修飾可包括但不限于顆粒制造后包被顆粒表面，并亦可包含設(shè)計(jì)用以遞送顆粒至特異性B細(xì)胞群的組分。在另一個(gè)例示性實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒包含含有PS和流感血凝素蛋白的顆粒，其溶解度是通過(guò)包含具有與血凝素蛋白結(jié)合的唾液酸表位的基質(zhì)組分降低的。作為共價(jià)結(jié)合的有利備選，PS和載體蛋白與顆粒的非共價(jià)締合可用于本發(fā)明。例示性實(shí)施方案包括但不限于以下情況其中蛋白和PS通過(guò)離子相互作用、吸附、疏水相互作用、相分離、物理纏結(jié)等與顆粒締合、結(jié)合或連接。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，顆粒包含PS、物質(zhì)(例如脂質(zhì)或聚合物)和吸附于顆粒表面的載體蛋白。本文使用的第三方基質(zhì)指添加劑、修飾劑、乳化劑、粘合劑或配體，其可被摻入顆粒組合物中以給予獨(dú)特和/或有利性質(zhì)，性質(zhì)例如穩(wěn)定性(熱/pH)、同質(zhì)性、均勻包裝密度、多孔性、表面性質(zhì)和電荷。例示性第三方基質(zhì)組分包括但不限于PLGA、PLA、聚酐、PLGA-b-PEG、聚己酸內(nèi)酯、殼聚糖、GRAS材料(例如阿拉伯半乳聚糖)、山崳酸、氨基酸(例如L-精氨酸或亮氨酸)、非免疫原性蛋白(例如人血清白蛋白或明膠)或聚離子性(生物)聚合物(聚丙烯酸、殼聚糖、肝素、透明質(zhì)酸(hylaronic acid)),其中PS和載體蛋白與這樣的組分預(yù)混合。這樣的組分可促進(jìn)蛋白-多糖的包封。摻入的低分子量乳化劑(例如在食品中使用的那些)可與聚合物(例如PLGA或PLGA樣聚合物)組合使用。例示性低分子量乳化劑包括但不限于大豆卵磷脂、甘油脂肪酸酯、蔗糖、脂肪酸酯和疏水氨基酸(例如亮氨酸)。在脂肪酸的情況下，脂肪酸(酯化和非酯化)對(duì)蛋白(例如卵白蛋白、HSA等)的親和力來(lái)源于氨基酸側(cè)鏈和脂肪酸羧基碳之間存在的不同離子和/或氫鍵合相互作用。這些相互作用可另外受脂肪酸鏈的大小調(diào)節(jié)。例如，油酸酯比棕櫚酸酯更緊密地結(jié)合人和鼠白蛋白，而對(duì)牛白蛋白證明為相反。此外，載體蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)通常通過(guò)非局部相互作用來(lái)穩(wěn)定-最常見(jiàn)的是形成疏水核心(除此之外還有例如鹽橋、氫鍵、二硫鍵、和甚至翻譯后修飾)。該三級(jí)結(jié)構(gòu)似乎充當(dāng)?shù)鞍谆竟δ艿幕A(chǔ)。天然疏水的小分子氨基酸能夠適應(yīng)蛋白支架的內(nèi)部疏水結(jié)合口袋，因此給予結(jié)構(gòu)和化學(xué)穩(wěn)定性和性質(zhì)。亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸是可在用于吸入的噴霧干燥粉末中用作“分散性增強(qiáng)劑”的例示性氨基酸，并已知其修飾噴霧干燥顆粒的霧化特性。此外，配體疏水性與蛋白穩(wěn)定之間有關(guān)聯(lián)已知最疏水的配體異亮氨酸引起LIV蛋白的最顯著穩(wěn)定化。在一個(gè)例不性實(shí)施方案中，交聯(lián)劑和帶電分子亦是第三方基質(zhì)的一部分。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，顆粒呈多糖和蛋白的基質(zhì)的形式，其中多糖蛋白比范圍是約1:99-約99: I。在備選的實(shí)施方案中，多糖:蛋白比是約2:98、3:97、4:96、5:95、6:94,7:93,8:92,9:91或10:90。在其他實(shí)施方案中，多糖蛋白比范圍是約10:90-約 90:10，分別例如約15:85、例如約20:80、例如約30:70、例如約40:60、例如約50:50、例如約60:40、例如約70:30或例如約80:20。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，PVP/PEG的高分子量溶液用于收獲和交聯(lián)以保持蛋白顆粒對(duì)水性加工步驟不溶。在其他例示性實(shí)施方案中，溶解抑制技術(shù)包括使用交聯(lián)劑(例如但不限于戊二醛、谷氨酸、同型雙官能NHS和酰亞胺酯)、疏水分子(例如但不限于亮氨酸、脂質(zhì)和脂肪酸)、選擇的顆粒包被聚合物(例如但不限于GRAS、PLGA等)、脂質(zhì)和非共價(jià)相互作用(例如但不限于電荷、白蛋白和疏水物)。用于本發(fā)明的合適多糖包括細(xì)菌多糖以及癌細(xì)胞的碳水化合物或者其他非自身或靶細(xì)胞碳水化合物。在單獨(dú)特定的實(shí)施方案中，多糖是肺炎球菌多糖(PnP) 4和14。在多種例示性實(shí)施方案中，其他PNP和多糖選自紐莫法raz)、腦膜炎球菌(MeningococcaD、傷寒、細(xì)胞表面糖脂、糖蛋白、b型流感嗜血菌{Haemophilusinfluenzae) (HiB)、葡萄球菌屬、衣原體、B型腦膜炎球菌(Mening B)、艱難梭菌{C. Difficile)、假單孢菌屬iPseudomonas)、A和B型鏈球菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌iBscherichia coli) (ETEC)、結(jié)核(TB)、志賀氏菌屬{Shigella、、傷寒沙門氏菌{Salmonella肉毒桿菌、痕疫、伯克氏菌屬(Jkirkholderia)等。例不性多糖包括但不限于肺炎鏈球菌^Streptococcus pneumoniae)的PnP4、PnP6B、PnP9V、PnP 14、PnP 18C、PnP 19F、PnP23F、PnPl、PnP3、PnP5、PnP6A、PnP7F 和 PnP 19A。用于本發(fā)明的合適載體蛋白包括但不限于CRM 197、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、血凝素、腦膜炎球菌表面蛋白和莢膜蛋白。CRM197是來(lái)源于白喉毒素(DT)的無(wú)毒、突變蛋白的實(shí)例，其早就被識(shí)別為無(wú)毒蛋白并常被用作綴合疫苗的載體?；谄錈o(wú)毒特征，該蛋白已被用于多種目的，包括作為肝素結(jié)合EGF樣生長(zhǎng)因子(HB-EGF)的抑制劑和作為疫苗的免疫佐劑。其他合適載體蛋白包括但不限于肺炎球菌=PcsB-(B型鏈球菌的細(xì)胞壁分離所需的蛋白)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(StkP) (Intercell);金黃色葡萄球菌{S. Aureus)凝集素樣序列(Als)，包括促進(jìn)黏附于內(nèi)皮細(xì)胞的Als3 (亦用于念珠菌屬{Candida)的抗原)(Novadigm)、聚集因子A (ClfA) (Wyeth/Pfizer)、聚集因子B (ClfB)、鐵表面決定簇B (IsdB)、Cna-FnBP融合蛋白、聚-N-乙酰葡萄糖胺；腦膜炎B :GNA1870，亦命名為因子H結(jié)合蛋白(fHbp)或rLP-2086 (Novartis) ;B型鏈球菌蛋白抗原C、R和X。不同PS之間在化學(xué)和/或物理結(jié)構(gòu)中的變化可能需要顆粒制造化學(xué)、組成、添加齊U、設(shè)計(jì)等形式的不同處理，以維持、優(yōu)化或容納特定PS的官能度、相互作用或呈遞。例如，本文所述的Prevnar 的7個(gè)PS中的數(shù)個(gè)包括反應(yīng)基(例如羧酸基、胺基)、磷酸酯/磷酸化糖等，其可為交聯(lián)或另外反應(yīng)并改變PS的識(shí)別、呈遞、功能等的位點(diǎn)。此外，在備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供顆粒組成、尺寸和形狀可調(diào)性以容納多糖的備選構(gòu)象表位，其可在這種表位或多糖的免疫原性和生物反應(yīng)性中起作用。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，蛋白和多糖經(jīng)由技術(shù)(例如噴霧干燥、超濾、乳化等)吸附于“其他”顆粒。本發(fā)明中可使用的組合物、組分、物質(zhì)、技術(shù)和化學(xué)另外公開(kāi)于例如US20080009606 ；uTheoretical stability maps for guiding preparation of emulsionsstabilized by protein-poly saccharide interfacial complexes (用于指導(dǎo)制備為蛋白-多糖界面復(fù)合物所穩(wěn)定的乳劑的理論穩(wěn)定性圖)”，Cho YH等，Lan咖uir, 2009年6月16日；25 (12):6649-57 ；US 7,601, 381 ；US 20090238885 ;“Gel particles from spray-drieddisordered polysaccharide (來(lái)自噴霧干燥的無(wú)序多糖的凝膠顆粒)”，Paulomi Burey等，Carbohydrate Polymers,第 76 卷,第 2 期,2009 年 3 月 17 日，第 206-213 頁(yè)；每一篇通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，多糖吸附于PRINT 顆粒的表面，例如通過(guò)將基質(zhì)組合 物引入包被/包封顆粒的收獲陣列中或上存在的多糖中。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，待處理的顆粒是PLGA-DC-膽固醇顆粒，其產(chǎn)生多糖包被的PLGA-DC-Chol納米粒/微粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多糖可另外與聚合物(例如Pv0H、PvP、Luvitec等)混合。換句話說(shuō)，可將無(wú)活性組合物的顆粒收獲到活性組合物(例如抗原)的或包含其的收獲層上。在這樣的一個(gè)實(shí)施方案中，顆粒在收獲層中與活性物質(zhì)吸附、結(jié)合、進(jìn)行電荷相互作用、化學(xué)連接、物理連接或另外締合并形成疫苗。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，從DC-膽固醇/PLGA制造PRINT 顆粒并收獲在多糖薄膜上，有或沒(méi)有蛋白或者蛋白的次級(jí)吸附。收獲聚合物稀釋劑；存在具有多包被收獲層(例如，在PV0H、透明質(zhì)酸、葡聚糖、黃原膠的薄膜之上的多糖)的選擇；和基質(zhì)添加劑篩查。第三方基質(zhì)代表另一例示性實(shí)施方案，其中其他蛋白基質(zhì)充當(dāng)吸附于顆粒表面的多糖/蛋白的載體。合適的基質(zhì)包括但不限于有或沒(méi)有糖的MSA/HSA/明膠，其中MSA是小鼠血清白蛋白，HAS是人血清白蛋白。其他載體多糖基質(zhì)包括，例如透明質(zhì)酸或任何粘合劑材料例如膠(例如瓜爾膠)天然粘合劑以及衍生物例如海藻酸鹽、殼聚糖、明膠和明膠衍生物。膠和葡聚糖代表亦可使用的特定實(shí)施方案。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，這些材料是除了(多糖和蛋白)共混物外的基質(zhì)的一部分。在另一個(gè)例示性實(shí)施方案中，這些材料是收獲層的一部分。在又一個(gè)實(shí)施方案中，這些材料與PLGA或PLGA樣聚合物(親水-疏水基質(zhì))以特定百分比作為共混物聯(lián)合使用?？稍诓簧婕肮矁r(jià)交聯(lián)的顆粒基質(zhì)組合物中起必要作用的聚合物包括但不限于疏水聚合物(例如PLGA、PLA、PLLA)、聚己酸內(nèi)酯、明膠、瓊脂糖、瓊脂膠、瓊脂、脂質(zhì)、可降解的PEG、人工蛋白和聚酐。該看法的原理在于，預(yù)混合特定量的PLGA與(蛋白和多糖)共混物可使顆粒保持在一起，而不需要化學(xué)交聯(lián)主要組分(載體蛋白和多糖)。PEG亦可用作粘合劑和基質(zhì)形成劑。疏水聚合物例如但不限于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚維酮通常在形成模塑微粒和納米粒中被用作收獲層。已知合成聚合物(例如Luvitec/聚維酮、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙烯酸衍生物(例如Eudragit、Carbopol))能夠使得顯著的膜形成、起始粘著和粘附于不同材料、復(fù)合物形成的能力高、穩(wěn)定和溶解能力好、對(duì)pH變化不敏感、易被輻射誘導(dǎo)的交聯(lián)性以及生物相容性好。蛋白變性是水性溶液的溫度和pH的函數(shù)。雖然較高的溫度通?？杉铀倬Y合反應(yīng)，但是較高的溫度亦可引起蛋白的熱變性。雖然在PRINT 顆粒制造期間這可能是真的，但是以升高的濃度加入一些上文提及的這些粘合劑或添加劑(例如多糖或PLGA)可保護(hù)蛋白免受熱變性。此外，多糖(作為粘合劑)/聚合物(PLGA樣)亦可在防止過(guò)多蛋白變性和/或聚集中充當(dāng)保護(hù)試劑。本發(fā)明的多種例示性實(shí)施方案涉及用戊二醛交聯(lián)的顆粒的備選組合物。顆粒用或通過(guò)離子相互作用保持在一起。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒組合物包含下述組分卵白蛋白、多糖、甘油、氨基胍、稀釋劑H20:IPA 7:3。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，組分具有下述比卵白蛋白(10%)、多糖(2.5%)、甘油(10%)、氨基胍(10%)、稀釋劑H20:IPA 7:3。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，顆粒通過(guò)與顆粒的基質(zhì)組合的同型雙官能交聯(lián)劑保持 在一起。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒具有下述組成卵白蛋白、多糖、甘油、酰亞胺酯接頭和稀釋劑H20:IPA 7:3。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，組分具有下述比卵白蛋白(10%)、多糖(2.5%)、甘油(10%)、酰亞胺酯接頭(10%)和稀釋劑H20:IPA 7:3。在本發(fā)明的其他特定實(shí)施方案中，顆粒具有下述組成與卵白蛋白組合的PLGA-葡聚糖共混物、多糖、甘油和稀釋劑H20:IPA 7:3。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒具有呈下述比的下述組成與卵白蛋白(10%)組合的PLGA (1%)-葡聚糖(2. 5%)共混物、多糖(2.5%)、甘油(10%)和稀釋劑H20:IPA 7:3。在本發(fā)明的其他特定實(shí)施方案中，顆粒具有下述組成與卵白蛋白組合的PLGA-黃原膠共混物、多糖、甘油、稀釋劑H20: IPA 7:3。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒具有呈下述比的下述組成與卵白蛋白(10%)組合的PLGA (1%)-黃原膠(0. 625%)共混物、多糖(2.5%)、甘油(10%)、稀釋劑H20:IPA 7:3。本發(fā)明的免疫原性組合物可包含其他物質(zhì)、賦形劑或穩(wěn)定劑。例如，為了通過(guò)增加納米粒的負(fù)(電位來(lái)增加穩(wěn)定性或降低非特異性攝取，可加入某些帶負(fù)電荷的組分。這種帶負(fù)電荷的組分包括但不限于由甘膽酸、膽酸、鵝脫氧膽酸、?；悄懰帷ⅨZ脫氧甘膽酸、鵝脫氧?；悄懰?、石膽酸、熊脫氧膽酸、脫氫膽酸等組成的各種膽汁酸的膽汁鹽；包含基于卵磷脂(蛋黃)的磷脂的磷脂，其包括下述磷脂酰膽堿棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰亞油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰亞油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰二十烷酰磷脂酰膽堿和二棕櫚酰磷脂酰膽堿。其他磷脂包括L-a-二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)和其他相關(guān)化合物。帶負(fù)電荷的表面活性劑或乳化劑亦適合作為添加劑，例如膽固醇硫酸酯鈉等。類似地，可通過(guò)加入帶正電荷的組分來(lái)改變納米粒的正(電位。適合口服給藥的制劑的組成可為(a)液體溶液劑，例如在稀釋劑(例如水、鹽水、果汁、橙汁等)中溶解有效量的顆粒，(b)膠囊劑、囊劑或片劑，各包含預(yù)定量的顆粒作為固體或顆粒，(C)合適液體中的混懸劑和(d)合適的乳劑。片劑形式可包含乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維、阿拉伯樹(shù)膠、明膠、膠體二氧化硅、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸和其他賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、防腐劑、矯味劑以及藥理學(xué)相容的賦形劑中的一種或多種。糖錠劑形式可包含香料(通常為蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠或西黃蓍膠)中的顆粒，以及包含活性成分在惰性基質(zhì)(例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠)中的錠劑，除了活性成分外還包含這樣的賦形劑的乳劑、凝膠劑等是本領(lǐng)域已知的。合適的藥學(xué)載體、賦形劑和稀釋劑的實(shí)例包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯樹(shù)膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、西黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯卩比咯烷酮、纖維素、水、鹽水溶液、糖漿、甲基纖維素、甲基羥苯酸酯和丙基羥苯酸酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。制劑可另外包含潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和助懸劑、防腐劑、甜味劑或矯味劑。適合胃腸外給藥的免疫原性制劑包括水性和非水性等滲無(wú)菌注射溶液(其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得制劑與目標(biāo)受體的血液相容的溶質(zhì))和水性和非水性無(wú)菌混懸劑(其可包含助懸劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑)。制劑可存在于單劑量或多劑量密封容器(例如安瓿和小瓶)中，并可在冷凍干燥(凍干)條件下儲(chǔ)存，在臨使用前僅需加入無(wú)菌液體賦形劑，例如注射用水。可從之前描述種類的無(wú)菌散劑、顆粒劑和片劑制備臨時(shí)的注射溶液和混懸劑。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物被配制為具有約4. 5-約9. 0 的pH范圍，包括例如約5. 0-約8. O、約6. 5-約I. 5和約6. 5-約I. 0的任何pH范圍。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物的PH被配制為不小于約6，包括例如不小于約6. 5、7或約8的任何值。亦可通過(guò)加入合適的張度調(diào)節(jié)劑(例如甘油)將免疫原性組合物制備為與血液等滲?？蓪⒈疚乃龅陌庖呒?xì)胞靶向的微粒和/或納米粒的免疫原性組合物經(jīng)由多種途徑給予受試者(例如人)，途徑例如胃腸外，包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、口服、吸入、囊內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、鞘內(nèi)或經(jīng)皮。例如，可通過(guò)吸入至呼吸道的靶免疫細(xì)胞給予納米粒組合物。在一些實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)給予納米粒組合物，而在其他實(shí)施方案中，口服給予納米粒組合物。本發(fā)明免疫原性組合物在給予時(shí)提供免疫細(xì)胞靶向的微粒和/或納米粒的較好生物分布，并另外使得能夠增加穩(wěn)定性。以這種方式，在靶位點(diǎn)上遞送了較多的活性物質(zhì)。數(shù)據(jù)
已進(jìn)行了兩個(gè)體內(nèi)研究最初的研究使用(i)作為載體蛋白的OVA (無(wú)非內(nèi)毒素)和PnP4 (備選地PnP14);和(ii)基于吸附的理論與吸附有PnP4 (備選地PnP14)的聚合物顆粒。在隨訪研究中，再次測(cè)試OVA (無(wú)非內(nèi)毒素)蛋白載體，并將研究擴(kuò)大至測(cè)試無(wú)內(nèi)毒素OVA以及HSA與PnP4 (備選地PnP 14)的組合。如下文所示，加強(qiáng)免疫前數(shù)據(jù)與加強(qiáng)免疫后I周和加強(qiáng)免疫后2周一樣顯示顯著的IgG反應(yīng)。引人關(guān)注地，用可溶性對(duì)照PnP14在初次免疫注射PRINT 顆粒后的加強(qiáng)免疫在加強(qiáng)免疫后I周和2周顯不IgG反應(yīng)。與Prevnar (領(lǐng)先的現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品)相反，對(duì)于PRINT 顆粒，初次免疫后效價(jià)始終顯示IgG反應(yīng)。在一個(gè)顆粒組中，在初次免疫后兩周，PnP14 IgG效價(jià)顯示PRINT 顆粒具有是Prevnar 2倍大的IgG反應(yīng)。作為對(duì)照，注射可溶性O(shè)VA與可溶性PnP14未產(chǎn)生可觀察的抗體效價(jià)。在例示性實(shí)施方案中，顆粒組合物可包含與蛋白/多糖組合物混合的聚合物。在特定實(shí)施方案中，聚合物包括生物相容性或生物可降解聚合物，并可為O-約5 Wt %、約0. 5-約 5 wt %、約 0. 5-約 4 wt %、約 0. 5-約 3 wt %、約 0. 5-約 2 wt %、約 0. 5-約 I. 5 wt%、約1.5 wt %或約I wt %。在其他特定實(shí)施方案中,顆粒組合物中的蛋白與多糖比可為約 99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80或10:90。在一些例示性實(shí)施方案中，聚合物給顆粒增加物理穩(wěn)定性并幫助維持多糖與蛋白的物理締合。在一些實(shí)施方案中，將聚合物選擇為生物相容性、生物可降解、受控降解等聚合物。本發(fā)明的另外例示性實(shí)施方案包括聚合物與蛋白和多糖組合的的顆粒。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒是非交聯(lián)的，并包含16 wt%的聚合物、66 wt%的蛋白和18 wt%的多糖。在這種的具體實(shí)施方案中，聚合物包含PLGA。在這種的具體實(shí)施方案中，多糖包含肺炎球菌多糖14。在這種的具體實(shí)施方案中，蛋白包含卵白蛋白。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，顆粒組合物包含16 wt%的PLGA聚合物、66 wt%的卵白蛋白蛋白和18 wt%的肺炎球菌多糖14。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有蛋白與多糖比為3. 5:1-3. 75:1的多糖疫苗顆粒。本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案包括基于聚合物的多糖疫苗顆粒，其具有的卵白蛋白蛋白與肺炎球菌多糖比為3. 67:1。 在一些例示性實(shí)施方案中，顆粒的形狀沒(méi)有控制顆粒化學(xué)組成、PS比、載體蛋白比或第三方基質(zhì)組成比關(guān)鍵。根據(jù)基于聚合物的多糖疫苗顆粒的若干這些實(shí)施方案，顆?？尚纬蔀榉请x散顆?；蛘哧P(guān)于三維形狀不具有或不維持嚴(yán)格控制，因?yàn)槔缇酆衔锸欠墙宦?lián)的、不是重度交聯(lián)的或者是熱敏感的或溶劑敏感的等。本發(fā)明的另外例示性實(shí)施方案包括蛋白與多糖組合的顆粒。根據(jù)從蛋白和多糖制造的多糖疫苗顆粒，顆粒在制造期間可為交聯(lián)的，或者可在顆粒制造后將交聯(lián)劑引入顆粒中以便形成非綴合的多糖疫苗。在這種的一些例示性實(shí)施方案中，蛋白包含卵白蛋白、CRM或HSA。在這種的一些例示性實(shí)施方案中，蛋白包含卵白蛋白、CRM或HSA，多糖包含肺炎球菌多糖14。在本發(fā)明的多糖疫苗顆粒的一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白包含范圍為約90-約99.9 wt%的卵白蛋白，多糖范圍是約10-0.01 wt%。在模塑這種顆粒后,顆?？捎媒宦?lián)劑處理。在本發(fā)明的多糖疫苗顆粒的一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白包含范圍為約92-約99. 9 wt%的卵白蛋白，多糖范圍是約8-約0.01 wt%。在模塑這種顆粒后，顆粒可用交聯(lián)劑處理。在本發(fā)明的多糖疫苗顆粒的一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白包含范圍為93-99. 9 wt%的卵白蛋白，多糖范圍是7-0. 01 wt%。在模塑這種顆粒后，顆?？捎媒宦?lián)劑處理。在本發(fā)明的多糖疫苗顆粒的一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白包含93. 7 wt%的卵白蛋白，多糖包含約6. 3 wt%的肺炎球菌多糖。在模塑這種顆粒后，顆?？捎媒宦?lián)劑處理。在本發(fā)明的多糖疫苗顆粒的一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白包含約96. 4 wt%的卵白蛋白，多糖包含約3. 6 七％的肺炎球菌多糖。在模塑這種顆粒后，顆?？捎媒宦?lián)劑處理。在多糖疫苗顆粒的一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白包含約99 wt%的卵白蛋白，肺炎球菌多糖約I wt%。在模塑這種顆粒后,顆粒可用交聯(lián)劑處理。在本發(fā)明的多糖疫苗顆粒的一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白包含約99. 7 wt%的卵白蛋白，多糖包含約0. 3 wt%的肺炎球菌多糖。在模塑這種顆粒后,顆?？捎媒宦?lián)劑處理。在多糖疫苗顆粒的一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白包含約99. 97 wt%的卵白蛋白，多糖包含約0.03被％的肺炎球菌多糖。在模塑這種顆粒后，顆?？捎媒宦?lián)劑處理。在一個(gè)備選的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白組分包含約96. 4%的HSA蛋白，多糖組分包含3. 6 wt%。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，多糖疫苗顆粒的蛋白組分包含約45 wt%的CRM蛋白，多糖組分包含約55 wt%的肺炎球菌多糖14。在一些實(shí)施方案中，顆粒的形狀沒(méi)有控制顆?；瘜W(xué)組成、PS比、載體蛋白比或第三方基質(zhì)組成比關(guān)鍵。根據(jù)基于蛋白的多糖疫苗顆粒的一些實(shí)施方案，因?yàn)槔缬媚橙軇┡渲频念w粒在移除該溶劑后剩下多孔或柔軟顆粒等，顆?？尚纬蔀榉请x散顆粒或者關(guān)于三維形狀不具有或不維持嚴(yán)格控制。
實(shí)施例實(shí)施例I :小鼠研究I，交聯(lián)的蛋白/多糖顆粒
通過(guò)將各組分以下述濃度溶解在水中來(lái)制備各顆粒組分的溶液2mg/mL多糖、IOmg/mLCRM197、55mg/mL甘油和55mg/mL卵白蛋白。通過(guò)混合下表中給出的每體積的單獨(dú)組分溶液 來(lái)制備用于制備顆粒的溶液。這些終溶液包含3被％總固體。在所有鑄膜液中，甘油為0.9wt%，卵白蛋白名義上為2 wt%和多糖(PnP4或PnP14)為0. 075 wt%。包含CRM197的溶液為
0.075 wt%的類毒素。
I ieitiSE I^IiLPS^pL TRM1^ I pL 計(jì)油! |iL OVA j pL 水^總體 fc I II <2nig/niL| (IfiiififmLl | (55ms/mL)丨(55n jjtel4 |fpL) |
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ICRMl4J I112,5 HS I4'IJ II4 j9S jJl |
IOVA + PnP4 + —..j' ji(ij
ICRMl1J IMJ IiJ II8 ,6j13 j25 |使用#3 Mayer桿，在5mil生PET上包被鑄膜液，并立刻用冷空氣吹以蒸發(fā)水并形成蛋白、多糖和甘油的薄膜。薄膜目視表現(xiàn)為透明和均勻。通過(guò)用薄膜層壓模具然后通過(guò)加熱夾[溫度205° F、壓力60psi、速度2fpm]，填充具有200nm X 200nm圓筒形腔的Fluorocur模具。在通過(guò)加熱夾后將PET與模具分離，留下填充有薄膜組合物的模腔。然后通過(guò)再次通過(guò)加熱夾[溫度205° F、壓力60psi、速度2fpm]，將填充的模具層壓為L(zhǎng)uvitec包被的PET收獲層。冷卻后，將模具從收獲層剝離，結(jié)果是200nm X 200nm顆粒自模腔轉(zhuǎn)移至收獲層。將顆粒在收獲薄板上4°C保存。戊二醛被用作模塑多糖/蛋白顆粒的交聯(lián)劑。將戊二醛(70%，在水中)應(yīng)用于顆粒陣列。將PET薄板放置在收獲薄板之上，橡膠滾筒用于將戊二醛鋪展到整個(gè)陣列(陣列交聯(lián))。10分鐘后，移除PET薄板。使用聚乙烯葉片細(xì)胞刮棒將顆粒收集到70mM CNBH3Na(aq)中。通過(guò)離心3次沉淀顆粒(30分鐘，11500 X g，4°C )，每次移除上清液并將顆粒重懸到ImL WFI中。注射之前將顆粒進(jìn)一步稀釋到無(wú)菌(0. 22Mm過(guò)濾)0. 1% PVOH 100k/5%甘露糖醇溶媒中。亦測(cè)試吸附顆粒，其中多糖單獨(dú)或者CRM197與多糖兩者吸附到80nm X 320nm陽(yáng)離子性95% PLGA/5% pDMAEMA基礎(chǔ)顆粒的表面。通過(guò)將PLGA/pDMAEMA組合物引入Fluorocur模具腔中、收集并在0. 1% PVOH 100K中純化來(lái)制備基礎(chǔ)顆粒?；A(chǔ)顆粒形成如下的6個(gè)不同組的吸附顆粒I.對(duì)于一組,將水中的18. 2 PnP4加入混懸液中的728吒基礎(chǔ)顆粒中。將混合物渦旋10秒，然后在冰上孵育30分鐘。注射之前將顆粒在無(wú)菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動(dòng)物遞送80呢顆粒和2 I^g PnP4。2.對(duì)于一組，將水中的18. 2吒PnP4加入混懸液中的1092吒基礎(chǔ)顆粒中。將混合物渦旋10秒，然后在冰上孵育30分鐘。注射之前將顆粒在無(wú)菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動(dòng)物遞送120呢顆粒和2 I^g PnP4。3.對(duì)于一組，將水中的18. 2吒CRM197加入混懸液中的728吒基礎(chǔ)顆粒中。然后將水中的18. 2 PnP4加入該混合物中。將混合物渦旋10秒，然后在冰上孵育30分鐘。注射之前將顆粒在無(wú)菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動(dòng)物遞送80吒顆粒、2吒PnP4和2吒CRM197。4.對(duì)于一組，將水中的18. 2吒CRM197加入混懸液中的1092吒基礎(chǔ)顆粒中。然后將水中的18. 2 PnP4加入該混合物中。將混合物渦旋10秒，然后在冰上孵育30分 鐘。注射之前將顆粒在無(wú)菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動(dòng)物遞送120吒顆粒、2吒PnP4和2吒CRM197。5.對(duì)于一組，將水中的18. 2吒PnP14加入混懸液中的1092吒基礎(chǔ)顆粒中。將混合物渦旋10秒，然后在冰上孵育30分鐘。注射之前將顆粒在無(wú)菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動(dòng)物遞送120呢顆粒和2 I^g PnPH06.對(duì)于一組，將水中的18. 2吒CRM197加入混懸液中的1092吒基礎(chǔ)顆粒中。然后將水中的18. 2 PnP14加入該混合物中。將混合物渦旋10秒，然后在冰上孵育30分鐘。注射之前將顆粒在無(wú)菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動(dòng)物遞送120吒顆粒、2吒PnP14和2吒CRM197。與顆粒結(jié)合的CRM197由Bradford來(lái)測(cè)試。所有組被測(cè)定為具有超過(guò)84%的與基礎(chǔ)顆粒結(jié)合的CRM197。與基礎(chǔ)顆粒結(jié)合的多糖由HPLC來(lái)測(cè)試。所有PnP4組被測(cè)定為具有100%的多糖結(jié)合。PnP14組被測(cè)定為具有超過(guò)42%的多糖結(jié)合。來(lái)自上文顆粒的免疫原件總結(jié):
可溶性多糖(參見(jiàn)結(jié)果)和無(wú)抗原吸附的裸PLGA/pDMAEMA顆粒不產(chǎn)生可檢測(cè)的IgG反應(yīng)，表明未實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞依賴的抗多糖抗體反應(yīng)和相關(guān)的記憶反應(yīng)。卵白蛋白+ PnP14顆粒產(chǎn)生了可檢測(cè)的IgG反應(yīng)，表明誘導(dǎo)了 T細(xì)胞依賴的抗多糖抗體反應(yīng)，引起抗體同種型轉(zhuǎn)換和記憶反應(yīng)的發(fā)生。卵白蛋白+ PnP14 + CRM197顆粒產(chǎn)生了可檢測(cè)的IgG反應(yīng)，表明誘導(dǎo)了 T細(xì)胞依賴的抗多糖抗體反應(yīng)，引起抗體同種型轉(zhuǎn)換和記憶反應(yīng)的發(fā)生。Prevnar 產(chǎn)生了可檢測(cè)的IgG反應(yīng),表明誘導(dǎo)了 T細(xì)胞依賴的抗多糖抗體反應(yīng),弓I起抗體同種型轉(zhuǎn)換和記憶反應(yīng)的發(fā)生。此外，單次注射后，卵白蛋白/多糖顆粒始終能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生可測(cè)量的抗多糖IgG效價(jià)(初次免疫后4周測(cè)量)。該行為未在用Prevnar (Pfizer Inc.)注射的動(dòng)物中觀察到，如圖I所示。圖I
權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含 含有實(shí)質(zhì)上均勻組合物的模塑顆粒， 其中所述實(shí)質(zhì)上均勻組合物包含免疫原性量的與多糖締合的載體蛋白。
2.權(quán)利要求I的免疫原性組合物，其中所述多糖是肺炎球菌多糖。
3.權(quán)利要求I的免疫原性組合物，其中所述載體蛋白呈基質(zhì)的形式。
4.權(quán)利要求I的免疫原性組合物,其中所述多糖呈基質(zhì)的形式。
5.權(quán)利要求I的免疫原性組合物，其中所述顆粒是非交聯(lián)的或交聯(lián)的。
6.權(quán)利要求I的免疫原性組合物，其另外包含選自以下的基質(zhì)實(shí)質(zhì)上非免疫原性蛋白、糖、聚合物和疏水物。
7.權(quán)利要求I的免疫原性組合物,其另外包含聚合物,其中所述聚合物物理上迫使所述載體蛋白與所述多糖締合。
8.權(quán)利要求I的免疫原性組合物，其另外包含聚合物，其中所述多糖或載體蛋白被吸附在顆粒的表面。
9.權(quán)利要求I的免疫原性組合物,其中所述蛋白占90wt%-99. 9 wt%，和所述多糖占10 wt%-0. I wt%0
10.權(quán)利要求I的免疫原性組合物，其中所述蛋白包含90wt%-99. 9 wt%的卵白蛋白、CRM或HSA，和所述多糖包含10 wt%-0. I wt%的肺炎球菌多糖14。
11.一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含 含有非交聯(lián)組合物的模塑顆粒，所述非交聯(lián)組合物包含約10-20 wt%的聚合物、約60-70 wt%的蛋白和約10-25胃七％的多糖。
12.權(quán)利要求11的免疫原性組合物,其中所述聚合物包含約16wt%的PLGA。
13.權(quán)利要求11的免疫原性組合物,其中所述蛋白包含約66wt%的卵白蛋白、CRM或HSA。
14.權(quán)利要求11的免疫原性組合物，其中所述多糖包含約18 1%的肺炎球菌多糖14。
15.一種優(yōu)化多糖疫苗性能的方法，所述方法是通過(guò)使模塑的二維陣列顆粒的免疫原性多糖或免疫原性蛋白組分的類型或化學(xué)計(jì)量學(xué)變化和測(cè)試所述顆粒的性能。
16.一種用于制造多糖疫苗的系統(tǒng)，其包括選擇與蛋白和多糖相容的基質(zhì)組合物和通過(guò)在聚合物模具中模塑組合物從所述組合物形成顆粒，其中所述組合物包含約90-99. 9wt%的蛋白和約10-0. I wt%的多糖。
17.權(quán)利要求16的系統(tǒng)，其中基質(zhì)組合物的相容性包含不降低所述蛋白或多糖免疫原性的組分和處理。
全文摘要
制備顆粒組合物用作多糖顆粒疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102834112SQ201180020342
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月22日
發(fā)明者S.M.雷勒, A.墨菲, B.胡拜 申請(qǐng)人:流體科技公司