專利名稱：治療及修復(fù)軟骨缺損或損傷的方法及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療和修復(fù)軟骨缺損或損傷。特別是本發(fā)明涉及治療軟骨缺損或損傷(本文中可以互換使用)的方法和含有可生物降解基質(zhì)的組合物，該基質(zhì)含有一種或多種增殖劑以促進(jìn)修復(fù)細(xì)胞增殖形成新的穩(wěn)定的軟骨組織。本發(fā)明的組合物及方法特別適用于治療骨關(guān)節(jié)炎和產(chǎn)生軟骨損傷的其他疾病與創(chuàng)傷。
關(guān)節(jié)是聯(lián)接骨骼中骨頭的普通方式之一。正常的關(guān)節(jié)聯(lián)接的骨頭的末端是被關(guān)節(jié)軟骨組織覆蓋住的，這樣就使得骨骼在運(yùn)動(dòng)時(shí)不會(huì)相互摩擦〔L.Weiss，ed.，細(xì)胞與組織生物學(xué)(MunchenUrban and Schwarzenburg，1988)第247頁〕。
關(guān)節(jié)的軟骨是以特別結(jié)構(gòu)的組織為特征的。它由特定的細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)組成，這些細(xì)胞包埋在胞間物質(zhì)(在文獻(xiàn)中通常指“軟骨基質(zhì)”)中，該物質(zhì)富含蛋白多糖，主要為Ⅱ型的膠原原纖維，其他蛋白質(zhì)和水〔Buckwalter等人，“關(guān)節(jié)的軟骨損傷與修復(fù)”，Injury and Repair of the Musculoskeletal Soft Tissues(Park Ridge，Ⅰ11American Academy of Orthopaedic Surgeons Symposium.1987)，第465頁〕。軟骨組織既不受神經(jīng)支配，又不被血管或淋巴系統(tǒng)穿過。但是在成年人的成熟關(guān)節(jié)中，軟骨下的骨組織在骨組織與軟骨之間形成一個(gè)狹窄的、連續(xù)的板，它是受神經(jīng)支配的并且形成了血管。在此骨板下，骨組織形成其中含有骨髓的小梁。在未成熟的關(guān)節(jié)中，關(guān)節(jié)軟骨只是作為主要骨小梁的襯里。關(guān)節(jié)中的部分半月板組織也由軟骨構(gòu)成，其組成與關(guān)節(jié)的軟骨相似〔Beaupre，A.等人，Clin.Orthop.Rel.Res.第72-76頁，(1986)〕。
在軟骨組織中有兩種類型的缺損或損傷是公認(rèn)的，即完全增厚缺損和表面缺損。這兩種缺損的區(qū)別不僅在于軟骨物理損傷的程度，也在于每種損傷所能引起的修復(fù)應(yīng)答的性能。
完全增厚損傷蔓延至軟骨下的骨頭上，并且由于骨板含有感覺神經(jīng)末梢能夠引起劇痛。這種缺損一般由嚴(yán)重創(chuàng)傷所致或者在退化性關(guān)節(jié)疾病(如骨關(guān)節(jié)炎)的晚期產(chǎn)生。完全增厚缺損有時(shí)會(huì)導(dǎo)致出血并且誘導(dǎo)軟骨下骨頭的修復(fù)反應(yīng)〔Buckwalter等人，“Articular CartilageComposition，Structure，Response to Injury and Methods of Facilitating Repair”Articular Cartilage and Knee Joint FunctionBasic Science and Arthroscopy(New YorkRaven Press，1990)第19-56頁〕。所形成的修復(fù)組織是血管化纖維型的軟骨，其生物力學(xué)性質(zhì)不足，并且不能長(zhǎng)期堅(jiān)持〔Buckwalter等人，(1990)，上文〕。
關(guān)節(jié)軟骨組織的表面缺損限于軟骨組織本身。這種缺損很討厭是眾所周知的，因?yàn)樗鼈儫o法治愈并且不具有修復(fù)反應(yīng)的傾向。
這些缺損可以表現(xiàn)為在軟骨表面中的裂隙、削起或裂口，或者它們可以在受侵襲的組織中具有“螃蟹肉”外觀。它們不含有象在完全增厚缺損中所見的出血血管(血斑)。表面缺損的起因可能不知道，但通常它們是導(dǎo)致軟骨組織摩損機(jī)械紊亂的結(jié)果，機(jī)械紊亂可以由關(guān)節(jié)創(chuàng)傷引起，例如撕裂的半月板組織移位至關(guān)節(jié)中、半月板切除術(shù)、因韌帶撕裂所致關(guān)節(jié)松弛、關(guān)節(jié)排列不齊或者骨折，或者因遺傳病引起。表面缺損的特征還在于早期退化性關(guān)節(jié)疾病，例如骨關(guān)節(jié)炎。由于軟骨組織不受神經(jīng)支配〔Ham′S Histology(第9版)(PhiladelphiaJ.B.Lippincott Co.1987)，第266-272頁〕或者是非血管化的，因此表面缺損是無痛苦的。但是，盡管無痛苦，表面缺損卻無法治愈，并且經(jīng)常轉(zhuǎn)為完全增厚缺損。
一般認(rèn)為，由于關(guān)節(jié)軟骨缺少脈管系統(tǒng)，損傷的軟骨組織不能得到足夠的或適當(dāng)?shù)拇碳ひ砸鹦迯?fù)應(yīng)答〔Webber等人，“Intrinsic Repair Capabilities of Rabbit Meniscal FibrocartilageA Cell Culture Model”，(30th Ann.Orthop.Res.Soc.，Atlanta，F(xiàn)eb.1984);Webber等人，J.Orthop.Res.，3，第36-42頁(1985)〕。可以推測(cè)，軟骨組織中的軟骨細(xì)胞正常情況下不與足夠量的修復(fù)刺激劑例如生長(zhǎng)因子和纖維蛋白凝塊接觸，這些刺激劑典型地存在于損傷的血管化組織中。
一種用于將損傷的軟骨組織與修復(fù)刺激劑接觸的方法包括穿過軟骨鉆入或刮至軟骨下的骨頭中引起出血〔Buckwalter等人，1990上文〕。不幸的是，該組織對(duì)這為外科手術(shù)損傷的修復(fù)應(yīng)答通常與完全增厚缺損引起出血中所觀察到的自然產(chǎn)生的應(yīng)答相類似，即形成纖維型軟骨，其生物力學(xué)性質(zhì)不足并且不能長(zhǎng)期堅(jiān)持〔Buckwalter等人，1990，上文〕。
已經(jīng)分離出多種生長(zhǎng)因子，并且目前已可供用于研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用〔見例如Rizzino.A.，Dev.Biol.130，第411-22(1988)〕。已有報(bào)導(dǎo)，這些生長(zhǎng)因子中的一些例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)在體外在胚胎大鼠間質(zhì)細(xì)胞中能促進(jìn)特定的軟骨分子形成，例如Ⅱ型膠原和特定的軟骨蛋白多糖〔例如Seyedin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，第2267-71頁(1985);Seyedin等人，J.Biol.Chem.，261，第5693-95頁(1986);Seyedin等人，J.Biol.Chem.262，第1946-1949頁(1987)〕。
已經(jīng)有上百萬患者被診斷患有骨關(guān)節(jié)炎，即在他們的關(guān)節(jié)軟骨中患有退化性缺損或損傷。然而，盡管有各種方法聲稱可以在損傷的軟骨中引起修復(fù)應(yīng)答，但是這些方法中沒有任何一種被接受實(shí)際應(yīng)用〔Buckwalter等人(1990)，上文;Knutson等人，J.Bone and Joint Surg.，68-B，第795頁(1986);Knutson等人，J.Bone and Joint Surg.，67-B，第47頁(1985);Knutson等人，Clin.Orthop.，191，第202頁(1984);Marquet Clin.Orthop.，146，第102頁(1980)〕。并且這些治療方法一般只是暫時(shí)緩解。全身使用“軟骨保護(hù)劑”也打算用于阻止骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展并用于引起疼痛緩解。但是這種保護(hù)劑未顯示出促進(jìn)軟骨組織中損傷或缺損的修復(fù)。
到目前為止，患有骨關(guān)節(jié)炎患者的治療主要是通過使用止痛藥和消炎劑直接緩解癥狀。在不使用能引起關(guān)節(jié)軟骨中表面缺損修復(fù)的治療方法下，軟骨經(jīng)常摩損到軟骨下的骨板。在該疾病即嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)炎的這一階段，持續(xù)的疼痛和顯著的功能衰退經(jīng)常導(dǎo)致整個(gè)關(guān)節(jié)被切除，并且用一個(gè)金屬和/或塑料的人工關(guān)節(jié)代替。目前每年有50萬人實(shí)施膝和髖關(guān)節(jié)切除與人工關(guān)節(jié)替換手術(shù)。〔見例如Graves，E.J.，“1988Summary;National Hospital Discharge Survey”，Advanced Data From Vital and Health Statistics，185，第1-12頁，(1990年6月19日)〕。
因此需要可靠的治療軟骨缺損的方法，該方法能夠引起修復(fù)并使穩(wěn)定的軟骨再生，并且防止表面軟骨缺損或損傷發(fā)展成為嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明通過提供有效的治療方法和組合物以引起人和其他動(dòng)物軟骨損傷的修復(fù)而解決了上面所提到的問題。使用本發(fā)明的方法和組合物還可以防止創(chuàng)傷損傷的發(fā)展和骨關(guān)節(jié)炎的早期形成，否則將導(dǎo)致持續(xù)疼痛并喪失有效關(guān)節(jié)功能的嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)炎，它將導(dǎo)致該關(guān)節(jié)可能被切除和替換。
總的來講，本發(fā)明修復(fù)軟骨缺損的方法包括用本發(fā)明組合物填充或者覆蓋軟骨的缺損處，該組合物含有(1)可生物降解的基質(zhì)或形成基質(zhì)的材料，(2)促進(jìn)基質(zhì)和缺損區(qū)域中修復(fù)細(xì)胞的增殖的，以及在某些具體情況下(3)以吸引修復(fù)細(xì)胞到基質(zhì)和缺損區(qū)域中去的趨化劑，和(4)存在于合適傳送系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化因子，該系統(tǒng)將在合適的時(shí)間釋放該轉(zhuǎn)化因子以促進(jìn)基質(zhì)或缺損區(qū)域中的修復(fù)細(xì)胞分化(即轉(zhuǎn)化)成為產(chǎn)生新的穩(wěn)定的軟骨組織的軟骨細(xì)胞。或者，可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候?qū)⑥D(zhuǎn)化因子單獨(dú)加至缺損部位。
在進(jìn)行單獨(dú)的關(guān)節(jié)鏡檢查和外科術(shù)過程中可以使用本發(fā)明的方法治療軟骨缺損。根據(jù)本發(fā)明的某些方法，在確定缺損后，通過下列步驟治療缺損(1)用一種酶填充缺損區(qū)域，這種酶能使存在于缺損表面的蛋白多糖降解，(2)除去該酶，(3)用一種組合物敷裹缺損，該組合物含有基質(zhì)、增殖劑和存在于一個(gè)合適傳送系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化因子。
為了更充分地理解本發(fā)明，下面將進(jìn)行詳細(xì)的描述。在說明書中使用下列術(shù)語。
關(guān)節(jié)鏡檢查-用在本文中是指使用關(guān)節(jié)鏡對(duì)關(guān)節(jié)進(jìn)行檢查或進(jìn)行外科術(shù)。
軟骨-用在本文中是指一種類型的聯(lián)接組織，它含有被胞間物質(zhì)(通常稱作“軟骨基質(zhì)”)包裹的軟骨細(xì)胞，該基質(zhì)含有膠原原纖維(主要是Ⅱ型膠原與其他次要類型的膠原，如Ⅸ和Ⅺ型)、各種蛋白多糖(例如軟骨素硫酸蛋白多糖、角質(zhì)素硫酸蛋白多糖和皮膚素硫酸蛋白多糖)、其他蛋白質(zhì)和水。本文所用的軟骨包括關(guān)節(jié)和半月板軟骨。關(guān)節(jié)軟骨覆蓋于關(guān)節(jié)中骨骼部分的表面，使關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)時(shí)骨與骨之間不直接接觸，因而防止摩損和損傷骨表面。多數(shù)正常健康的關(guān)節(jié)軟骨又被描述為“玻璃樣的”即具有磨砂玻璃外觀這樣的特征。通常發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)中的半月板軟骨經(jīng)受震動(dòng)和運(yùn)動(dòng)。這些部位的半月板軟骨包括顳下頜關(guān)節(jié)、胸鎖骨關(guān)節(jié)、肩峰鎖骨關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)〔Gray′s Anatomy(New YorkBounty Books，1977)〕。
細(xì)胞粘附促進(jìn)因子-在本文中是指能夠介導(dǎo)細(xì)胞粘附于胞外基質(zhì)的任何化合物或組合物，包括fibronectin和其他與四肽一樣小的肽，其中含有三肽Arg-Gly-Asp〔Ruoslathi等人，Cell，44，第517-518(1986)〕。
趨化劑-在本文中用以指在體外趨化性分析中能按標(biāo)準(zhǔn)吸引細(xì)胞的任何化合物或組合物，包括肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白和葡糖氨聚糖鏈〔例如Wahl等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，第5788-92(1987);Postlewaite等人，J.Exp.Med.，165，第251-56頁(1987);Moore等人，Int.J.Tiss.Reac.，Ⅺ，第301-07(1989)〕。
軟骨細(xì)胞-在本文中用來指能夠產(chǎn)生軟骨組織成分例如Ⅱ型軟骨原纖維和纖維以及蛋白多糖的細(xì)胞。
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)-從天然、合成或重組來源獲得的FGF多肽族中的任何成員或其衍生物〔Gimenez-Gall-ego等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，135，第541-548(1986);Thomas等人，Trends Biochem.Sci.，11，第81-84頁(1986)〕，它們能夠刺激各種細(xì)胞，包括主要的成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血管和角膜內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、平滑肌和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞〔Thomas等人，1986，上文〕的DNA合成和細(xì)胞體外分裂〔對(duì)于分析可參見例如Gimenez-Gallego等人，1986，上文;Canalis等人，J.Clin.Invest.，81，第1572-1577(1988)〕。FGF根據(jù)其等電點(diǎn)(PI)可以分成酸性FGF(aFGF)和堿性FGF(bFGF)兩類。
基質(zhì)-本文中是指多孔復(fù)合的、固體或半固體可生物降解的物質(zhì)，它具有足夠大的孔或空間使細(xì)胞可以聚居于該基質(zhì)中。術(shù)語“基質(zhì)”包括形成基質(zhì)的材料，即能夠在軟骨的缺損部位中形成基質(zhì)的材料。形成基質(zhì)的材料可以需要添加聚合劑以形成基質(zhì)，例如向含有纖維蛋白原的溶液中加入凝血酶，以形成纖維蛋白基質(zhì)。
增殖(促有絲分裂)劑-在本文中是指能夠在體外刺激細(xì)胞增殖的任何化合物或組合物，包括肽、蛋白質(zhì)和糖蛋白。在體外分析中，測(cè)定肽、多肽和其他化合物的增殖(促有絲分裂)活性是本領(lǐng)域眾所周知的〔見例如Canalis等人，J.Clin.Invest.第1572-77(1988);Gimenez-Gallego等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，135，第541-548頁(1986)，Rizzino，“Soft Agar Growth Assays for Transforming Growth Factors and Mitogenic Peptides”，Methods Enzymol.，146A(New YorkAcademic Press，1987)，第341-52頁;Dickson等人，“Assays of Mitogen-Induced Effects on Cellular Incorpora-tion of Precursors for Scavengers，de Novo，and Net DNA Synthesis”，Methods Enzymol.146A(New YorkAcademic Press，1987)，第329-40頁〕。一種測(cè)定化合物或組合物增殖(促有絲分裂)活性的標(biāo)準(zhǔn)方法是在體外測(cè)定其在軟瓊脂中誘導(dǎo)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞非固定依賴性生長(zhǎng)的能力〔例如Rizzino，1987，上文〕。其他促有絲分裂活性測(cè)定體系也是已知的〔例如Gimenez-Gallego等人，1986，上文;Canalis等人，1988，上文;Dickson等人，1987，上文〕。
修復(fù)細(xì)胞-本文中用于指當(dāng)經(jīng)受合適的刺激時(shí)，能分化并轉(zhuǎn)化成為軟骨細(xì)胞的細(xì)胞。修復(fù)細(xì)胞包括間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和消分化軟骨細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化因子-是指能誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞分化成為軟骨細(xì)胞的任何肽、多肽、蛋白質(zhì)或任何其他的化合物或組合物。化合物或組合物誘導(dǎo)或刺激細(xì)胞產(chǎn)生軟骨特異的蛋白多糖和Ⅱ型膠原的能力可以通過現(xiàn)有技術(shù)已知的體外分析法測(cè)定〔Seyedin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，第2267-71頁(1985);Seyedin等人，Path.Immunol.Res.，7，第38-42頁(1987)〕。
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)-從天然合成或重組來源獲得的TGF-β多肽族中任何一個(gè)成員或其衍生物〔Derynck，R.等人，Nature，316，第701-705頁(1985);Roberts等人，“The trasforming growth factor-β′s”，Peptide growth factors and their receptors I(BerlinSpringer.Verlag，1990)，第419頁〕，它在軟瓊脂分析中具有刺激正常鼠腎(NRK)細(xì)胞生長(zhǎng)并形成克隆的特征性的TGF-β能力〔Roberts等人，1984，上文〕，并且正如它能夠在體外通過細(xì)胞誘導(dǎo)或刺激產(chǎn)生軟骨的特異的蛋白多糖和Ⅱ型膠原所證實(shí)的，它能夠誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細(xì)胞〔Seyedin等人，1985，上文〕。
本發(fā)明涉及治療軟骨缺損或損傷的組合物及方法。本發(fā)明的組合物含有可生物降解的基質(zhì)，該基質(zhì)具有足夠大的孔，使修復(fù)細(xì)胞能聚居于基質(zhì)中。該基質(zhì)還含有增殖劑以刺激基質(zhì)中修復(fù)細(xì)胞的增殖。特別是，該增殖劑還具有趨化劑的作用，以吸引修復(fù)細(xì)胞至基質(zhì)中?；蛘?，該基質(zhì)除含有增殖劑外，還含有趨化劑。在本發(fā)明優(yōu)選的具體例子中，該基質(zhì)還含有合適濃度的轉(zhuǎn)化因子，該轉(zhuǎn)化因子被包含在或結(jié)合在傳送系統(tǒng)中，該傳送系統(tǒng)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候有效地釋放轉(zhuǎn)化因子，將基質(zhì)中增殖的修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的軟骨組織。該基質(zhì)還可以含有細(xì)胞粘附促進(jìn)因子。
適用于本發(fā)明方法和組合物中以填充或者敷裹軟骨缺損的基質(zhì)材料包括纖維蛋白原(被凝血酶激活，在缺損或損傷處形成纖維蛋白)、膠原、瓊脂糖、明膠和任何其他的可生物降解材料，它們能形成具有足夠大孔的基質(zhì)，使得修復(fù)細(xì)胞能夠在基質(zhì)中聚居并增殖，它們?cè)谛迯?fù)過程中可以被降解并且被軟骨替換。
適用于本發(fā)明組合物和方法中的此基質(zhì)可以預(yù)制或新鮮配制，例如通過聚合化合物和組合物如纖維蛋白原形成纖維蛋白基質(zhì)。可以預(yù)制的基質(zhì)包括膠原(如膠原海綿和膠原羊毛狀物)、化學(xué)修飾的膠原、明膠珠或明膠海綿、形成凝膠的物質(zhì)如瓊脂糖、任何其他形成凝膠的物質(zhì)或復(fù)合物質(zhì)，它由可生物降解的基質(zhì)材料組成，該材料將填充于缺損處使修復(fù)細(xì)胞聚居于基質(zhì)中，或者上述物質(zhì)的混合物。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體例子中，使用形成基質(zhì)的材料、優(yōu)選纖維蛋白原溶液形成基質(zhì)，在使用前向其中加入凝血酶使其立刻開始聚合?？梢允褂玫睦w維蛋白原的濃度為0.5-5mg/ml水緩沖液。優(yōu)選使用1mg/ml含水緩沖液的纖維蛋白原溶液。該纖維蛋白原溶液在缺損區(qū)域聚合，產(chǎn)生具有足夠大尺寸(例如約50-200μm)孔的基質(zhì)，使修復(fù)細(xì)胞自由聚居于基質(zhì)中并增殖，以填充基質(zhì)所占領(lǐng)的缺損體積。優(yōu)選的是，在使用前不久向纖維蛋白原溶液中加入足量的凝血酶，以在完成聚合前使外科醫(yī)生有足夠的時(shí)間將此材料存放于缺損區(qū)域。通常凝血酶的濃度應(yīng)該是使聚合在很少時(shí)間至幾分鐘(2-4分鐘)之間完成，因?yàn)檐浌情L(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中將會(huì)引起損傷〔Mitchell等人，J.Bone Joint Surg.，71A，第89-95頁(1989)〕。不能使用過量的凝血酶，因?yàn)槟改軌蚴股L(zhǎng)因子分子斷裂并使它們滅活。加入到纖維蛋白原溶液中的凝血酶溶液可以制備成每ml含水緩沖液10-500單位，優(yōu)選100單位。在本發(fā)明優(yōu)選的具體例子中，在填充缺損前，將20μl凝血酶(100μ/ml)與每ml纖維蛋白原溶液(1mg/ml)混合200秒。如果加入凝血酶的濃度較低，則聚合發(fā)生得較慢。很顯然，所給出的使纖維蛋白在2-4分鐘之內(nèi)聚合所需的凝血酶溶液的量只是大約的，因?yàn)檫@個(gè)量取決于環(huán)境溫度，凝血酶溶液的溫度和纖維蛋白原溶液的溫度等。通過觀測(cè)凝血酶誘導(dǎo)的纖維蛋白原溶液外部樣品的聚合，可以很容易地監(jiān)測(cè)填充至缺損處的凝血酶活化的基質(zhì)溶液的聚合。在本發(fā)明組合物和方法中，優(yōu)選的纖維蛋白基質(zhì)是從自體纖維蛋白原分子形成的，即纖維蛋白原分子是從與被治療的物種相同的哺乳動(dòng)物種的血液中獲得的。從該物種獲得的非免疫原纖維蛋白原也可以使用。
當(dāng)使用膠原作基質(zhì)材料時(shí)，可以制成足夠粘度的溶液，例如使用Collagen-Vliess (“羊毛狀的”)或明膠-血液混合物，并且不需要聚合劑。也可以將膠原基質(zhì)與被聚合劑活化的纖維蛋白原溶液一起使用，于是得到混合的基質(zhì)。
當(dāng)使用其他可生物降解的化合物形成基質(zhì)時(shí)，也可不必需使用聚合劑。例如，可以選擇瓊脂糖溶液，該溶液在39-42℃時(shí)為液體基質(zhì)溶液，而在35-38℃時(shí)變成固體(即凝膠狀)。瓊脂糖也應(yīng)具有一定的濃度，使得填充至軟骨缺損處的凝膠具有一定的篩目大小，因此使修復(fù)細(xì)胞自由地聚居于基質(zhì)和缺損區(qū)域中。
在本發(fā)明的組合物中，可以向基質(zhì)溶液中加入一種或多種增殖(促有絲分裂)劑。增殖劑應(yīng)該以合適的濃度范圍存在，使其對(duì)填充于缺損處的基質(zhì)中的修復(fù)細(xì)胞具有增殖作用(見實(shí)施例)。優(yōu)選的是，同一增殖劑還對(duì)細(xì)胞具有趨化作用(例如TGF-β);但是，僅僅具有增殖作用的因子也可以使用。或者，為了在產(chǎn)生趨化性細(xì)胞遷移后誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，可以使用兩種不同的試劑，每種試劑僅具有其中一種特定的作用(或者是趨化性或者是增殖)。
適用于本發(fā)明組合物和方法以刺激修復(fù)細(xì)胞增殖的增殖(促有絲分裂)劑包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(“TGFs”)例如TGF-αS和TGF-βS;類胰島素生長(zhǎng)因子(“IGF I”);酸性或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(“FGFs”);血小板衍生的生長(zhǎng)因子(“PDGF”);表皮生長(zhǎng)因子(“EGF”)和造血生長(zhǎng)因子例如白細(xì)胞介素3(“IL-3”)〔Rizzino，1987，上文;Canalis等人，上文，1988;Growth factors in biology and medicine，Ciba Foundation Symposium，116(New YorkJohn Wiley & Sons，1985);Baserga，R.，ed.，Cell growth and division(OxfordIRL Press，1985);Sporn，M.A.和Roberts，A.B.，eds.，Peptide growth factors and their receptors，Vols.Ⅰ和Ⅱ(BerlinSpringer-Verlag，1990)〕。但是，這些具體的例子并非是限制。正如體外細(xì)胞增殖分析所證實(shí)的，任何能夠刺激細(xì)胞增殖的化合物或組合物都可用于本發(fā)明作增殖劑。這些分析方法是本領(lǐng)域已知的〔例如Canalis等人，1988，上文;Gimenez-Gallego等人，1986，上文;Dickson等人，1987，上文;Rizzino，1987，上文〕。
適用于本發(fā)明組合物和方法以吸引修復(fù)細(xì)胞的趨化劑包括例如TGF-βs、FGFs(酸或堿)、PDGF、腫瘤壞死因子(例如TNF-α、TNF-β)和蛋白多糖降解產(chǎn)物，例如葡糖氨聚糖鏈〔Roberts等人，(1990)，上文;Growth factors in biology and medicine，Ciba Foundation Symposium，116(New York，John Wiley & Sons，1985);R.Baserga，ed.，Cell growth and division(OxfordIRL Press，1985)〕。測(cè)定多肽和其他化合物趨化性能力的分析方法是本領(lǐng)域已知的〔例如Postlewaite等人，1987，上文;Wahl等人，1987，上文;Moore等人，1989，上文〕。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體例子中，基質(zhì)含有TGF-β作為增殖劑和趨化劑。特別是，TGF-βⅠ或TGF-βⅡ可以用作增殖劑和趨化劑。其他TGF-β形式(例如TGF-βⅢ、TGF-βⅣ、TGF-βⅤ等)或具有TGF-β活性的多肽〔見Roberts，1990，上文〕也可用于此目的，還有將來被發(fā)現(xiàn)的該物質(zhì)的其他形式，以及其他生長(zhǎng)因子。為了用作增殖劑和趨化劑，將TGF-β分子溶解或懸浮于基質(zhì)中，其濃度優(yōu)選為2-50ng/ml基質(zhì)溶液，最優(yōu)選2-10ng/ml基質(zhì)溶液。很顯然，刺激修復(fù)細(xì)胞增殖的TGF-β的優(yōu)選濃度可以隨著接受治療的具體動(dòng)物變化。
在基質(zhì)中還可以存在轉(zhuǎn)化因子，以便在修復(fù)細(xì)胞聚居于基質(zhì)中后，轉(zhuǎn)化因子將以足以促進(jìn)修復(fù)細(xì)胞分化(即轉(zhuǎn)化)成為軟骨細(xì)胞，由軟骨細(xì)胞形成新的穩(wěn)定的軟骨組織的濃度釋放至缺損部位。如果轉(zhuǎn)化因子能夠抑制或干擾增殖劑的效果，那么適當(dāng)控制轉(zhuǎn)化因子的釋放速度是特別重要的〔見Roberts等人(1990)，上文〕。
適用于本發(fā)明組合物和方法的轉(zhuǎn)化因子包括能誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，從而產(chǎn)生特異的軟骨蛋白多糖和Ⅱ型膠原的任何肽、多肽、蛋白質(zhì)或任何其他化合物或組合物?；衔锘蚪M合物在細(xì)胞中誘導(dǎo)或刺激特異的軟骨蛋白多糖和Ⅱ型膠原產(chǎn)生的能力可以用本領(lǐng)域已知的分析方法測(cè)定〔例如Seyedin等人，1985，上文;Seyedin等人，1987，上文〕。適用于本發(fā)明組合物和方法的轉(zhuǎn)化因子包括例如TGF-βs、TGF-αs和FGFs(酸或堿)。這些轉(zhuǎn)化因子可以單獨(dú)或混合使用。另外，TGF-β可以與EGF結(jié)合使用。
適當(dāng)控制轉(zhuǎn)化因子的釋放速度可以通過將轉(zhuǎn)化因子包裹或結(jié)合在合適的傳送系統(tǒng)中來實(shí)現(xiàn)。適用于本發(fā)明組合物和方法的傳送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、bioerodible聚合物、碳水化合物骨架微粒、纖維(例如與肝素硫酸蛋白多糖或其他這類分子化學(xué)聯(lián)接的膠原，轉(zhuǎn)化因子能自動(dòng)與其粘結(jié))、以及滲透泵。傳送系統(tǒng)例如與轉(zhuǎn)化因子結(jié)合的脂質(zhì)體、bioerodible聚合物、纖維和含有轉(zhuǎn)化因子的碳水化合物骨架微?？梢耘c用于填充缺損的基質(zhì)溶液混合。這些系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的和市售的〔見P.Johnson和J.G.Lloyd-Jones，eds.，Drug Delivery Systems(Chichester，EnglandEllis Horwood Ltd.，(1987)〕。脂質(zhì)體可以按照Kim等人所述方法制備(Biochem.Biophys.Acta，728，第339-348頁，(1983))。也可以使用其他脂質(zhì)體制備方法。刺激軟骨細(xì)胞合成軟骨組織成分的附加因子可以和轉(zhuǎn)化因子一起包括在傳送系統(tǒng)中。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體例子中，基質(zhì)含有TGF-β作為增殖劑和趨化劑，并且含有包裹在傳送系統(tǒng)中的TGF-β作為轉(zhuǎn)化因子。特別是，TGF-βⅠ或TGF-βⅡ可以同時(shí)用作增殖劑、趨化劑和轉(zhuǎn)化因子。其他TGF-β形式(例如TGF-βⅢ、TGF-βⅣ、TGF-βⅤ等)或具有TGF-β活性的多肽(見Roberts，1990，上文)，還有在將來被發(fā)現(xiàn)的該物質(zhì)的其他形式和其他生長(zhǎng)因子均可以用于此目的。
在優(yōu)選的具體例子中，用作增殖劑和趨化劑的TGF-β的濃度優(yōu)選為2-50ng/ml基質(zhì)溶液，最優(yōu)選的是2-10ng/ml基質(zhì)溶液。在基質(zhì)組合物中，高得多的濃度的TGF-β作為轉(zhuǎn)化因子以可隨后釋放的形式存在。優(yōu)選的是，TGF-β的隨后濃度大于200ng/ml基質(zhì)，最優(yōu)選的是大于500ng/ml基質(zhì)。很顯然，誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞分化的TGF-β的優(yōu)選濃度隨被治療的具體動(dòng)物而變化。
由于TGF-β在較高濃度時(shí)(例如大于200ng/ml基質(zhì)溶液)，不僅僅將修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細(xì)胞，還將抑制修復(fù)細(xì)胞的趨化性吸引;而當(dāng)TGF-β在較低濃度時(shí)(例如2-10ng/ml)，TGF-β不僅吸引修復(fù)細(xì)胞并刺激它們?cè)鲋?，而且還不能誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成產(chǎn)生軟骨組織的軟骨細(xì)胞，所以必需錯(cuò)開修復(fù)細(xì)胞暴露于兩種濃度TGF-β中的時(shí)間。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體例子中，為了獲得順序趨化和增殖，然后轉(zhuǎn)化TGF-β以游離的、未包裹的和包裹的兩種形式存在，或者在基質(zhì)中以其他隔離的形式存在。優(yōu)選的是，為了吸引并誘導(dǎo)基質(zhì)和缺損區(qū)域中的修復(fù)細(xì)胞增殖，將TGF-β分子以2-10ng/ml基質(zhì)溶液的濃度溶解或懸浮于基質(zhì)中。為了促進(jìn)基質(zhì)中的修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞，也按照Kim等人所述的方法(1983，上文)將TGF-β分子以隔離在多囊脂質(zhì)體中的形式存在于基質(zhì)中，其濃度大于200ng/ml基質(zhì)溶液，優(yōu)選的濃度大于500ng/ml。當(dāng)所吸引的修復(fù)細(xì)胞聚居于基質(zhì)中并開始降解基質(zhì)時(shí)，載有TGF-β的脂質(zhì)體就破裂了。在基質(zhì)的降解過程中，修復(fù)細(xì)胞攝入和/或降解脂質(zhì)體，導(dǎo)致TGF-β以足以誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞的濃度釋放。
通過轉(zhuǎn)化濃度的TGF-β與可生物侵蝕聚合物混合，也可以實(shí)現(xiàn)趨化性、增殖所需TGF-β濃度與轉(zhuǎn)化所需的TGF-β濃度的兩階段釋放?；蛘?，也可以用泵，特別是植入的滲透泵來控制TGF-β在缺損處和基質(zhì)中的濃度。在本發(fā)明的此具體例子中，泵控制TGF-β在基質(zhì)中的濃度，即泵在開始時(shí)以趨化性和增殖刺激濃度釋放TGF-β，隨后以轉(zhuǎn)化濃度釋放TGF-β。優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)化濃度的TGF-β在手術(shù)后大約1-2周被泵釋放。轉(zhuǎn)化因子釋放至缺損體積最好集中于缺損部位的基質(zhì)中。
本發(fā)明組合物中的增殖劑以及轉(zhuǎn)化因子(當(dāng)使用時(shí))在可生物降解基質(zhì)中施用于缺損部位。因此它們被限制存在于非常集中的部位。這樣做就避免了它們游離注射或輸注到關(guān)節(jié)空間中。這種游離輸注會(huì)產(chǎn)生副作用，刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生關(guān)節(jié)滲漏。
Fibronectin或含有氨基酸序列Arg-Gly-Asp的任何其他化合物，包括象四肽這樣小的肽，也可以用作細(xì)胞粘附促進(jìn)因子〔Ruoslathi等人，1986，上文〕以促進(jìn)修復(fù)細(xì)胞開始粘附在沉積于缺損部位的基質(zhì)中。纖維蛋白和某些膠原基質(zhì)已經(jīng)含有該序列〔Ruoslathi等人，1986，上文〕。當(dāng)使用其他可生物降解基質(zhì)時(shí)，在基質(zhì)用于敷裹缺損之前，這些細(xì)胞粘附促進(jìn)因子可以與基質(zhì)材料混合。含有Arg-Gly-Asp的肽也可以化合偶合到基質(zhì)材料(例如其纖維或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu))上，或者偶合到基質(zhì)中的化合物例如白蛋白上。
前面所述的組合物適用于在動(dòng)物的軟骨組織中缺損或損傷的選擇性部位誘導(dǎo)軟骨形成的方法。
本發(fā)明的方法可以用于治療動(dòng)物包括人的軟骨缺損，該方法使用簡(jiǎn)單并且被限制集中于受侵襲的關(guān)節(jié)區(qū)域?？梢栽趩我华?dú)一個(gè)的關(guān)節(jié)鏡或開放性外科術(shù)中進(jìn)行全部治療。
為了實(shí)施本發(fā)明的治療軟骨缺損或損傷的方法，要對(duì)缺損或損傷進(jìn)行鑒定、制備和敷用本發(fā)明的可生物降解基質(zhì)組合物。在基質(zhì)組合物中含有適當(dāng)濃度的增殖(促有絲分裂)劑，以刺激基質(zhì)和缺損或損傷處的修復(fù)細(xì)胞增殖。只要所使用的因子對(duì)細(xì)胞增殖和趨化性具有綜合作用，就可以使用此濃度的同一試劑作為趨化劑以吸引修復(fù)細(xì)胞(例如濃度為2-10ng/ml基質(zhì)的TGF-β)。或者，可以在基質(zhì)中存在兩種不同的試劑，一種具有特定的增殖作用，另一種具有特定的趨化作用?；蛘咴诹硪粋€(gè)具體例子中，當(dāng)缺損區(qū)域用可生物降解的基質(zhì)敷裹后，可以將增殖劑，以及如果需要將趨化劑直接注射到基質(zhì)填充的缺損區(qū)域。
在隨后的步驟中，將基質(zhì)中的修復(fù)細(xì)胞暴露于轉(zhuǎn)化因子中適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，轉(zhuǎn)化因子的濃度足以使修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)生穩(wěn)定的軟骨組織的軟骨細(xì)胞。這可以通過在上述基質(zhì)組合物中包括一種含有轉(zhuǎn)化因子的合適的傳送系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。或者，可以在合適的時(shí)間通過直接注射來傳送轉(zhuǎn)化劑到基質(zhì)填充的缺損區(qū)域。轉(zhuǎn)化劑的濃度應(yīng)該制成在可生物降解基質(zhì)開始植入缺損區(qū)域后的1-2周使細(xì)胞可得到。附加因子可以加到傳送系統(tǒng)中或者直接注射以更好地促進(jìn)此時(shí)間點(diǎn)的軟骨基質(zhì)成分合成。
在關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)鏡檢查過程中或者在簡(jiǎn)單的開放式外科術(shù)檢查損傷或缺損過程中，動(dòng)物軟骨缺損或損傷很容易通過肉眼識(shí)別。軟骨缺損還可以通過使用計(jì)算機(jī)輔助照相術(shù)(CAT掃描)、X射線檢查、磁共振成像(MRI)、滑液或血清標(biāo)記分析或者通過任何本領(lǐng)域已知的其他方法推斷識(shí)別。
一旦識(shí)別出缺損，外科醫(yī)生可以選擇外科手術(shù)修飾缺損，以提高缺損物理保留上述治療方法中所加入的溶液和基質(zhì)材料的能力。優(yōu)選的是，為了更好地保留上述治療方法中所加入的溶液和基質(zhì)材料，缺損不應(yīng)是扁平的或淺凹面的幾何形狀，而是具有或形成垂直的邊緣或者是倒凹的。
除了上述改善基質(zhì)粘附到缺損部位的機(jī)械方法之外，化學(xué)方法也可以促進(jìn)基質(zhì)粘附。這些方法包括使缺損表面上軟骨蛋白多糖的表面層降解而將軟骨的膠原原纖維暴露出來，這樣它們就可以與基質(zhì)中的膠原原纖維(當(dāng)使用膠原基質(zhì)時(shí))或者與基質(zhì)中的纖維蛋白原纖維(當(dāng)使用纖維蛋白基質(zhì)時(shí))相互作用。軟骨表面的蛋白多糖不僅僅趨于干擾纖維蛋白或其他可生物降解基質(zhì)對(duì)軟骨的粘附，還將局部抑制凝血酶的活性。有利的是，蛋白多糖降解產(chǎn)物還可以對(duì)修復(fù)細(xì)胞具有趨化作用〔Moore，A.R.等人，Int，J.Tiss.Reac.，Ⅺ(6)第301-307頁(1989)〕。
此外，基質(zhì)對(duì)缺損軟骨的粘附還可以通過使用纖維蛋白蘭(即血液因子ⅩⅢ或纖維蛋白穩(wěn)定因子)促進(jìn)基質(zhì)中原纖維與缺損表面上軟骨膠原原纖維的結(jié)合(交聯(lián))來提高〔見Gibble等人，Transfusion，30(8)，第741-47(1990)〕。谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶也可用于相同的作用〔見例如Ichinose等人，J.Biol.Chem.，265(23)，第13411-14(1990);“Transglutaminase”，EdsV.A.Najjar和L.Lorand，Martinus Nijhoff Publishers(Boston，1984)〕。還可以使用能促進(jìn)胞外物質(zhì)粘附的其他化合物。
本發(fā)明方法的一個(gè)具體例子是，通過用滅菌吸收紙吸收缺損區(qū)域使缺損表面干燥，并用滅菌酶溶液填充缺損體積2-10分鐘使軟骨表面存在的蛋白多糖降解，并定位在缺損表面的約1-2μm深。各種酶可以在滅菌緩沖含水溶液中單獨(dú)或混合使用，使蛋白多糖降解。溶液的PH值應(yīng)調(diào)節(jié)至最佳酶活性。
在本發(fā)明方法中適用于降解蛋白多糖的酶包括軟骨素酶(Chondroitinase)ABC、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、stromelysin和Staph V8蛋白酶。具體的酶或酶混合物的合適濃度取決于該酶溶液的活性。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體例子中，用濃度為1μ/ml的軟骨素ABC的滅菌溶液填充缺損，并使其消化4分鐘。通過用電子顯微鏡檢測(cè)兔關(guān)節(jié)軟骨組織決定優(yōu)選的軟骨素酶ABC的濃度，該組織已經(jīng)按照實(shí)施例1所述方法用各種濃度的酶處理不同的時(shí)間。所使用的任何其他的酶都應(yīng)該以一定濃度在一定時(shí)間內(nèi)使用，使得只有約1-2μm深的表面蛋白多糖被降解。
酶溶液施用的時(shí)間應(yīng)保持在最小量，使其主要在修復(fù)區(qū)域影響蛋白多糖的降解。對(duì)于濃度為1μ/ml的軟骨素酶ABC，消化時(shí)間超過10分鐘會(huì)導(dǎo)致缺損區(qū)域以外的蛋白多糖不必要的和潛在有害的降解。而且，消化時(shí)間超過10分鐘會(huì)使整體操作時(shí)間過長(zhǎng)。整體操作時(shí)間應(yīng)保持在最小，特別是在開放性關(guān)節(jié)切開術(shù)過程中，因?yàn)檐浌潜┞对诳諝庵袝?huì)受到損傷〔Mitchell等人，(1989)，上文〕。由于這些原因，在包括了通過酶消化使蛋白多糖降解步驟的本發(fā)明方法的具體例子中，推薦消化時(shí)間少于10分鐘，最優(yōu)選的是消化時(shí)間少于5分鐘。
按照本發(fā)明的方法，在酶使缺損表面的蛋白多糖降解之后，應(yīng)該將酶溶液從缺損區(qū)域除去。通過使用裝有細(xì)吸氣頂端的吸氣器后在用具有棉花的海綿吸收，可以有效地除去酶溶液。或者，可以只用棉花吸收除去酶溶液。
除去酶溶液后，應(yīng)該用滅菌生理鹽水(例如0.15M NaCl)徹底清洗缺損處，最好洗三次。然后應(yīng)該將清洗過的缺損部位干燥?？梢杂脽o菌紗布或棉花對(duì)缺損部位進(jìn)行干燥。
或者，除了酶處理步驟之外，還可以用化合物例如纖維蛋白膠或谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶敷裹缺損部位，以促進(jìn)基質(zhì)對(duì)缺損部位的粘附。在優(yōu)選的具體例子中，將纖維蛋白膠或谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶施用于酶處理后經(jīng)清洗和干燥后的缺損部位。
按照本發(fā)明的方法，然后用本文所述的本發(fā)明組合物敷裹缺損部位，以填充缺損，優(yōu)選用基質(zhì)組合物填充其邊緣，使得形成扁平的平面。該組合物含有一種基質(zhì)材料和一種增殖劑，以及如果需要，含有一種趨化劑。此步驟中使用的組合物還可以含有包裹在合適傳送系統(tǒng)中的一種轉(zhuǎn)化因子。在本發(fā)明最優(yōu)選的方法中，基質(zhì)含有一種增殖劑，一種趨化劑(它可以和增殖劑不同)和包裹或結(jié)合在傳送系統(tǒng)中的一種轉(zhuǎn)化因子，該轉(zhuǎn)化因子在一定時(shí)間(此時(shí)聚居于基質(zhì)中的修復(fù)細(xì)胞開始改造胞間物質(zhì))以一定濃度(該濃度可以將修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細(xì)胞釋放。上述組合物是優(yōu)選的。
如果基質(zhì)不含增殖劑和趨化劑，為了傳送優(yōu)選的濃度以促進(jìn)修復(fù)細(xì)胞的趨化性和增殖，可以將上述試劑直接注射到基質(zhì)填充的缺損區(qū)域。在本發(fā)明的此具體例子中，優(yōu)選的是，在用基質(zhì)敷裹缺損后，將TGF-β局部注射到基質(zhì)中，得到2-10ng/ml基質(zhì)的濃度。注射應(yīng)該集中在基質(zhì)填充的缺損區(qū)域中，以避免滑膜細(xì)胞暴露在生長(zhǎng)因子中，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和關(guān)節(jié)滲漏。
在用基質(zhì)組合物敷裹缺損部位后(以及，就纖維蛋白基質(zhì)來說，一旦基質(zhì)已經(jīng)固化)并且如果需要，將增殖劑注射到基質(zhì)填充的缺損部位后，關(guān)節(jié)囊和皮膚切口就可以關(guān)閉，關(guān)節(jié)鏡檢查或開放式外科術(shù)就可以終止了。
如果在合適傳送系統(tǒng)的基質(zhì)中不含有轉(zhuǎn)化因子，那么在手術(shù)后大約1-2周，可以將轉(zhuǎn)化因子直接加入到基質(zhì)中，例如通過注射或通過滲透泵，其濃度足以將修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞。優(yōu)選的是，在本發(fā)明的該具體例子中，在手術(shù)后大約1周時(shí)直接將TGF-β加入到基質(zhì)中，得到大于200ng/ml基質(zhì)的濃度，最優(yōu)選的是濃度大于500ng/ml基質(zhì)。
當(dāng)缺損沒有延伸到軟骨下的骨頭時(shí)，本文所述的修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法是最有效的。本文所述的方法也可以用于修復(fù)半月板軟骨組織缺損。
為了更充分地理解本文所述的發(fā)明，舉出下列實(shí)施例。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明任何方式的限制。
實(shí)施例1蛋白多糖遷移的酶試驗(yàn)為了促進(jìn)和改善基質(zhì)沿著關(guān)節(jié)軟骨組織的表面缺損表面粘附，可以使表面軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖分子酶促遷移，以使膠原纖維網(wǎng)絡(luò)暴露在外部施用的基質(zhì)中并使修復(fù)細(xì)胞遷移。各種蛋白酶和葡糖氨多糖降解酶也適用于此目的，但是應(yīng)該控制PH值，使各種酶具有最大的活性。
在此實(shí)施例中，我們對(duì)軟骨素酶ABC(0.5-5μ/ml)和胰蛋白酶(0.5-4%)影響蛋白多糖遷移的能力進(jìn)行了試驗(yàn)。使用從當(dāng)?shù)赝婪蛱帿@得的剛宰殺兔的膝關(guān)節(jié)。將機(jī)械產(chǎn)生的表面軟骨缺損暴露在酶溶液中4分鐘。然后用吸收紙除去溶液，并用生理鹽水清洗缺損部位。完成此過程后，將軟骨組織立刻在含有0.7%(w/v)六胺三氯化釕(RHT)的2%(v/v)戊二醛溶液(用0.05M卡可酸鈉緩沖，PH7.4)固定，進(jìn)行組織檢查。固定后的介質(zhì)含有1%RHT-四氧化鋨溶液(用0.1M卡可酸鈉緩沖)。將組織在梯度系列乙醇中脫水并包埋在Epon812中。將組織制成薄切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并用電子顯微鏡檢查。在這些切片中，RHF固定的(即沉淀的)蛋白多糖呈現(xiàn)為黑色染色顆粒。使不超過1-2μm厚的表面層蛋白多糖遷移的酶的濃度是最佳的(酶更深的滲透會(huì)影響下面的軟骨細(xì)胞)。我們發(fā)現(xiàn)軟骨素酶ABC濃度為約1μ/ml時(shí)具有最佳活性。胰蛋白酶濃度為約2.5%時(shí)具有最佳活性。其他葡糖氨聚糖酶或蛋白酶的最佳活性范圍可以用同樣的方法測(cè)定。任何緩沖液，如果沒有毒性并且其最大緩沖容量在接近最大酶活性所需的PH值時(shí)出現(xiàn)，都可以與酶一起使用。
實(shí)施例2基質(zhì)對(duì)表面缺損的粘附我們對(duì)通過控制表面軟骨蛋白多糖的酶消化來促進(jìn)基質(zhì)沿著缺損表面粘附的可能性進(jìn)行了研究。通過用整平(planing)刀切，使三只成年兔的膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生缺損。這些缺損不用酶處理。用纖維蛋白基質(zhì)填充缺損，該基質(zhì)是在填充缺損前約200秒時(shí)將20μl凝血酶溶液(100μ/ml含水緩沖液)與每ml纖維蛋白原溶液(1mg/ml水緩沖液)混合制成的。一個(gè)月后將兔子處死，對(duì)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行檢查，以測(cè)定纖維蛋白基質(zhì)對(duì)缺損部位的粘附程度。將所得結(jié)果與用纖維蛋白基質(zhì)填充缺損前用軟骨素酶ABC(1μ/ml4分鐘)治療缺損的兔子(見實(shí)施例3、4和5)所得結(jié)果進(jìn)行比較。
沉積于未用酶處理過的剩余缺損區(qū)域中的纖維蛋白基質(zhì)對(duì)缺損表面的粘著具有很低的親和力。經(jīng)酶處理后，纖維蛋白基質(zhì)的粘著能力(通過測(cè)量粘著的機(jī)械強(qiáng)度，即通過試驗(yàn)用鑷子尖用手推動(dòng)基質(zhì)的容易程度測(cè)定，以及通過記錄在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中成功地保持基質(zhì)粘著的缺損數(shù)目間接測(cè)定)顯著增加了。基質(zhì)對(duì)未用酶處理的缺損表面親和力低可能是由于蛋白多糖分子局部抑制基質(zhì)粘著以及纖維蛋白聚合受到抑制。通過將沿著缺損表面區(qū)域的表面蛋白多糖酶促遷移，可以防止上面兩種作用。
實(shí)施例3將生長(zhǎng)因子施用于缺損部位以趨化性刺激修復(fù)細(xì)胞使之遷移到缺損區(qū)域并誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞增殖我們對(duì)各種生長(zhǎng)因子刺激修復(fù)細(xì)胞趨化性遷移至缺損區(qū)域以實(shí)現(xiàn)治愈缺損的作用進(jìn)行了試驗(yàn)。
所使用的生長(zhǎng)因子包括a)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，b)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，c)類胰島素生長(zhǎng)因子I(IGF·I)，d)人生長(zhǎng)激素(hGH)和e)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，其濃度為5-10ng/ml。
將每種生長(zhǎng)因子局部施用于膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生的缺損部位，該缺損部位先按照實(shí)施例2所述方法用軟骨素酶ABC處理并清洗?？偣彩褂?0只動(dòng)物(每種生長(zhǎng)因子用兩只)。每種生長(zhǎng)因子能夠足以趨化性地吸引或局部刺激修復(fù)細(xì)胞增殖到缺損表面，使缺損表面被全部覆蓋。但是，細(xì)胞只存在于缺損表面，并且修復(fù)細(xì)胞的增殖不能填充全部缺損體積。
(據(jù)信，蛋白多糖降解產(chǎn)物本身，即在不需加入任何其他試劑下，就能產(chǎn)生足夠的趨化作用，將修復(fù)細(xì)胞吸引到缺損部位。Moore，A.R.等人〔Int.J.Tiss.Reac.，Ⅺ(b)，第301-107頁，1989〕已證明蛋白多糖降解產(chǎn)物本身具有趨化作用)。
實(shí)施例4將包裹在可生物降解基質(zhì)中的生長(zhǎng)因子施用于缺損部位以趨化性刺激修復(fù)細(xì)胞遷移至缺損區(qū)域并誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞增殖由于按照實(shí)施例3的條件局部施用生長(zhǎng)因子不能誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞增殖到足以填充缺損體積，因此使用同樣的生長(zhǎng)因子重復(fù)此實(shí)驗(yàn)，只是這次將生長(zhǎng)因子包裹在可生物降解的基質(zhì)中。所使用的可生物降解基質(zhì)是纖維蛋白，膠原和瓊脂糖。使用足夠量的含有生長(zhǎng)因子的基質(zhì)將缺損體積完全填充。
在填充到缺損部位前約200秒時(shí)，將20μl凝血酶溶液(100μ/ml水緩沖液佛羅那乙酸鹽緩沖液，PH7.0)與每ml纖維蛋白原溶液(1mg/ml水緩沖液0.05M Tris PH7.4，0.1M NaCl)混合制成纖維蛋白基質(zhì)。如果用膠原作基質(zhì)，可以用Colagen-Vliess
或明膠-血液混合物制成足夠粘度的溶液。如果用瓊脂糖作基質(zhì)，則用39-42℃的瓊脂糖液體溶液填充缺損。冷卻(35-38℃)后，在缺損處形成瓊脂糖基質(zhì)。
用30只兔子進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)(每種類型基質(zhì)和生長(zhǎng)因子用兩只兔子)。在所有放置的基質(zhì)，保持與缺損粘附的情況下缺損由成纖維細(xì)胞樣的修復(fù)細(xì)胞完全聚集。這種狀況早在手術(shù)后8-10天就發(fā)現(xiàn)了。除了可生物降解基質(zhì)被修復(fù)細(xì)胞改造并且被松散的、結(jié)締組織類型的胞外基質(zhì)替代之外，在手術(shù)后4周沒有進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)修復(fù)組織的結(jié)構(gòu)組織發(fā)生改變。
該組織沒有轉(zhuǎn)化成為軟骨組織。
實(shí)施例5將包裹在可生物降解基質(zhì)中的生長(zhǎng)因子施用于缺損部位以趨化性刺激修復(fù)細(xì)胞遷移至缺損區(qū)域并誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞增殖然后在第二階段適時(shí)地、局部釋放轉(zhuǎn)化因子以使缺損部位轉(zhuǎn)化成透明軟骨在施用生長(zhǎng)因子后，缺損體積中的基質(zhì)被修復(fù)細(xì)胞完全填充，以及這些細(xì)胞能改變過沉積的基質(zhì)(見實(shí)施例4)-這些發(fā)現(xiàn)促使我們研究引進(jìn)包裹形式(例如脂質(zhì)體)的轉(zhuǎn)化因子(例如TGF-β)的作用，當(dāng)基質(zhì)完全被修復(fù)細(xì)胞聚集(該細(xì)胞開始改造胞間結(jié)構(gòu))時(shí)，轉(zhuǎn)化因子就從包裹形式中釋放出來。
將TGF-β以低濃度(例如2-10ng/ml)混入纖維蛋白原溶液(1mg/ml)中，以引起最初的趨化和增殖作用。TGF-β也按照Kim等人〔(1983)，上文〕的方法包裹在脂質(zhì)體中。將含有TGF-β的脂質(zhì)體加到同樣的纖維蛋白原溶液中，其濃度應(yīng)該在該脂質(zhì)體破裂并釋放出TGF-β時(shí)足以提供較高濃度(100-1000ng/ml纖維蛋白原)的TGF-β，以便在纖維蛋白基質(zhì)聚集的修復(fù)細(xì)胞開始改變胞間物質(zhì)的第二階段期間促使修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞和促使基質(zhì)填充的缺損轉(zhuǎn)化成軟骨。
按照實(shí)施例2的方法使10只成年兔的表面膝關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生缺損，通過將含有游離的和脂質(zhì)體包裹的TGF-β的纖維蛋白原混合物施用于缺損部位對(duì)缺損進(jìn)行治療。在這一系列實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)實(shí)驗(yàn)中，游離TGF-β的濃度保持在2-10ng/ml纖維蛋白原的范圍，同時(shí)包裹的TGF-β的濃度是變化的，以便以100ng的間隔(根據(jù)從脂質(zhì)體釋放TGF-β的多少)提供100-1000ngTGF-β/ml纖維蛋白原的濃度，在所有各例的治療部位均形成透明軟骨組織。在高于200ng包裹的TGF-β/ml纖維蛋白原溶液的濃度下，最好是在高于500ng TGF-β/ml纖維蛋白原溶液的濃度下得到最能復(fù)現(xiàn)的結(jié)果。
實(shí)施例6測(cè)定組織轉(zhuǎn)化的時(shí)間點(diǎn)在此實(shí)驗(yàn)中，按照實(shí)施例2的方法對(duì)一組6只成年兔進(jìn)行膝外科術(shù)，以產(chǎn)生表面缺損。對(duì)表面缺損修復(fù)實(shí)施一個(gè)全面的治療方案，即用軟骨素酶ABC(1μ/ml)處理(4分鐘)，然后用含有游離TGF-β(約2-10ng/ml)和包裹TGF-β(約800ng/ml)的脂質(zhì)體的纖維蛋白基質(zhì)(1mg/ml纖維蛋白原溶液，20μl100μ/ml凝血酶溶液/ml纖維蛋白原溶液)填充缺損部位。在手術(shù)后第8、10和12天殺死三只兔子，在20、24和28天殺死剩余的三只。在這種動(dòng)物模型中，在12-20天，原始的、成纖維細(xì)胞樣的修復(fù)細(xì)胞組織轉(zhuǎn)化成為透明軟骨組織。這是根據(jù)組織檢查測(cè)定的。在8-12天，仍然存在松散的纖維性修復(fù)組織(所施用的纖維蛋白基質(zhì)被部分或全部改造)，而在20天及20天以后，缺損的空間被透明軟骨組織部分或完全填充。
實(shí)施例7在小豬模型中使用軟骨修復(fù)方法將上面用于兔子模型的實(shí)驗(yàn)方法用于更大的動(dòng)物模型-小豬。通過用刮刀(planing knife)在四只成年小豬(2-4齡，80-110磅)的髕骨溝和內(nèi)側(cè)髁切割，產(chǎn)生表面缺損(0.6mm寬，0.6mm深，10-15mm長(zhǎng))。然后用軟骨素酶ABC處理缺損(1μ/ml，處理4分鐘，按照上文對(duì)兔子使用的那樣)。除去酶溶液，使缺損干燥，用生理鹽水清洗，然后再干燥。然后用纖維蛋白原基質(zhì)溶液填充缺損部位。用于該實(shí)驗(yàn)的纖維蛋白基質(zhì)溶液每ml含有2-6ng游離的TGF-β，并且每ml纖維蛋白原溶液含有1500-2000ng脂質(zhì)體包裹的TGF-β。在填充缺損前，按照上面兔子實(shí)驗(yàn)中所述方法，將凝血酶加到該基質(zhì)溶液中。
手術(shù)后6周將小豬殺死，對(duì)基質(zhì)填充的缺損部位進(jìn)行組織檢查。所有部位表明都治愈了，即在治療部位形成了透明軟骨組織。
權(quán)利要求
1.治療或修復(fù)軟骨缺損或損傷的組合物，該組合物含有可生物降解基質(zhì)或形成基質(zhì)的材料，該基質(zhì)用于敷裹軟骨的缺損或損傷區(qū)域，和適當(dāng)濃度的增殖劑，以刺激基質(zhì)和缺損或損傷區(qū)域中的修復(fù)細(xì)胞的增殖。
2.如權(quán)利要求1的組合物，該組合物進(jìn)一步含有與傳送系統(tǒng)結(jié)合的適當(dāng)濃度的轉(zhuǎn)化因子，以使在轉(zhuǎn)化因子傳送給基質(zhì)和缺損區(qū)域中的修復(fù)細(xì)胞后，該修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)生軟骨組織的軟骨細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1或2的組合物，該組合物進(jìn)一步含有適當(dāng)濃度的趨化劑，以將修復(fù)細(xì)胞吸引到基質(zhì)和缺損區(qū)域中。
4.如權(quán)利要求3的組合物，其中趨化劑選自TGF-βs、FGFs、PDGF、TGF-α、TGF-β和蛋白多糖降解產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求1或2的組合物，其中增殖劑選自TGF-βs、FGFs、IGF I、PDGF、EGF、TGF-αs、人生長(zhǎng)激素和造血生長(zhǎng)因子。
6.如權(quán)利要求2的組合物，其中轉(zhuǎn)化因子選自TGF-βs、TGF-αs和FGFs。
7.如權(quán)利要求1或2的組合物，其中用于填充缺損區(qū)域的可生物降解的基質(zhì)選自纖維蛋白、膠原、明膠、瓊脂糖或其混合物。
8.如權(quán)利要求3的組合物，其中增殖劑、趨化劑和轉(zhuǎn)化因子都選自TGF-βs。
9.如權(quán)利要求2的組合物，其中轉(zhuǎn)化因子是一種或多種轉(zhuǎn)化因子的混合物。
10.如權(quán)利要求8的組合物，其中增殖劑和趨化劑是在基質(zhì)中濃度為2-50ng/ml的TGF-β，轉(zhuǎn)化因子是與合適的傳送系統(tǒng)結(jié)合的TGF-β，該系統(tǒng)能在基質(zhì)中提供大于200ng/ml濃度的TGF-β。
11.如權(quán)利要求2的組合物，其中該傳送系統(tǒng)選自脂質(zhì)體，可生物侵蝕的聚合物，與肝素硫酸蛋白多糖化學(xué)聯(lián)接的膠原纖維和碳水化合物骨架的顆粒。
12.治療或修復(fù)軟骨缺損或損傷的組合物，該組合物含有纖維蛋白基質(zhì)，該基質(zhì)是通過向纖維蛋白原溶液中加入凝血酶形成的，以2-10ng/ml纖維蛋白原溶液的濃度存在的TGF-β，和以大于200ng/ml纖維蛋白原溶液的濃度存在的包裹在脂質(zhì)體中的TGF-β。
13.在動(dòng)物軟骨組織的選擇部位誘導(dǎo)軟骨形成的方法，該方法包括用權(quán)利要求2的組合物敷裹該部位。
14.在動(dòng)物軟骨組織的選擇部位誘導(dǎo)軟骨形成的方法，該方法包括用權(quán)利要求12的組合物敷裹該部位。
15.治療動(dòng)物軟骨缺損或損傷的方法，該方法包括用含有下列成分的可生物降解基質(zhì)填充該缺損部位，這些成分是有效量的增殖劑以刺激修復(fù)細(xì)胞增殖;有效量的趨化劑以吸引修復(fù)細(xì)胞至基質(zhì)和缺損部位;以及有效量的與一個(gè)傳送系統(tǒng)結(jié)合的轉(zhuǎn)化因子以將修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細(xì)胞。
16.在動(dòng)物軟骨的選擇部位治療缺損或損傷的方法，該方法包括用可生物降解的基質(zhì)填充該缺損或損傷部位，該基質(zhì)含有有效量的趨化劑以吸引修復(fù)細(xì)胞至基質(zhì)和該缺損或損傷部位，以及有效量的增殖劑以刺激修復(fù)細(xì)胞的增殖，并且在用基質(zhì)填充該缺損后約1-2周將一種轉(zhuǎn)化因子傳送到基質(zhì)中，該轉(zhuǎn)化因子的濃度足以將修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求15或16的方法，該方法包括在用可生物降解的基質(zhì)填充該缺損前，用纖維蛋白膠或谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶覆蓋該缺損表面的步驟。
18.治療動(dòng)物軟骨缺損或損傷的方法，該方法包括用一種從缺損表面去除蛋白多肽的試劑填充該缺損，除去該試劑，以及用一種可生物降解基質(zhì)敷裹該缺損，該基質(zhì)含有一種有效量的增殖劑以刺激修復(fù)細(xì)胞增殖，并且該基質(zhì)含有與一個(gè)傳送系統(tǒng)結(jié)合的一種轉(zhuǎn)化因子，該系統(tǒng)釋放出足以使修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞濃度的轉(zhuǎn)化因子。
19.治療動(dòng)物軟骨缺損或損傷的方法，該方法包括用一種從缺損表面去除蛋白多糖的試劑填充該缺損除去該試劑用一種可生物降解基質(zhì)敷裹缺損，該基質(zhì)含有一種有效量的增殖劑以刺激修復(fù)細(xì)胞的增殖，以及在填充該缺損后約1-2周，將一種轉(zhuǎn)化因子傳送給基質(zhì)，該轉(zhuǎn)化因子的濃度要足以使修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為軟骨細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求18或19的方法，該方法進(jìn)一步包括在用可生物降解基質(zhì)敷裹該缺損或損傷之前，用纖維蛋白膠或谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶覆蓋該缺損或損傷表面的步驟。
21.如權(quán)利要求18或19的方法，其中的可生物降解基質(zhì)還含有趨化劑，其濃度足以將修復(fù)細(xì)胞吸引到基質(zhì)和該軟骨缺損或損傷的區(qū)域中。
22.如權(quán)利要求18或19的方法，其中將蛋白多糖從缺損表面除去的試劑選自軟骨素酶ABC、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、骨蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、stromelysin和Staph V8蛋白酶。
23.權(quán)利要求21的方法，其中增殖劑、趨化劑和轉(zhuǎn)化因子都是TGF-β。
24.權(quán)利要求18的方法，其中傳送轉(zhuǎn)化因子的傳送系統(tǒng)選自脂質(zhì)體、可生物侵蝕的聚合物、與肝素硫酸蛋白多糖化學(xué)聯(lián)接的膠原纖維和碳水化合物骨架顆粒。
25.權(quán)利要求15、16、18或19的方法，其中可生物降解基質(zhì)選自纖維蛋白、膠原、明膠、瓊脂糖或其混合物。
26.如權(quán)利要求15、16、18或19的方法，其中可生物降解基質(zhì)是纖維蛋白，它是就在用纖維蛋白原溶液填充缺損或損傷之前將凝血酶加到纖維蛋白原溶液中形成的。
27.如權(quán)利要求21的方法，其中增殖劑和趨化劑是濃度為2-10ng/ml基質(zhì)的TGF-β，轉(zhuǎn)化劑是包裹在脂質(zhì)體中的濃度大于200ng/ml基質(zhì)的TGF-β。
28.如權(quán)利要求18或19的方法，其中使蛋白多糖從缺損表面去除的試劑是軟骨素酶ABC，并且該缺損用含有濃度為1單位/ml的軟骨素酶ABC的溶液填充4分鐘。
29.如權(quán)利要求15、16、18或19的方法，其中可生物降解基質(zhì)進(jìn)一步含有含三肽Arg-Gly-Asp的細(xì)胞粘附促進(jìn)因子。
30.治療動(dòng)物軟骨缺損或損傷的方法，該方法包括用濃度為1單位/ml的無菌軟骨素酶ABC溶液填充該缺損或損傷4分鐘，除去軟骨素酶ABC溶液，用無菌生理鹽水清洗缺損區(qū)域，使該缺損區(qū)域干燥，向每毫升基質(zhì)形成溶液中加入2單位凝血酶，該溶液含有1mg/ml的纖維蛋白原，并且含有2-10ng/ml濃度的TGF-β和濃度大于200ng/ml的包裹在脂質(zhì)體中的TGF-β，以及在加入凝血酶后立刻用該基質(zhì)形成溶液填充該缺損部位。
31.如權(quán)利要求30的方法，該方法進(jìn)一步包括在用該基質(zhì)形成溶液填充該缺損前，用纖維蛋白膠或谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶覆蓋該缺損表面的步驟。
32.如權(quán)利要求30的方法，其中脂質(zhì)體中TGF-β的濃度大于500ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療和修復(fù)人和其他動(dòng)物軟骨缺損或損傷的方法及組合物。首先用酶處理軟骨的缺損或損傷部位，使蛋白多糖從缺損區(qū)域去除。為了誘導(dǎo)軟骨形成，用帶孔的可生物降解基質(zhì)填充或敷裹缺損部位，其孔的大小足以使修復(fù)細(xì)胞聚居于基質(zhì)中。填充缺損的基質(zhì)含有增殖劑，其濃度足以刺激修復(fù)細(xì)胞增殖，以及在合適傳送系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化因子，該系統(tǒng)釋放出足使基質(zhì)和缺損區(qū)域中的修復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)生軟骨的軟骨細(xì)胞濃度的轉(zhuǎn)化因子?；|(zhì)還可以含有趨化劑以吸引修復(fù)細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K38/22GK1064813SQ9210143
公開日1992年9月30日 申請(qǐng)日期1992年1月31日 優(yōu)先權(quán)日1991年1月31日
發(fā)明者E·B·亨齊克 申請(qǐng)人:羅伯特弗朗西斯肖