專利名稱：非肽的brs－3激動劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的、對鈴蟾肽受體3亞型(BRS-3)具有選擇地激動作用的非肽化合物，并涉及包含該化合物的藥物制劑以及用于制備該化合物的方法。
鈴蟾肽(Bn)是一種由14種氨基酸組成的肽，最初從兩棲動物中分離的。兩種在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的肽神經(jīng)介肽B(NMB)和“胃泌素釋放肽”(GRP)是結(jié)構(gòu)相似的肽。這些鈴蟾肽類的肽是相應(yīng)的鈴蟾肽受體、“神經(jīng)介肽B受體”(NMB-R，BB1)和“胃泌素釋放肽受體”(GRP-R，BB2)的天然內(nèi)源配體。鈴蟾肽受體屬于具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的G-偶合受體組。
由于其氨基酸序列的同源性，鈴蟾肽受體3亞型(BRS-3或BB3)被歸類為鈴蟾肽受體家族[參見Fathi等人(1993)J.Biol.Chem.2685979-84；下面被引用為“Fathi等人”]。BRS-3的天然配體迄今還是未知的。已經(jīng)證實了在大腦的不同區(qū)域[參見Yamada等人(1999)PhysiolBehav.66863-7]、次級精母細胞[參見Fathi等人]、胰島細胞[參見Fleischmann等人(2000)Lab Invest.801807-17]和懷孕動物的子宮組織[參見Gorbulev等人(1992)Eur.J.Biochem.208405-10]中BRS-3的表達。此外，BRS-3被發(fā)現(xiàn)于不同的人體癌細胞系中(如肺[參見Fathi等人]、乳腺[參見Gorbulev等人(1994)FEBS Lett.340260-4]、前列腺[參見Sun等人(2000)Prostate42295-303]或卵巢[參見Sun等人(2000)Regul.Pept.9077-84])中。
已剔除BRS-3基因的遺傳變異小鼠(“BRS-3敲除小鼠”)表現(xiàn)出包括肢體肥胖、過量攝食以及高血壓和糖尿病的病狀[參見Okhi-Hamazaki等人(1997)Nature 390165-9]。因此，BRS-3看來似乎在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和脂代謝、保持能量態(tài)和控制血壓、以及在影響取食行為中是必要的參與者。因此可認為BRS-3激動性化合物特別適用于預(yù)防和/或治療病理狀態(tài)如肥胖(＝肥胖癥(Adipositas))、糖尿病、血胰島素過多、心血管病、進食失調(diào)(攝食過量、厭食、易餓病)和/或代謝綜合癥(＝綜合癥X)。綜合癥X表明它在所有類型II的糖尿病和/或降低葡萄糖耐量、動脈高血壓、脂代謝失調(diào)、肥胖以及冠心病上。
此外，已知BRS-3的活化作用可以具有神經(jīng)保護作用[參見WO01/68120]。BRS-3還看起來似乎與味覺[參見Yamada等人(1999)Physiol.Behav.66863-7]、影響社會行為[參見Yamada等人(2000)Physiol.Behav.68555-61]以及某些情緒行為[參見Yamada等人(2002)Mol.Psychiatry.7113-7]相關(guān)。因此同樣地認為BRS-3-調(diào)節(jié)化合物可適用于預(yù)防和/或治療精神癥狀如沮喪或恐懼狀態(tài)、味覺失調(diào)和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，如帕金森癥或阿爾茨海默病(Alzheimer)。
已知一些合成的肽配體以一定的親和性與BRS-3結(jié)合，并且在其上展示激動性作用，即BRS-3選擇性八肽[D-Phe6，Phe13]Bn(6-13)丙酰胺[參見Wu等人(1996)Mol Pharmacol.501355-63]和低選擇性的九肽[D-Tyr6，β-Ala11，Phe13，Nle14]Bn(6-14)[參見Mantey等人(1997)J Biol Chem.27226062-71]及其衍生物[參見Pradhan等人(1998)Eur J Pharmacol.343275-87；Mantey等人(2001)J BiolChem.2769219-29]。
此外低分子量的、非肽的鈴蟾肽類似物化合物已在WO 98/07718中公開了，但是它們是鈴蟾肽受體家族的另外兩種亞型(NMB-R和GRP-R)的選擇性激動劑。對BRS-3具有高親合力的選擇性激動作用的低分子量的、非肽類化合物迄今未有描述。
因此，本發(fā)明的一個目的是可制備對BRS-3具有高親合力的選擇性激動作用的新的、低分子量的、非肽類化合物。
出人意外地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明低分子量的非肽類新化合物是選擇性BRS-3激動劑，從而適用于預(yù)防和/或治療能通過刺激BRS-3產(chǎn)生有利影響的病癥。由于其有利作用，本發(fā)明的化合物看來尤其適用于預(yù)防和/治療肥胖(＝肥胖癥)、糖尿病、血胰島素過多、心血管病、進食失調(diào)(攝食過量、厭食、易餓病)和/或綜合癥X。
本發(fā)明的目的是提供如通式I所示的新化合物， 其中A1為CH或，當A2不代表鍵并同時A3不代表NH，也表示氮，A2為鍵、C1-2-亞烷基或，當A1為CH以及R2為氫，也表示羰基，A3為未取代或經(jīng)C1-4-烷基或C1-4-烷基羰基酰胺取代的亞甲基或，當R2為氫或與R1一并為鍵，也表示NH，R1為氫或，當A2代表羰基，也表示氨基，和R2為氫，或R1和R2一并為C1-2-亞烷基或，當A2為鍵，R1和R2可一并為鍵。
R3為氫或甲基，Ar1為未取代或經(jīng)鹵素或C1-4-烷基取代1至2次或由鍵合在兩個相鄰環(huán)碳原子上的C1-2-亞烷基二氧基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吲哚基或四氫異喹啉基，Ar2為呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、吡咯基或吲哚基，Ar3為未取代或經(jīng)鹵素取代1至2次的苯基或吡啶基，m為0或1和n為0或1，以及任選的其生理相容的酸加成鹽。本發(fā)明進一步的目的是包含式I化合物的藥物制劑以及用于制備這些化合物的方法。
其中如果取代基C1-4-烷基包含在式I化合物中，其可為直鏈或支鏈的。其中如果包含鹵素的取代基，其可尤其為氟、氯或溴。氯是優(yōu)選的。
其中如果A3經(jīng)C1-4-烷基取代，優(yōu)選甲基。其中如果A3經(jīng)C1-4-烷基羰基酰胺取代，優(yōu)選正丙基酰胺。
R3優(yōu)選為氫。
Ar1優(yōu)選為未取代或經(jīng)鹵素取代1次的苯基、吡啶基、呋喃基(尤其是2-呋喃基)、或吲哚基(尤其是2-吲哚基)。
Ar2優(yōu)選為苯并噻吩基或吲哚基。吲哚基，尤其3-吲哚基是優(yōu)選的。
Ar3優(yōu)選為苯基，尤其是無取代的苯基。
n優(yōu)選為1。
優(yōu)選的式I化合物是下列的通式Ia化合物， 其中Ar1和m如上定義，R101為氫或氨基，R4為氫、C1-4-烷基或C1-4-烷基羰基酰胺，并且Ar201為苯并噻吩基或吲哚基，通式Ib化合物， 其中R4、Ar1、Ar201和m如上定義，通式Ic化合物， 其中Ar1、Ar201和m如上定義，通式Id化合物，
其中Ar1、Ar201和m如上定義，通式Ie化合物， 其中Ar1、Ar201和m如上定義，通式If化合物， 其中A1、Ar1、Ar201和m如上定義。
式I化合物表示非肽化合物，然而其包含肽鍵。因此式I化合物可看作是非天然多肽，并且以已知用于多肽合成的方法進行部分或完全合成，例如采用具適合的氨基和羧基基底的常規(guī)固相或液相合成技術(shù)，優(yōu)選以連續(xù)的方式進行合成。其它的有機化學(xué)合成方法也可用于制備式I化合物，可采用已知的常規(guī)有機化學(xué)合成方法。
因此，式I化合物及其酸加成鹽例如可以下列方式進行制備
a)用于制備通式Ig化合物 其中A3、R101、R3、Ar1、Ar2、Ar3、m和n如上定義，將通式II化合物， 其中m如上定義，Ar110如上述Ar1所定義的，其中任何反應(yīng)基團均受到保護基團的保護，以及R111如上述R101所定義的，任何氨基均受到保護基團的保護，與通式III化合物進行反應(yīng)， 其中R3、Ar3和n如上定義，Ar210如上述Ar2所定義，任何反應(yīng)基團均受到保護基團的保護，以及A310如上述A3所定義的，任何反應(yīng)性氮原子均受到保護基團的保護，或b)用于制備通式Ih化合物 其中A1、A2、R1、R2、R3、Ar1、Ar2、Ar3、m和n如上定義，A301如上述A3所定義(除NH之外)，將通式IV化合物，
其中A1、A2、Ar110和m如上定義，A311如上述A301所定義，任何反應(yīng)性氮原子均受到保護基團的保護，R110如上述R1所定義的，任何氨基均受到保護基團的保護，以及R201如上述R2所定義的(除氫之外)，或表示氨基保護基團，與通式V化合物進行反應(yīng)， 其中R3、Ar210、Ar3和n如上定義，或c)用于制備通式Ii化合物 其中A1、R3、Ar1、Ar2、Ar3、m和n如上定義，以及A201如上述A2所定義(除羰基之外)，將具有羰基合成等價物的式V化合物與通式VI化合物反應(yīng)， 其中A1、A201、Ar110和m如上定義，R104為氫或，當A1為氮，也表示氮保護基團，以及SG為適用于肽化學(xué)的保護基團，或
d)用于制備通式Ij化合物 其中A310、R3、Ar1、Ar2、Ar3、m和n如上定義，將式III化合物與通式VIII化合物反應(yīng)，Ar110-(CH2)m-CHOVIII其中Ar110和m如上定義，并且隨后任何保護基團均再被去除，視需要將所產(chǎn)生的式I化合物轉(zhuǎn)變成其酸加成鹽，或?qū)⑺峒映甥}轉(zhuǎn)變成游離的式I化合物。
根據(jù)變化方法a)，可通過將式II的羧酸衍生物與式III的伯胺反應(yīng)制備式Ig化合物，并且隨后再去除可能的保護基團。該反應(yīng)可以在肽化學(xué)方法中已知的液相或固相反應(yīng)的方式進行，例如以“Merrifield”式的固相肽合成法。如果合成在固相中進行，優(yōu)選在極性非質(zhì)子溶劑中，如N-甲基吡咯烷酮(＝NMP)中，將式III的樹脂結(jié)合(resin-bound)化合物與式III化合物、以及作為偶合反應(yīng)劑的適宜化合物反應(yīng)，所述偶合反應(yīng)劑尤其是N-羥基苯并三唑(＝HOBT)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲陽離子四氟硼酸鹽(＝TBTU)、N-羥基-9-氮雜苯并三唑(＝HOAT)和/或2-(1H-9-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲陽離子六氟磷酸鹽(＝HATU)，以及也存有非親核有機堿，尤其是二異丙基乙基胺(＝DIPEA)。適用于固相合成的樹脂尤其是2-(4-甲?；?3-甲氧苯氧基)乙基樹脂(＝FMPE樹脂，參見如A.Floersheimer等人，Pept.1990，Proc.Eur.Pept.Symp.，21st(1991)，Meeting Date 1990，E.Giralt等人(eds.)ESCOMLeiden，1991；131)。該樹脂可用已知方法上載待用于進一步反應(yīng)的化合物(參見如下)。
式II化合物本來是已知的或可以已知方法從已知化合物制備(參見例如R.Gretler等人(1978)Helv.Chim.Acta 61(5)1730-1755)。因此例如式II化合物(其中Ar110為任選地經(jīng)保護的2-吲哚基)可通過將硝基苯基乙酰乙酸衍生物與三氯化鈦還原反應(yīng)的已知方法獲得(參見例如C.J.Moody等人(1990)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1673-679；A.Mai等人(1999)J Med.Chem.42619-627)。用于本發(fā)明范圍內(nèi)的保護基團均可以已知方法引入，并且通常是選擇性地、相互獨立的并再度去除的，例如用于肽合成的適宜的保護基團已知于J.A.W.McOmie，″ProtectiveGroups in Organic Chemistry″，Plenum Press 1971，or T.W.Green andP.G.M.Wuts，″Protective Groups in Organic Synthesis″，Wiley andSons 1999。若取代基R111經(jīng)適宜的保護基團保護，尤其來自肽化學(xué)已知的保護基團是適合的。優(yōu)選適宜的是叔丁基羰基氧基(＝Boc)或(9H-芴-9-基甲氧基)羰基(＝Fmoc)保護基團。
例如式III化合物可通過將式V化合物與通式X化合物反應(yīng)制得， 其中A310如上定義，以及SG如上定義并且優(yōu)選為Fmoc保護基團，隨后以已知的方法再度去除保護基團SG。該反應(yīng)可以上述用于將式II化合物與式III化合物反應(yīng)的方法進行，其中優(yōu)選式V化合物是與樹脂結(jié)合的。若存在于基團A310中的反應(yīng)性氮原子受到適宜保護基團的保護，三苯基甲基(＝三苯甲基，Trt)保護基團尤其適用于此。式X化合物本身是已知的，或可以已知方法由已知化合物制備。
式V化合物可以通式XI化合物來加以制備，
其中Ar210和SG如上定義，與通式XII化合物反應(yīng)， 其中R3、Ar3和n如上定義，隨后將保護基團SG再度去除。該反應(yīng)可以上述用于將式II化合物與式III化合物反應(yīng)的方法以固相合成法進行，在此優(yōu)選式XII化合物是與樹脂結(jié)合的。若使用FMPE樹脂，該樹脂可以已知的還原胺化方法上載式XII化合物(參見B.Drner等人，Pept.1998，Proc.Eur.Pept.Symp，25th(1999)，Meeting Date 1998；S.Bajusz等人(eds.)，Akadémiai KiadóBudapest，1999；90)。式XI化合物本身是已知的，或可以已知方法由已知化合物制備。若式XI化合物中的Ar210是受到保護基團保護的，尤其是來自肽化學(xué)的已知保護基團是適宜的。優(yōu)選的Boc保護基團是適宜的。式XII化合物本身是已知的，或可以已知方法由已知化合物制備。
方法a)的實施方式中，式Ik化合物， 其中R101、R3、Ar1、Ar2、Ar3、m和n如上定義，可以由式II的羧酸衍生物與式IIIa的肼衍生物反應(yīng)制得， 其中R3、Ar210、Ar3和n如上定義，隨后再度去除可能存在的保護基團。該反應(yīng)可以上述用于將式II化合物與式III化合物反應(yīng)的方法以固相合成法進行。式IIIa化合物可通過將式V化合物與已知的5-(9H-芴-9-基甲氧基)-3H-[1，3，4]噁二唑-2-酮反應(yīng)加以制備，并且隨后去除不需要的保護基團。該反應(yīng)可以例如上述用于將式II化合物與式III化合物反應(yīng)的方法，以固相合成法進行，其中可用作溶劑的尤其是二氯甲烷。
根據(jù)變化方法b)，式Ih化合物可通過將式IV的羧酸衍生物與式V的伯胺進行反應(yīng)，隨后再度去除可能存在的保護基團來制備。該反應(yīng)可以上述用于將式II化合物與式III化合物反應(yīng)的方法以固相合成法或也可以用液相法進行反應(yīng)。若反應(yīng)在固相中進行，優(yōu)選式V化合物是與樹脂結(jié)合的。若反應(yīng)在液相中進行，可以在極性非質(zhì)子溶劑中如二甲基甲酰胺(＝DMF)和在方法a)中給出的作為偶聯(lián)劑的適宜化合物的存在下以及在非親核有機堿尤其是對稱三甲基吡啶(sym.Colliding)的存在下進行反應(yīng)。當R201表示氨基保護基團時，其可優(yōu)選為Fmoc保護基團。當取代基R110受到適宜保護基團保護時，適用于取代基R111的上述給定保護基團是適宜的。式IV化合物可通過將通式XIII化合物與通式XIV反應(yīng)制得， 其中A1、A2、R110、R2、Ar110和m如上定義， 其中A311如上定義，X為可去除的離去基團，以及SG1為羧酸保護基團，隨后以已知方法再度去除羧酸保護基團SG1，并且視需要將保護基團引入取代基R2中。介于-20℃至室溫之間(＝RT)，優(yōu)選在0℃，在芳族溶劑如甲苯中進行反應(yīng)。尤其是鹵素，優(yōu)選氯或溴，被用作式XIV化合物中的離去基團X。羧基保護基團SG1尤其是較低烷基，優(yōu)選乙基或叔丁基。式XIII化合物本身是已知的，或可以已知方法由已知化合物制備?；騒IV化合物是本身已知的，或可以已知方法由已知化合物制備。
根據(jù)變化方法c)，式Ii化合物可通過將式V的伯胺與羰基合成等價物和式VI的肼衍生物進行反應(yīng)，并且隨后再去除可能存在的保護基團而制得。該反應(yīng)優(yōu)選在室溫下的液相中進行，尤其是雙極性的非質(zhì)子性溶劑如二氯甲烷。有利的是，操作是在溶于溶劑的有機非親核堿中進行，如4-二甲基氨基吡啶(＝DMAP)。適宜的羰基基團合成等價物優(yōu)選二戊氟苯基碳酸酯或碳酰氨、雙-(三氯甲基)碳酸酯(＝三碳酰氯)、氯甲酸三氯甲酯(＝二碳酰氯)或羰基二咪唑。式VI化合物本身是已知的，或可以已知方法由已知化合物制備。因此例如通式VIa的化合物， 其中Ar110、m和SG如上定義，可以已知方法由通式VIII相應(yīng)的醛和通式XVII相應(yīng)的胺通過還原胺化作用制得， 其中SG2表示肽化學(xué)中已知的保護基團，優(yōu)選Boc保護基團，隨后引入保護基團SG，并且最終去除保護基團SG2。該反應(yīng)可在雙極性非質(zhì)子性溶劑如四氫呋喃(＝THF)以及優(yōu)選在室溫下進行。還原獲得的作為中間產(chǎn)物的相應(yīng)亞胺化合物可在雙極性非質(zhì)子性溶劑如THF以及介于-20℃和室溫，優(yōu)選0℃下進行。適宜的還原劑為絡(luò)合的氫硼化物如NaCNBH3。式VIII和XVII化合物本身是已知的，或可以已知方法由已知化合物制備。
根據(jù)變化方法d)，式Ij化合物可通過將式III的胺化合物與式VIII的醛反應(yīng)，并且隨后再去除可能存在的保護基團。該反應(yīng)可以上述用于將式XVI化合物與式XVII化合物反應(yīng)的方法進行，然而該實例中最終亞胺并沒有減少。
所述獲得的式I化合物均可以已知方法從反應(yīng)混合物中分離并進行純化?？梢猿Ｒ?guī)方法將酸加成鹽轉(zhuǎn)化為游離堿，并且視需要可以已知方法將其轉(zhuǎn)化為生理相容的酸加成鹽。
式I化合物的生理相容的鹽是其與無機酸的鹽，例如硫酸、磷酸或氫鹵酸，優(yōu)選氫氯酸，或其與有機酸的鹽，如低級脂肪族的一元羧酸、二元羧酸或三元羧酸如馬來酸、富馬酸、乳酸、酒石酸、檸檬酸，或磺酸例如低級烷烴磺酸，如甲烷磺酸或未經(jīng)取代或在苯環(huán)上經(jīng)鹵素或低級烷烴取代的苯磺酸，如對甲苯磺酸。
式I化合物除連有-CH2-Ar2基的碳原子外，也可進一步包含其它手性中心，即連有取代基R3的碳原子、亞甲基A3的經(jīng)C1-4烷基或C1-4烷基羰基酰胺取代的碳原子和/或CH基團A1的碳原子，其中R1為氨基。因此式I化合物可以多種立體異構(gòu)形式存在。本發(fā)明既包含光學(xué)異構(gòu)體的混合物，又包含式I的純異構(gòu)體化合物。式I的純異構(gòu)體化合物是優(yōu)選的，尤其是式I化合物(其中亞甲基A3的碳原子經(jīng)C1-4-烷基或C1-4-烷基羰基酰胺取代具有S構(gòu)型)。若將光學(xué)異構(gòu)體混合物的初始化合物用于合成式I化合物，式I化合物也以光學(xué)異構(gòu)體的混合物形式獲得。由立體化學(xué)均一形式的初始化合物進行合成，則可獲得式I的立體化學(xué)均一的化合物。式I的立體化學(xué)均一化合物也可以已知方法從光學(xué)異構(gòu)體混合物中獲得，例如通過對于手性分離物質(zhì)的色譜分離法，或通過與適宜的光學(xué)活性的酸反應(yīng)，如酒石酸或樟腦-10-磺酸，并且隨后通過所獲得的非對映異構(gòu)體鹽的分餾結(jié)晶分離成光學(xué)活性對映體。
式I新化合物及其生理相容的酸加成鹽對鈴蟾肽受體3亞型(與其它已知的鈴蟾肽受體亞型、NMB-R和GRP-R比較)的高選擇性親和力而著稱，并對鈴蟾肽變體3亞型起激動作用。因此，應(yīng)期望式I化合物適用于預(yù)防和/或治療通過刺激BRS-3能產(chǎn)生有利影響的病癥。特別是，本發(fā)明的化合物看起來適用于預(yù)防和/或治療肥胖(＝肥胖癥)、糖尿病、血胰島素過多、心血管病、進食失調(diào)(攝食過量、厭食、易餓病)和/或綜合癥X。
藥理學(xué)試驗方法描述例如在按照FLIPR方法(“Fluorometric Imaging Plate Reader”)中進行的藥理標準試驗方法，可體外證明試驗物質(zhì)的BRS-3-激動性效果。
對此，首先以已知的方法，用表達載體轉(zhuǎn)染CHO細胞(＝“中國倉鼠卵巢細胞”)，所述表達載體用于人體鈴蟾肽3亞型的受體，即BRS-3。
采用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI，將人體BRS-3的cDNA(GenBankAccession Nr.L08893下的核酸序列)從質(zhì)粒載體pGEM4(來自Promega，USA)中切離，并且次級克隆入表達載體pcDNA3.1(-)(來自Invitrogen，USA)。將已經(jīng)用表達載體RD-HGA16(其含有人體Gα16蛋白質(zhì)的cDNA序列(GenBank Accession Nr.M63904的核苷酸序列))穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-K1細胞置于24樣品孔的樣品板中(“24-孔板”)，并在37℃下和5％CO2于添加Glutamax-I(來自GibcoBRL，kat.-Nr.31765)至已加入10％濃度的胎牛血清(56℃滅活1小時，來自GibcoBRL)、25μg/ml的慶大霉素(來自GibcoBRL)和0.2mg/ml潮霉素B(來自GibcoBRL)的F-12培養(yǎng)基中，無菌條件下的空氣濕潤的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天，通過加入BRS-3表達載體轉(zhuǎn)染的細胞，利用“Effectene轉(zhuǎn)染試劑”(來自Qiagen)，每樣品孔中有12μl含有0.3μg/μl的DNA表達載體的溶液。轉(zhuǎn)染后一天，用選擇性培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。對此，在37℃下和5％CO2于添加Glutamax-I(來自GibcoBRL，kat.-Nr.31765)至已加入10％濃度的胎牛血清(56℃滅活1小時，來自GibcoBRL)、25μg/ml的慶大霉素(來自GibcoBRL)、0.2mg/ml潮霉素B(來自GibcoBRL)和0.5mg/ml遺傳霉素(來自GibcoBRL)的F-12培養(yǎng)基中，將分別同時表達BRS-3和人體Ga16蛋白質(zhì)的經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞在無菌條件中培養(yǎng)。為優(yōu)化細胞試驗，選擇具有最高受體表達速率的細胞。對此，將所述轉(zhuǎn)染的細胞用上述選擇培養(yǎng)基以1∶30000稀釋，并置于96樣品孔的樣品板中(“96孔板”)。將所述細胞于37℃和5％CO2中培養(yǎng)過夜，然后選擇僅含有單細胞克隆的樣品孔。這些細胞首先于24樣品孔的樣品板中(“24孔板”)培養(yǎng)，然后在Costar塑料瓶中培養(yǎng)(先是25ml，隨后是225ml)。各個單細胞克隆的BRS-3受體表達通過測定作為配體的合成九肽[D-Phe6，β-Ala11，Phe13，Nle14]Bn(6-14)的EC50值來計算(對于測試的操作參見下文)。在-80℃下，以等分量將轉(zhuǎn)染的細胞貯藏在具有10％二甲亞砜(＝DMSO)的1.8ml培養(yǎng)基中(細胞濃度1×106細胞/ml)。對于培養(yǎng)，將凍結(jié)的等分量加熱至37℃，轉(zhuǎn)入Costar塑料瓶(225ml)中，并用50ml的上述選擇性培養(yǎng)基稀釋。該培養(yǎng)基首先在培養(yǎng)30分鐘后進行一次性交換。在接下來的每個一至3天里，除去培養(yǎng)基，用PBS Dulbecco’s(來自GibcoBRL)洗滌附著的細胞(40-90％匯合)，并通過在37℃用胰蛋白酶EDTA溶液(來自GibcoBRL)處理2分鐘，從燒瓶底部進行分離。如果欲對該細胞作進一步培養(yǎng)，將它們轉(zhuǎn)入新的具新鮮培養(yǎng)基的塑料瓶中。若欲用該細胞進行試驗，將該細胞轉(zhuǎn)入96樣品孔、清潔的底板并且具有蓋子的Costar樣品板中(“Costar96孔試驗板”，來自Corning)，條件是將細胞濃縮物設(shè)為1.2×104細胞/ml。
BRS-3經(jīng)G-蛋白質(zhì)偶聯(lián)至CHO細胞的Ca2+信號傳遞通道。如果激動劑結(jié)合受體，經(jīng)由G-蛋白質(zhì)激活磷脂酶C，然后磷脂酶催化水溶性肌醇磷酸鹽的合成。該水溶性肌醇磷酸鹽引起存貯在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+的釋放。以稱為FLIPR試驗測定胞液Ca2+濃度的瞬間提高。最終，細胞充滿了Ca2+結(jié)合的、熒光染料Fluo4(來自Molecular Probes)。該細胞內(nèi)的染料結(jié)合激活后被釋放的胞液Ca2+離子，并以此加強其熒光強度。熒光強度的改變與細胞內(nèi)Ca2+濃度的改變成比例，并且是經(jīng)相應(yīng)的激活劑激活細胞的計量標準。最高的熒光感應(yīng)下，激活度取決于所采用化合物的濃度。對于每種待測物質(zhì)的不同物質(zhì)濃度，測定其激活BRS-3引起的熒光變化。采用合成九肽[D-Phe6，β-Ala11，Phe13，Nle14]Bn(6-14)激活BRS-3的最大熒光感應(yīng)充當100％激活的參考值[參見Mantey等人(1997)J.Biol.Chem.27226062-26071]。產(chǎn)生50％激活的化合物濃度被確定為EC50值，并且作為每個充當BRS-3激動劑測試化合物的效果的計量標準。
在“Costar 96孔測試板”(來自Corning)中，將轉(zhuǎn)染的CHO細胞培養(yǎng)18至24小時(＝h)，直至匯合。每天制備新鮮的250mM丙磺舒原液。對此，將710mg丙磺舒(來自Sigma #P8761)溶解在5ml的1N的NaOH中，然后用含有20mM的HEPES(來自PAA Laboratories)無苯酚磺酞的HBSS介質(zhì)(GibcoBRL)稀釋至10ml。通過將1mgFluo4溶解在440μl的DMSO中制備2mM熒光鈣離子指示劑染料Fluo4的原液，并貯藏在-20℃下。
此外，使用20％濃度(w/v)Pluronic F-127(來自Sigma)的DMSO溶液。即刻使用前，將22μl等分量的Fluo4原液解凍。通常采用將42ml的含有60mM的HEPES(來自PAA Laboratories)無苯酚磺酞的HBSS介質(zhì)(GibcoBRL)，與420μl的丙磺舒原液，以及各22μl Fluo4原液和Pluronic F-127溶液相混合來新鮮制備加載介質(zhì)。在37℃和5％的CO2中，將細胞分別用100μl新鮮加載介質(zhì)在每個樣品孔中培養(yǎng)45-60分鐘。然后將所述細胞用100μl的HBSS介質(zhì)洗滌3次，每次使用20mM的HEPES和2.5mM的丙磺舒。在隨后最終的洗滌步驟中，將100μl體積保留在每個96樣品孔的細胞中。
每個實例中，由式I化合物制備10mM于DMSO溶液中的原液，用具有20mM HEPES的HBSS介質(zhì)的稀釋系列將其裝入96樣品孔的微量滴定板中(“96孔板”，來自Greiner)。測定中使用的最大濃度通常為33μM，但在某些實例中也僅為1μM。根據(jù)不同的化合物，將溶液以1∶2、1∶3、1∶4或1∶10的比例于8或16的不同樣品孔中稀釋。每個微量滴定板含有作為參照的九肽[D-Phe6，β-Ala11，Phe13，Nle14]Bn(6-14)的稀釋系列。
FLIPR設(shè)備(來自Molecular Devices)設(shè)計為在30秒(＝sec.)時間內(nèi)每間隔6秒測定背景熒光。每個實例中，從微量滴定板的每個樣品孔轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的細胞板樣品孔50μl后，繪制100秒(＝sec.)內(nèi)(以1秒的間隔)熒光的改變，于最后的42秒內(nèi)，每次間隔為6秒。
繪制以濃度為函數(shù)的參照化合物熒光的改變，根據(jù)已經(jīng)觀察到的熒光的最大改變，確定九肽的肽濃度(通常為16μM)。將每樣品孔熒光的最大變化值輸至Excel電子數(shù)據(jù)程序中(來自Microsoft)，并用采用100％值的相應(yīng)參照化合物的熒光最大變化值加以校驗。利用GraphpadPrism程序(Version 3.00，來自Graphpad Software)計算以待測化合物的濃度為函數(shù)的相對熒光變化的變化曲線和其相應(yīng)的EC50值。
在上述的藥理學(xué)FLIPR試驗中，所有下述給出的化合物實例的EC50值(以nM)均低于或等于2600。實施例13至34化合物顯示的EC50值低于或等于710。對于式I的各種化合物，經(jīng)上述FLIPR試驗中確定的EC50值列于下表1中。表1中給定的實施例號與下面的制備表1試驗物質(zhì)對BRS-3的激活活性
式I化合物可以常規(guī)的藥物制劑使用。所使用的劑量必然地分別根據(jù)待治療的狀態(tài)和所應(yīng)用的物質(zhì)的類型可以個別地不同和變化。然而通常來說，每份劑量含有0.1至300mg的活性物質(zhì)的藥物形式適用于施與人體和較大的哺乳動物。
本發(fā)明的式I化合物可與常規(guī)的藥物助劑和/或賦形劑一起，包含在固體或液體藥物制劑中。固體制劑的實例是可口服用藥的制劑，如片劑、糖衣丸、膠囊、粉劑或粒劑，或可為栓劑。除常規(guī)的藥物助劑如潤滑劑或片劑崩解劑外，這些制劑可包含常規(guī)的藥物無機和/或有機賦形劑，如滑石、乳糖或淀粉。液體制劑如活性物質(zhì)的懸浮劑或乳劑可包含常用的稀釋劑如水、油和/或懸浮劑如聚乙二醇等。還可加入其它的助劑例如防腐劑、矯味劑等。
可以已知方法將活性物質(zhì)與藥物助劑和/或賦形劑混合和配制。對于制備固體藥劑形式，例如可以常規(guī)方法將活性物質(zhì)與助劑和/或賦形劑混合，并可以濕法或干法造粒。顆?；蚍勰┛梢猿Ｒ?guī)方法直接注入膠囊中或壓制成片芯?？梢曅枰砸阎椒▽λ鼈冞M行包糖衣。
下面的實施例將進一步解釋本發(fā)明，但不限制其范圍。
實施例1N1-[(1R)-2-(1H-3-吲哚基)-1-(苯乙基氨甲酰基)-乙基]-(2S)-2-{[(1R)-1-氨基-2-苯乙基]-羧酰胺基}-戊肼；(H-D-Phe-Gln-D-Trp-苯乙基酰胺) A)將100mg的FMPE樹脂(最大容量0.54mmol/g)于1ml的二氯乙烷中溶脹10分鐘。將0.5ml的三甲基原甲酸酯(＝TMOF)、68μl的2-苯乙基胺和114mg的NaBH(OAc)3加入上述所得溶液，用超聲處理所產(chǎn)生的混合物10分鐘，隨后于室溫下振蕩過夜。然后三次各3分鐘各用3ml二氯甲烷洗滌樹脂，和三次各3分鐘各用3ml NMP依次洗滌樹脂。隨后將56mg的Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、41mg的HATU、14.6mg的HOAT和143μl對稱的三甲基吡啶的1ml NMP加入經(jīng)洗滌的樹脂中。將該溶液中的樹脂于室溫下振蕩5小時，每次用3ml的NMP洗滌3次各3分鐘，并將該樹脂再用56mg的Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、41mg的HATU、14.6mg的HOAT和143μl對稱的三甲基吡啶的1ml NMP溶液處理過夜。最后將樹脂用1ml二氯甲烷洗滌3次各3分鐘，并以真空油泵干燥。由此獲得的129mg用Fmoc-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺[加載0.366mmol/g；相當于30mg(0.047mmol)游離的Fmoc-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺]加載的FMPE樹脂，其直接用于下列反應(yīng)，無需去除中間產(chǎn)物。
B)將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量[用0.366mmol/g的Fmoc-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載，相當于30mg(0.047mmol)游離化合物]在5ml的NMP中溶脹10分鐘。然后用5ml新鮮制備的于NMP中的20％濃度(v/v)的哌啶溶液處理FMPE樹脂15分鐘，每次用5ml的NMP洗滌5次各3分鐘，最后將FMPE樹脂再用5ml新鮮制備的于NMP中的20％濃度(v/v)的哌啶溶液處理15分鐘。最后，每次用5mlNMP洗滌樹脂5次各3分鐘。所獲得的用D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂直接用于下列反應(yīng)中，無需分離中間產(chǎn)物。
C)將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量[假定用0.366mmol/g的D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于19.2mg(0.047mmol)游離化合物]每次用5ml NMP洗滌5次各3分鐘。隨后將57.4mg的Fmoc-Gln(Trt)-OH、12.7mg的HOBT×H2O和于2ml NMP中的30mgTBTU溶液加入經(jīng)加載的FMPE樹脂中。最后將46μl的DIPEA加入最終所得溶液，并將混合物振蕩45分鐘。只要每次用5ml NMP洗滌FMPE樹脂5次各3分鐘后，重復(fù)上述的偶合步驟。最后將其每次用5ml NMP再洗滌5次各3分鐘。獲得用Fmoc-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，將其直接用于下列反應(yīng)中，無需分離中間產(chǎn)物。
D)以上述步驟B)，將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量[假定用0.366mmol/g的Fmoc-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于47mg(0.047mmol)游離化合物]處理至去除Fmoc保護基團。獲得用Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，將其直接用于下列反應(yīng)中，無需分離中間產(chǎn)物。
E)將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量[假定用0.366mmol/g的Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于36.6mg(0.047mmol)游離化合物]每次用5ml NMP洗滌5次各3分鐘。隨后將36.4mg的Fmoc-Phe-OH、12.7mg的HOBT×H2O和于2ml NMP中的30mg TBTU溶液加入所述經(jīng)加載的FMPE樹脂中。最后將46μl的DIPEA加入所得溶液，并將混合物振蕩45分鐘。每次用5ml NMP洗滌FMPE樹脂5次各3分鐘后，重復(fù)上述的偶合步驟。最后將其每次用5ml NMP再洗滌5次各3分鐘。獲得用Fmoc-Phe-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，將其直接用于下列反應(yīng)中，無需分離中間產(chǎn)物。
F)以上述步驟B)，將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量[假定用0.366mmol/g的Fmoc-Phe-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于54mg(0.047mmol)游離化合物]處理至去除Fmoc保護基團。獲得用Phe-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，將其直接用于下列反應(yīng)中，無需分離中間產(chǎn)物。
G)將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量[假定用0.366mmol/g的Phe-Gln(Trt)-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于43.5mg(0.047mmol)游離化合物]每次用3ml二氯甲烷洗滌3次各10分鐘。隨后每次用2ml三氟乙酸(＝TFA)/三異丙硅烷(＝TIPS)/H2O(18∶1∶1v/v/v)的混合物處理3次各30分鐘，并從FMPE樹脂中濾去。然后再每次用3ml二氯甲烷洗滌3次各3分鐘，并從FMPE樹脂中濾去。合并的濾液用經(jīng)氮冷卻的接收器以真空水泵蒸發(fā)濃縮。殘余物吸收至DMSO中，并通過反相HPLC[來自Amersham PharmaciaBiotech kta Basic 100F的HPLC系統(tǒng)；泵系統(tǒng)P-900和檢測器UV-900；來自O(shè)mnicrom YMC的ODS-A的C18柱(250mm×20mm，10μm，流速8ml/min)；用乙腈(溶劑B)和0.1％(v/v)TFA中的水(溶劑A)線性梯度洗脫(30分鐘)]進行純化。冷凍干燥純化餾分，得到19.2mg無色粉末的標題化合物。
HPLC-MS(ESI)m/z 276.1(32)，308.1(90)，583.3(72)[m+H]+，605.4(100)[m+Na]+，893.6(13)，1165.2(10)[2m+H]+，1187.2(40)[2m+Na]+.
實施例2N1-苯乙基-(2R)-2-[(1S)-1-(芐基羧酰胺基)-乙基]-羧酰胺基-3-(1H-3-吲哚基)-丙酰胺 A)將100mg用Fmoc-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂[制備參見實施例1A]；加載0.345mmol/g；相當于22.3mg(0.035mmol)游離Fmoc-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺]以相應(yīng)于實施例1B的方法起反應(yīng)。將所得的經(jīng)樹脂結(jié)合的Trp(Boc)-苯乙基酰胺直接用于下列反應(yīng)中，無需分離或純化。
B)將上述獲得的用D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂總量[假定用0.354mmol/g的D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于14.4mg(0.035mmol)游離化合物]每次用5ml NMP洗滌5次各3分鐘。隨后將22mg的Fmoc-Ala-OH、9.5mg的HOBT×H2O和于2mlNMP中的22.5mg TBTU溶液加入經(jīng)加載的FMPE樹脂中。最后加入34μl的DIPEA，并將所得混合物振蕩45分鐘。每次用5ml NMP洗滌FMPE樹脂5次各3分鐘后，重復(fù)上述的偶合步驟。最后將其每次用5ml NMP再洗滌5次各3分鐘。獲得用Fmoc-Ala-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，該樹脂直接用于下列反應(yīng)，而無需分離。
C)將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量[假定用0.354mmol/g的Fmoc-Ala-D-Trp(Boc)-N-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于24.5mg(0.035mmol)游離化合物]以相應(yīng)于實施例1B的方法處理去除Fmoc保護基團。獲得用Ala-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，無需分離將其直接用于下列反應(yīng)中。
D)將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量[假定用0.354mmol/g的Ala-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于16.7mg(0.035mmol)游離化合物]每次用5ml NMP洗滌5次各3分鐘。隨后將9.6mg苯乙酸、9.5mg的HOBT×H2O和于2ml NMP中的22.5mgTBTU溶液加入經(jīng)加載的FMPE樹脂中。最后加入34μl的DIPEA，并將所產(chǎn)生的混合物振蕩45分鐘。每次用5ml NMP洗滌FMPE樹脂5次各3分鐘后，重復(fù)上述的偶合步驟。最后將其每次用5ml NMP再洗滌5次各3分鐘。獲得用苯基乙酸酯-Ala-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，無需分離將其直接用于下列反應(yīng)中。
E)將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量[假定用0.354mmol/g的苯基乙酸酯-Ala-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于20.9mg(0.035mmol)游離化合物]以相應(yīng)于實施例1G)的方法處理去除Fmoc樹脂和Boc保護基團。采用HPLC和隨后的冷凍干燥方法純化所獲得的粗產(chǎn)物，得到12.6mg(0.025mmol)無色粉末狀的標題化合物，熔點為205-207℃。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，300K)δ＝10.78(s，1H，NH-CH-C)，8.24(d，JHH＝6.8Hz，1H，NH-CH-CH3)，8.18(d，J＝8.4Hz，1H，NH-CH-CH2)，8.00(t，J＝5.5Hz，1H，NH-CH2-CH2)，7.57(d，J＝7.9Hz，1H，arom)，6.95-7.32(m，14H，arom)，4.38-4.43(m，1H，NH-CH-CH2)，4.21-4.25(m，1H，NH-CH-CH3)，3.45(s，2H，CO-CH2)，3.19-3.24(m，2H，NH-CH2-CH2)，3.11(dd，J＝14.7Hz，J＝4.6Hz，1H，NH-CH-CH2)，2.84(dd，J＝14.6Hz，J＝9.6Hz，1H，NH-CH-CH2)，2.61(t，J＝7.6Hz，2H，NH-CH2-CH2)，1.01(d，J＝7.0Hz，3H，CH3).
HPLC-MS(ESI)m/z 159.1(40)，291.2(35)，308.1(100)，497.2(80)[M+H]+，519.4(55)[M+Na]+，764.5(20)，993.1(10)[2M+H]+，1015.2(100)[2M+Na]+.
實施例3N1-苯乙基-(2R)-2-{1-[(4-氯芐基)-氨基]-乙基羧酰胺基}-3-(1H-3-吲哚基)-丙酰胺 A)在4小時內(nèi)，將8.35g 2-溴丙酸乙酯的18ml甲苯溶液攪拌并冷卻滴入7.08g 4-氯芐胺和5.06g三乙胺于38ml甲苯中的溶液，隨后將反應(yīng)混合物攪拌4天。然后用300ml水萃取有機相，并用Na2SO4干燥。以真空水泵蒸發(fā)溶劑，在壓力為1-1.2巴，采用急驟層析(flashchromatography)純化所獲得的殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相乙酸乙酯/己烷1∶1)。以真空水泵濃縮溶劑以及以真空油泵干燥殘余物后，得到4.25g黃色油狀的N-(4-氯芐基)-丙胺酸乙酯。
1H-NMR(250MHz，DMSO-d6，300K)δ＝7.31-7.38(m，4H，arom)，4.09(q，J＝7.1Hz，2H，CH2-CH3)，3.65(q，J＝13.9Hz，NH-CH2-C6H4Cl)，3.20-3.24(m，1H，NH-CH)，2.51(bs，1H，NH)，1.17-1.22(m，6H，CH2-CH3和CH-CH3).
B)將6.2ml的1N的NaOH和12ml甲醇加入1.0g上述獲得的N-(4-氯芐基)-丙胺酸乙酯中，并且攪拌混合物30分鐘。用1N的HCL中和并以真空水泵蒸發(fā)溶劑。將所獲得的殘余物置于15ml NaHCO3飽和水溶液和4ml二烷混合物中。將1.1g FmocCL的8ml二烷溶液在15分鐘內(nèi)滴入用冰冷卻的所得溶液中。將反應(yīng)混合物在冰冷卻下攪拌30分鐘，然后于室溫下過夜。隨后將20ml水加入反應(yīng)混合物中，分離含水相并用100ml二乙醚進行提取。通過加入濃鹽酸將含水相調(diào)節(jié)至pH1，并每次用100ml乙酸乙酯再提取3次。將合并的有機相用Na2SO4干燥，并以真空水泵蒸發(fā)溶劑。采用柱層析純化所獲得的殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相乙酸乙酯/己烷/乙酸1∶1∶1)。以真空水泵蒸發(fā)溶劑后，以真空油泵干燥殘余物，得到1.3g無色油狀的2-{4-氯芐基-[(9H-芴-9-基甲氧基)-羰基]-氨基}-丙酸(2.98mmol)。未測定順式/反式異構(gòu)體的比例。
HPLC-MS(ESI)m/z 179.1(95)，436.0(75)[M+H]+，458.2(40)[M+Na]+，893.0(50)[2M+Na]+，909.2(100)[2M+K]+.
C)將0.26g苯乙基胺、1.13g Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、0.43g HOBT和1.03g TBTU溶解至15ml DMF中。將1.19g DIPEA于5分鐘內(nèi)滴入該所得溶液。然后攪拌反應(yīng)混合物1小時，以真空水泵蒸發(fā)溶劑，并在壓力為1-1-2巴，采用急驟層析純化所獲得的殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相乙酸乙酯/己烷1∶1)。以真空水泵濃縮溶劑并以真空油泵干燥殘余物后，得到1.33g無色、蠟狀固體的N1-苯乙基-(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧基)-酰胺-3-[1-(叔丁氧基羰基)-3-吲哚基]-丙酰胺(＝Fmoc-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺)，熔點為140℃。
HPLC-MS(ESI)m/z 308.2(20)，530.3(40)，630.3(40)[M+H]+，652.4(10)[M+Na]+，1259.5(100)[2M+H]+，1281.5(30)[2M+Na]+.
D)將1.0g上述獲得的Fmoc-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺溶解在6ml的20％濃度(v/v)哌啶的DMF溶液中。將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，隨后用氮冷卻的接收器以真空水泵蒸除溶劑。在壓力為1-1.2巴，采用急驟層析從所得的Fmoc-哌啶混合物分離殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相乙酸乙酯/己烷2∶1)，然后進行洗脫(流動相三氯甲烷/甲醇15∶1)。以真空水泵濃縮溶劑并以真空油泵干燥殘余物后，得到0.63g黃色油狀的叔丁基-3-[(2R)-2-氨基-2-(苯乙基氨甲?；?-乙基]-1H-1-吲哚羧酸酯(＝D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺)。
MS(ESI)m/z 159.1(20)，291.2(75)，308.1(95)，352.1(70)，408.1(100)[M+H]+，430.1(35)[M+Na]+，815.2(15)[2M+H]+，837.1(20)[2M+Na]+.
E)將0.32g 2-{4-氯芐基-[(9H-芴-9-基甲氧基)-羰基]-氨基}-丙酸(0.736mmol，其制備參見上述步驟B))、0.30g叔丁基-3-[(2R)-2-氨基-2-(苯乙基氨甲?；?-乙基]-1H-1-吲哚羧酸酯(其制備參見上述步驟D)、0.42g HATU和0.15g HOAT溶解至7ml DMF中。然后10分鐘內(nèi)滴加1.33g的對稱的三甲基吡啶。將反應(yīng)混合物攪拌1小時，隨后在用氮冷卻的真空水泵中蒸發(fā)溶劑。在壓力為1-1.2巴，采用急驟層析純化殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相乙酸乙酯/己烷1∶1)。以真空水泵濃縮溶劑并以真空油泵干燥殘余物，得到0.54g無色泡沫狀的N1-苯乙基-(2R)-2-{1-[N-(4-氯芐基)-N-(9H-芴-9-基甲氧羰基)-氨基]-乙基羧酰胺基}-3-[1-(叔丁氧基羰基)-3-吲哚基]-丙酰胺。
MS(ESI)m/z 179.2(10)，769.4(10)，825.4(100)[m+H]+，1651.6(55)[2m+H]+.
F)將上述獲得的N1-苯乙基-(2R)-2-{1-[N-(4-氯芐基)-N-(9H-芴-9-基甲氧羰基)-氨基]-乙基羧酰胺基}-3-[1-(叔丁氧基羰基)-3-吲哚基]-丙酰胺總量(0.54g)(0.654mmol)溶解在2.5ml二氯甲烷中。將0.25ml三異丙基硅烷加入上述所得溶液，并將所產(chǎn)生的混合物冷卻至0℃。隨后于5分鐘內(nèi)將2.5ml TFA滴入混合物中，并在0℃攪拌混合物1小時。用氮冷卻的接收器以真空水泵蒸除溶劑。將殘余物置于20ml DMSO、2.5ml水和2.5ml乙酸的混合物中，并于室溫下攪拌過夜。隨后以真空水泵蒸發(fā)溶劑，并且將殘留的N1-苯乙基-(2R)-2-{1-[N-(4-氯芐基)-N-(9H-芴-9-基甲氧羰基)-氨基]-乙基羧酰胺基}-3-[1H-3-吲哚基]-丙酰胺直接用于下列反應(yīng)中，無需進一步純化或表征。
G)將上述獲得的Fmoc-保護的丙酰胺總量(0.654mmol，100％轉(zhuǎn)化率)溶解在10ml 20％濃度(v/v)哌啶的DMF溶液中，并且攪拌30分鐘。溶劑用氮冷卻的接收器以真空水泵蒸除，并在壓力為1-1.2巴，采用急驟層析純化所獲得的殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相乙酸乙酯)。冷凍干燥純化餾分后，得到320mg無色粉末狀的標題化合物(0.637mmol)，熔點為107-110℃。兩種異構(gòu)體相互的比例為1∶1.24。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，300K)δ＝10.85和10.83(s，1H，NH-CH-C)，9.2(m，1H，NH-CH-CH3)，8.72和8.77(d，J＝8.5Hz，1H，NH-CH-CH2)，8.28和8.34(t，J＝5.5Hz，1H，NH-CH2-CH2)，7.68和7.63(d，J＝7.7Hz，1H，arom)，6.98-7.48(m，13H，arom)，4.61-4.69(m，1H，NH-CH)，3.98-4.02(m，1H，NH-CH2-C6H4Cl)，3.75(m，1H，NH-CH-CH3)，3.60-3.67和3.39-3.43(m，1H，NH-CH2-C6H4Cl)，3.34-3.38(m，1H，NH-CH2-CH2)，3.24-3.29(m，1H，NH-CH2-CH2)，3.05-3.08(m，1H，NH-CH-CH2)，2.85-2.92(m，1H，NH-CH-CH2)，2.67-2.71(m，2H，NH-CH2-CH2)，1.33和1.10(d，J＝6.9Hz，3H，CH3).
HPLC-MS(ESI)m/z 291.2(30)，308.1(100)，503.2(35)[M+H]+，525.4(15)[M+Na]+，1027.1(20)[2M+Na]+.
實施例4N1-苯乙基-(2R)-2-{N’-[2-(3-吡啶基)-乙?；鵠-肼基}-羧酰胺基-3-(1H-3-吲哚基)-丙酰胺(181) A)將10.0g Boc-肼溶解在200ml干燥二氯甲烷和12.95ml的DIPEA(75.6mmol)中，并隨后將溶液冷卻至0℃。于30分鐘內(nèi)，將19.6gFmocCL的100ml干燥二氯甲烷溶液滴入上述所得溶液中。隨后反應(yīng)混合物于室溫下攪拌過夜。緊接著，用200ml水萃取有機相，并用Na2SO4干燥，以真空水泵濃縮至100ml體積。隨后用冰冷卻加入100ml三氟乙酸，并將混合物攪拌1.5小時。將300ml Na2CO3飽和水溶液加入混合物中，過濾混合物并用Na2SO4干燥所分離的有機相。以真空水泵蒸發(fā)溶劑，并以真空油泵干燥所獲得的殘余物，得到18.02g無色固體狀的N-[(9H-芴-9-基甲氧基)-羰基]-肼(70.8mmol)，熔點為150-153℃。
1H-NMR(250MHz，DMSO-d6，300K)δ＝10.10(bs，1H，NH)，9.60(bs，1H，NH)，7.89(d，J＝7.6Hz，2H，arom)，7.70(d，J＝7.3Hz，2H，arom)，7.30-7.45(m，4H，arom)，4.48(d，J＝6.6Hz，2H，CO-CH2)，4.27(t，J＝6.7Hz，1H，CO-CH2-CH).
B)將上述獲得的1.49gN-[(9H-芴-9-基甲氧基)-羰基]-肼懸浮液(5.78mmol)、60ml二氯甲烷和60ml飽和含水NaHCO3溶液于0℃劇烈攪拌5分鐘，然后在該溫度讓其靜置5分鐘。隨后采用將7.95ml1.89M碳酰氯的甲苯溶液加入底部有機相。一完成加入，就再次劇烈攪拌反應(yīng)混合物10分鐘。然后將20ml水和20ml的二氯甲烷加入反應(yīng)混合物，并且迅速分離相位。用50ml二氯甲烷萃取含水相，并在Na2SO4上干燥合并的有機相。以真空水泵蒸發(fā)溶劑以及以真空油泵干燥殘余物后，得到1.35g無色固體狀的5-(9H-芴-9-基甲氧基)-3H-[1，3，4]噁二唑-2-酮(4.82mmol)，熔點為125℃。
1H-NMR(250MHz，CDCl3，300K)δ＝8.72(bs，1H，NH)，7.77(d，J＝7.5Hz，2H，arom)，7.59(d，J＝7.4Hz，2H，arom)，7.28-7.45(m，4H，arom)，4.49(d，J＝7.8Hz，2H，CH2-CH)，4.32-4.41(m，1H，CH2-CH).
C)將100mg用Fmoc-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂(其制備參見實施例1A)；加載0.354mmol/g；相當于22.3mg(0.035mmol)游離的Fmoc-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺)在5ml NMP中溶脹10分鐘，隨后每次用5ml新鮮制備的NMP中20％濃度(v/v)的哌啶溶液處理2次，每次15分鐘。緊接著，每次用5ml NMP洗滌5次各3分鐘，并再每次用5ml二氯甲烷洗滌5次各3分鐘。隨后將樹脂在5ml干燥二氯甲烷中靜置30分鐘。經(jīng)過濾分離溶液后，將在1ml干燥二氯甲烷中的30.5mg上述步驟B)獲得的5-(9H-芴-9-基甲氧基)-3H-[1，3，4]噁二唑-2-酮加入用D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，并將混合物振蕩90分鐘。最后每次用5ml二氯甲烷洗滌3次各3分鐘，隨后再每次用5ml NMP洗滌5次各3分鐘。得到用Fmoc-肼-羰基-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，其直接用于下列反應(yīng)中，無需分離中間產(chǎn)物。
D)將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量(假定用0.354mmol/gFmoc-肼-羰基-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于24mg(0.035mmol)游離化合物)處理至如實施例1B)所述的去除Fmoc保護基。得到用肼-羰基-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，其直接用于下列反應(yīng)，無需去除或分離中間產(chǎn)物。
E)將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量(假定用0.354mmol肼-羰基-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于16.5mg(0.035mmol)游離化合物)每次用5ml NMP洗滌5次各3分鐘。隨后將12mg 3-吡啶乙酸(0.07mmol)、9.5mg HOBT×H2O(0.07mmol)和2ml NMP中的22.5mg的TBTU(0.07mmol)溶液加入經(jīng)加載的FMPE樹脂中。最后將34μl的DIPEA(0.2mmol)加入最終所得溶液，并將混合物振蕩45分鐘。每次用5ml NMP洗滌FMPE樹脂5次各3分鐘后，重復(fù)上述的偶合步驟。最后將其每次用5ml NMP再洗滌5次各3分鐘。得到用3-吡啶乙酸酯-肼-羰基-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺加載的FMPE樹脂，將其直接用于下列反應(yīng)中，無需分離中間產(chǎn)物。
F)將上述獲得的經(jīng)加載的FMPE樹脂總量(假定用0.354mmol/g的3-吡啶乙酸酯-肼-羰基-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺100％地反應(yīng)加載，相當于20.5mg(0.035mmol)游離化合物)處理至去除FMPE樹脂，并且除去如實施例1G)所述的Boc保護基團。HPLC純化和冷凍干燥后，得到4.5mg(0.0093mmol)無色粉末狀的標題化合物，熔點為116-120℃。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，300K)δ＝10.79(s，1H，NH)，9.89(s，1H，NH)，8.63(s，1H，arom)，8.61(d，J＝5.0Hz，1H，arom)，8.02-8.04(m，2H，NH和arom)，7.96(bs，1H，NH-CH2-CH2)，7.63(t，J＝5.5Hz，1H，arom)，7.51(d，J＝7.9Hz，1H，arom)，7.30(d，J＝8.2Hz，1H，arom)，7.25(t，J＝7.6Hz，2H，arom)，6.99-7.18(m，5H，arom)，6.95(t，J＝8.0Hz，1H，arom)，6.44(d，J＝8.1Hz，1H，NH-CH)，4.32-4.36(m，1H，NH-CH)，3.59(s，2H，CO-CH2-C5H4N)，3.22-3.26(m，1H，NH-CH2-CH2)，3.15-3.19(m，1H，NH-CH2-CH2)，3.01(dd，J＝14.4Hz，J＝5.6Hz，1H，NH-CH-CH2)，2.91(dd，J＝14.6Hz，J＝7.4Hz，1H，NH-CH-CH2)，2.58(t，J＝7.5Hz，2H，NH-CH2-CH2).
HPLC-MS(ESI)m/z 152.1(40)，185.2(30)，334.3(30)，485.3(100)[M+H]+，507.3(70)[M+Na]+，523.3(10)[M+Na]+，969.3(20)[2M+H]+，991.4(50)[2M+Na]+，1007.5(20)[2M+K]+.
實施例5N1-苯乙基-(2R)-2-[N’-(4-氯苯基)-肼基]-酰胺-3-(1H-3-吲哚基)-丙酰胺(185) A)室溫下，將2.12g4-氯苯甲醛的5mlTHF在10分鐘內(nèi)不斷攪拌滴入1.98g叔丁基肼基甲酸酯(Boc-肼)的15mlTHF溶液中。3小時后，以真空水泵蒸發(fā)溶劑，并在壓力為1-1.2巴，采用急驟層析純化所獲得的殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相乙酸乙酯/己烷1∶5)。以真空水泵蒸發(fā)溶劑并以真空油泵干燥殘余物后，得到3.64g無色固體狀的叔丁基N’-(4-氯苯基亞甲基)-肼-羧酸酯，熔點為170-171℃。
MS(EI)m/z 41.2(20)，57.2(100)，154.0(10)，181.0(5)，197.9(20)，253.9(5)[M]+.
B)用冰冷卻并在氬保護大氣下，將0.55gNaCNBH3加入25ml用干燥THF中的1.5g上述獲得的叔丁基N’-(4-氯苯基亞甲基)-肼-羧酸酯懸浮液中。將10ml乙酸在10分鐘滴入該混合物中。所得的清澈溶液于室溫下攪拌過夜。隨后加入60ml水和60ml乙酸乙酯并用NaHCO3調(diào)節(jié)含水相的pH值至8。分離有機相并用50ml飽和NaHCO3水溶液和50ml飽和普通鹽水溶液連續(xù)洗滌。在Na2SO4上干燥有機相并以真空水泵蒸發(fā)溶劑。將40ml甲醇和20ml1N的NaOH連續(xù)加入剩余的無色殘余物中，并將所得混合物首先于室溫下攪拌1小時，隨后加熱至沸點回流冷卻1小時。用二乙醚萃取于室溫下冷卻的混合物3次，將合并的醚相在Na2SO4上干燥，并且以真空水泵蒸發(fā)溶劑。在壓力為1-1.2巴，采用急驟層析純化剩余的黃色油(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相乙酸乙酯/己烷1∶4)。以真空水泵蒸發(fā)溶劑并以真空油泵干燥殘余物，得到1.05g無色固體狀的N-(叔丁氧基羰基)-N，-(4-氯芐基)肼，熔點為77-82℃。
1H-NMR(250MHz，DMSO-d6，300K)δ＝8.23(bs，1H，NH-CO)，7.35(m，4H，arom)，4.84(bs，1H，NH-CH2)，3.85(s，2H，NH-CH2)，1.37(s，9H，CH3).
C)將0.8g上述獲得的N-(叔丁氧基羰基)-N’-(4-氯芐基)肼用冰冷卻懸浮在4ml二烷和16ml的10％濃度NaHCO3水溶液的混合物中。隨后在10分鐘內(nèi)加入0.89g FmocCL于10ml二烷中的溶液，然后于室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。加入50ml的水，并每次用100ml的二乙醚萃取水相3次。合并所分離的有機相，在Na2SO4上干燥，并以真空水泵所產(chǎn)生的蒸發(fā)溶劑。在壓力為1-1.2巴，采用急驟層析純化殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相乙酸乙酯/己烷1∶2)。以真空水泵蒸發(fā)溶劑并以真空油泵干燥殘余物，得到1.37g無色固體狀的N-(4-氯芐基)-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)-羰基]-N’-(叔丁氧羰基)-肼，熔點為53-55℃。
1H-NMR(250MHz，DMSO-d6，300K)δ＝9.62(s，1H，NH)，7.89(d，J＝7.3Hz，2H，arom)，7.74(d，J＝6.7Hz，1H，arom)，7.56(m，1H，arom)，7.27-7.43(m，7H，arom)，6.99(m，1H，arom)，4.2-5.52(m，5H，N-CH2和CO-CH2-CH)，1.43(s，9H，CH3).
D)將0.1ml三異丙基硅烷加入0.30g上述步驟c)得到的N-(4-氯芐基)-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)-羰基]-N’-(叔丁氧羰基)-肼于2.5ml二氯甲烷的溶液中，并將混合物冷卻至0℃。隨后在5分鐘內(nèi)滴加2.5ml的TFA，然后攪拌溶液30分鐘。溶劑在氮冷卻下以真空水泵蒸發(fā)，再將殘余物置于77mg DMAP(0.63mmol)于10ml干燥二氯甲烷溶液中。該混合物在20分鐘內(nèi)攪拌滴入0.25g雙戊氟苯碳酸酯(0.63mmol)的20ml干燥二氯甲烷溶液中。加入完成后，將0.26g叔丁基-3-[(2R)-2-氨基-2-(苯乙基氨甲?；?-乙基]-1H-1-吲哚羧酸酯(其制備參見實施例3D)、77mgDMAP(0.63mmol)和10ml干燥二氯甲烷攪拌加入所得溶液。室溫上攪拌30分鐘后，以真空水泵蒸發(fā)溶劑并將殘余物吸收至4ml的二氯甲烷中。隨后加入0.1ml的三異丙基硅烷并將混合物冷卻至0℃。然后5分鐘內(nèi)滴加4ml TFA并攪拌混合物30分鐘。以在真空油泵除去溶劑，于室溫下將10ml的20％濃度(v/v)哌啶的DMF溶液30分鐘內(nèi)加入經(jīng)干燥的殘余物中。用氮冷卻的接收器以真空水泵蒸除溶劑，殘余物吸收至DMSO中，并將其通過反相HPLC純化(HPLC系統(tǒng)AmershamPharmacia Biotech Akta Basic 100F，泵系統(tǒng)P-900和檢測器UV-900；來自O(shè)mnicrom YMC的ODS-A的C18柱(250mm×20mm，10μm，流速8ml/min)；用乙腈(溶劑B)和0.1％(v/v)TFA中的水(溶劑A)線性梯度洗脫(30分鐘)]進行純化。冷凍干燥純化餾分，得到26.8mg無色粉末狀的標題化合物，熔點為75-80℃。
1H-NMR(500MHz，ACN-d3，300K)δ＝9.74(bs，1H，NH)，7.91(d，J＝7.7Hz，1H，arom)，7.98(d，J＝8.1Hz，1H，arom)，7.58-7.83(m，12H，arom)，6.99(bs，1H，NH-CH)，6.89(bs，1H，NH-CH2-CH2)，4.87(q，J＝6.9Hz，NH-CH)，4.34(bs，2H，NH-CH2-C6H4Cl)，3.87-3.94(m，1H，NH-CH2-CH2)，3.76-3.82(m，1H，NH-CH2-CH2)，3.66(d，J＝6.2Hz，2H，NH-CH-CH2)，3.17(t，J＝7.3Hz，2H，NH-CH2-CH2).
HPLC-MS(ESI)m/z 490.1(70)[M+H]+，512.3(50)[m+Na]+，754.8(100)，978.9(25)[2M+H]+，1001.0(90)[2M+Na]+，1063.1(20).
實施例6N1-苯乙基-(2R)-2-[N’-(呋喃-2-基亞甲基)-肼基]-羧酰胺-3-(1H-3-吲哚基)-丙酰胺(189) A)將500mg叔丁基-3-[(2R)-2-氨基-2-(苯乙基氨甲?；?-乙基]-1H-1-吲哚羧酸酯(其制備參見實施例3D))和515mg新鮮制備的5-(9H-芴-9-基甲氧基)-3H-[1，3，4]噁二唑-2-酮(其制備參見實施例4B))溶解在20ml干燥DMF中，并于室溫下攪拌75分鐘。用氮冷卻的接收器以真空水泵蒸除溶劑，并采用柱層析純化殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相三氯甲烷/甲醇20∶1)。再以真空水泵蒸發(fā)溶劑并以真空油泵干燥殘余物，得到0.58g無色固體狀的N1-苯乙基-(2R)-2-{[N’-(9H-芴-9-基甲氧基)-羰基]-肼基}-酰胺-3-[(1-叔丁氧羰基)-3-吲哚基]-丙酰胺(＝Fmoc-肼-羰基-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺)，熔點為135-137℃。
HPLC-MS(ESI)m/z 179.2(10)，334.3(10)，378.2(10)，588.4(10)，632.3(25)，654.4(35)，688.3(80)[M+H]+，710.4(100)[M+Na]+，1375.5(40)[2M+H]+，1397.5(25)[2M+Na]+.
B)將179mg如上獲得的Fmoc-肼-羰基-D-Trp(Boc)-苯乙基酰胺溶解在2ml 20％濃度(v/v)吡啶的DMF溶液中，并于室溫下攪拌30分鐘。隨后用氮冷卻的接收器以真空水泵蒸除溶劑，并將殘余物吸收至10mlTHF中。將25mg呋喃-2-甲醛加入該接收溶液并于室溫下攪拌混合物24小時。隨后再加入50mg的呋喃-2-甲醛并再攪拌混合物24小時。以真空水泵蒸發(fā)溶劑，并在壓力為1-1.2巴，采用急驟層析純化殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相乙酸乙酯/己烷1∶1)。以真空水泵濃縮溶劑并于真空油泵中干燥殘余物后，得到100mg無色結(jié)晶固體狀的N1-苯乙基-(2R)-2-[N’-(呋喃-2-基亞甲基)-肼基]-酰胺-3-[(1-叔丁氧羰基)-3-吲哚基]-丙酰胺。
MS(ESI)m/z 510.3(15)，544.3(55)[M+H]+，566.3(50)[M+Na]+，835.2(25)[(3M+K+H)/2]2+，1087.4(45)[2M+H]+，1109.5(100)[2M+Na]+，1630.3(5)[3M+H]+，1652.2(20)[3M+Na]+.
C)將100mg如上獲得的N1-苯乙基-(2R)-2-[N’-(呋喃-2-基亞甲基)-肼基]-酰胺-3-[(1-叔丁氧羰基)-3-吲哚基]-丙酰胺溶解在3ml二氯甲烷中。向其加入0.1ml三異丙基硅烷并且隨后冷卻混合物至0℃。然后5分鐘內(nèi)滴加3ml TFA并將反應(yīng)混合物攪拌1小時。隨后以真空水泵蒸發(fā)溶劑，殘余物吸收至8ml DMSO、1ml水和1ml乙酸的混合物中，并于室溫下攪拌過夜。然后用氮冷卻的接收器以真空水泵蒸除溶劑至干燥，并將殘余物吸收至DMSO中。反相HPLC[HPLC系統(tǒng)，AmershamPharmacia Biotech kta Basic 100F；泵系統(tǒng)P-900和檢測器UV-900；來自O(shè)mnicrom YMC的ODS-AC18柱(250mm×20mm，10μm，流速8ml/min)；用乙腈(溶劑B)和0.1％(v/v)TFA中的水(溶劑A)線性梯度洗脫(30分鐘)；并冷凍干燥純化餾分得到46mg無色粉末狀的標題化合物，熔點為100-101℃。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，300K)δ＝10.82(s，1H，NH-CH-C)，10.41(s，1H，N-NH)，8.09(t，J＝5.5Hz，1H，NH-CH2)，7.75(s，1H，arom)，7.73(s，1H，arom)，7.55(d，J＝7.9Hz，1H，arom)，7.30(d，J＝8.1Hz，1H，arom)，7.23-7.26(m，2H，arom)，7.14-7.17(m，3H，arom)，7.07(s，1H，arom)，7.03(t，J＝7.4Hz，1H，arom)，6.93(t，J＝7.5Hz，1H，arom)，6.74(d，J＝3.2Hz，1H，arom)，6.58-6.60(m，2H，NH-CH-CH2和arom)，4.45(q，J＝6.8Hz，1H，NH-CH)，3.24-3.31(m，1H，NH-CH2)，3.17-3.24(m，1H，NH-CH2)，3.02-3.10(m，2H，NH-CH-CH2)，2.62(t，J＝7.4Hz，2H，NH-CH2-CH2).
HPLC-Ms(ESI)m/z 444.2(30)[M+H]+，466.3(65)[M+Na]+，685.1(90)，909.2(100)[2M+Na]+，1352.1(15)[3M+Na]+.
實施例7N1-苯乙基-(2R)-2-[(4-苯基哌啶基)-甲基]-酰胺-3-(1H-3-吲哚基]-丙酰胺 A)將3.0g 4-芐基哌啶和1.73g三乙胺攪拌和冰冷滴入13ml甲苯中。將2.86g溴乙酸乙酯的6.2ml甲苯溶液4小時內(nèi)滴入該所得溶液中。隨后于室溫下攪拌該反應(yīng)混合物4填。然后用100ml水萃取有機相并隨后用Na2SO4干燥。以真空水泵濃縮溶劑以及以真空油泵干燥殘余物。得到4.02g無色油狀的(4-苯基-哌啶-1-基)乙酸乙酯。
HPLC-MS(ESI)m/z 188.2(100)，234.2(45)，262.2(100)[M+H]+.
B)將1.0g如上所得的(4-苯基-哌啶-1-基)乙酸乙酯加入含有5.755ml的1N含水NaOH和11.5ml甲醇的接收溶液中。于室溫下攪拌過夜，然后用濃鹽酸中和，并以真空水泵蒸發(fā)溶劑。在壓力為1-1.2巴，采用急驟層析純化殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相甲醇/三氯甲烷1∶1)。以真空水泵濃縮溶劑并于真空油泵中干燥殘余物后，得到0.89g無色固體狀的(4-苯基-哌啶-1-基)乙酸，熔點為250-252℃。
GC-MS(EI)m/z 44.1(10)，91.1(15)，188.1(100)，233.0(5)[M]+.
C)將86mg上述步驟B)所得的(4-苯基-哌啶-1-基)乙酸、150mg叔丁基-3-[(2R)-2-氨基-2-(苯乙基氨甲酰基)乙基]-1H-1-吲哚羧酸酯(制備參見實施例3D))、75mg HOBT和177mg TBTU溶解在2.6ml的DMF中。將0.20gDIPEA5分鐘內(nèi)滴入該所得溶液中。隨后攪拌反應(yīng)混合物23小時，用氮冷卻的接收器以真空水泵蒸除溶劑，并在壓力為1-1.2巴，采用急驟層析純化殘余物(固定相硅膠60，粒度0.040-0.063mm，流動相三氯甲烷/甲醇10∶1)。得到180mg黃色油狀的N1-苯乙基(2R)-2-[(-苯基哌啶基)-甲基]-酰胺-3-[1-(叔丁氧羰基)-3-吲哚基]-丙酰胺。
HPLC-MS(ESI)m/z 188.1(20)，567.3(70)，623.3(100)[M+H]+，645.2(25)[M+Na]+，1245.2(10)[2M+H]+，1267.3(40)[2M+Na]+.
D)將180mg如上所得的N1-苯乙基(2R)-2-[(-苯基哌啶基)-甲基]-酰胺-3-[1-(叔丁氧羰基)-3-吲哚基]-丙酰胺溶解在3ml二氯甲烷中。向其中加入0.1ml三異丙基硅烷并將溶液冷卻至0℃。隨后將3ml TFA5分鐘內(nèi)滴入溶液并攪拌反應(yīng)混合物1小時。然后用氮冷卻的接收器以真空水泵蒸除溶劑。殘余物吸收至8ml DMSO、1ml水和1ml乙酸的混合物中并且攪拌過夜。用氮冷卻的接收器以真空水泵蒸除溶劑至干燥。殘余物吸收至DMSO中，并且采用反相HPLC純化[來自AmershamPharmacia Biotech kta Basic 100F的HPLC系統(tǒng)；泵系統(tǒng)P-900和檢測器UV-900；來自O(shè)mnicrom YMC的ODS-A C18柱(250mm×30mm，10μm，流速25ml/min)；用乙腈(溶劑B)和0.1％(v/v)TFA中的水(溶劑A)線性梯度洗脫(30分鐘)]。冷凍干燥純化的餾分，得到109mg無色粉末狀的標題化合物，熔點為73-75℃。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，300K)δ＝10.84(s，1H，NH-CH-C)，8.81(d，J＝8.3Hz，1H，NH-CH)，8.25(t，J＝5.2Hz，NH-CH2-CH2)，7.61(d，J＝7.7Hz，1H，arom)，7.07-7.33(m，12H，arom)，7.02(t，J＝7.3Hz，1H，arom)，6.96(t，J＝6.9Hz，1H，arom)，4.60(q，J＝6.9Hz，1H，NH-CH)，3.81(d，J＝15.2Hz，1H，N-CH2-CO)，3.67(d，J＝13.1Hz，1H，N-CH2-CO)，3.21-3.34(m，3H，NH-CH2-CH2和N-CH2-CH2-CH)，3.06(dd，J＝14.4Hz，J＝4.9Hz，1H，NH-CH-CH2)，2.97-2.93(m，3H，NH-CH-CH2和N-CH2-CH2-CH)，2.59-2.67(m，3H，NH-CH2-CH2和N-CH2-CH2-CH)，2.46-2.48(m，2H，CH-CH2-C6H5)，1.57-1.70(m，3H，N-CH2-CH2-CH和CH)，1.32-1.46(m，2H，NCH2-CH2-CH).
HPLC-MS(ESI)m/z 188.1(70)，523.3(100)[M+H]+，803.7(20)，1045.1(20)[2M+H]+，1067.3(40)[2M+Na]+.
下列表2中的式I化合物也可根據(jù)上述制備方法或類似上述制備方法加以制備。表2含有下列縮寫bo鍵dm二氧戊環(huán)基甲基Ind吲哚基Phe苯基Py吡啶基rac外消旋THI四氫異喹啉基表2式I的其它化合物
實施例I包含N1-苯乙基-(2R)-2-{1-[(4-氯苯基)-氨基]-乙基羧酰胺}-3-(1H-3-吲哚基)-丙酰胺的膠囊制備每個膠囊含有下列組合物的膠囊N1-苯乙基-(2R)-2-{1-[(4-氯苯基)-氨基]-乙基羧酰胺}-3-(1H-3-吲哚基]-丙酰胺 20mg玉米淀粉 60mg乳糖 300mg乙酸乙酯 q.s.
采用乙酸乙酯將活性物質(zhì)、玉米淀粉、乳糖加工成均一糊狀的混合物。攤開該糊料，并將所產(chǎn)生的顆粒置于適合的盤中，并且在45℃干燥以除去溶劑。將干燥顆粒通過軋碎機，并再用如下助劑混合滑石 5mg硬脂酸鎂 5mg玉米淀粉 9mg隨后將其注入400mg的膠囊中(＝膠囊大小0)。
權(quán)利要求
1.通式I化合物， 其中A1為CH或，當A2不代表鍵并同時A3不代表NH，也表示氮，A2為鍵、C1-2-亞烷基或，當A1為CH以及R2為氫，也表示羰基，A3為未取代或經(jīng)C1-4-烷基或C1-4-烷基羰基酰胺取代的亞甲基或，當R2為氫或與R1一并為鍵，也表示NH，R1為氫或，當A2代表羰基，也表示氨基，和R2為氫，或R1和R2一并為C1-2-亞烷基或，當A2為鍵，R1和R2可一并為鍵。R3為氫或甲基，Ar1為未取代或經(jīng)鹵素或C1-4-烷基取代1至2次或由鍵合在兩個相鄰環(huán)碳原子上的C1-2-亞烷基二氧基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吲哚基或四氫異喹啉基，Ar2為呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、吡咯基或吲哚基，Ar3為未取代或經(jīng)鹵素取代1至2次的苯基或吡啶基，m為0或1和n為0或1，以及任選的其生理相容的酸加成鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的式I化合物，其中n為1并且R3為氫。
3.根據(jù)任一個上述權(quán)利要求的式I化合物，其中Ar2為吲哚基或苯并噻吩基。
4.通式Ia化合物， 其中R101為氫或氨基，R4為氫、C1-4-烷基或C1-4-烷基羰基酰胺，Ar1為未取代或經(jīng)鹵素或C1-4-烷基取代1至2次或由鍵合在兩個相鄰環(huán)碳原子上的C1-2-亞烷基二氧基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吲哚基或四氫異喹啉基，Ar201為苯并噻吩基或吲哚基以及m為0或1以及任選的其生理相容的酸加成鹽。
5.通式Ib化合物， 其中R4為氫、C1-4-烷基或C1-4-烷基羰基酰胺，Ar1為未取代或經(jīng)鹵素或C1-4-烷基取代1至2次或由鍵合在兩個相鄰環(huán)碳原子上的C1-2-亞烷基二氧基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吲哚基或四氫異喹啉基，Ar201為苯并噻吩基或吲哚基以及m為0或1以及任選的其生理相容的酸加成鹽。
6.通式Ic化合物， 其中Ar1為未取代或經(jīng)鹵素或C1-4-烷基取代1至2次或由鍵合在兩個相鄰環(huán)碳原子上的C1-2-亞烷基二氧基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吲哚基或四氫異喹啉基，Ar201為苯并噻吩基或吲哚基以及m為0或1以及任選的其生理相容的酸加成鹽。
7.通式Id化合物， 其中Ar1為未取代或經(jīng)鹵素或C1-4-烷基取代1至2次或由鍵合在兩個相鄰環(huán)碳原子上的C1-2-亞烷基二氧基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吲哚基或四氫異喹啉基，Ar201為苯并噻吩基或吲哚基以及m為0或1以及任選的其生理相容的酸加成鹽。
8.通式Ie化合物， 其中Ar1為未取代或經(jīng)鹵素或C1-4-烷基取代1至2次或由鍵合在兩個相鄰環(huán)碳原子上的C1-2-亞烷基二氧基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吲哚基或四氫異喹啉基，Ar201為苯并噻吩基或吲哚基以及m為0或1以及任選的其生理相容的酸加成鹽。
9.通式If化合物， 其中A1為CH或氮，Ar1為未取代或經(jīng)鹵素或C1-4-烷基取代1至2次或由鍵合在兩個相鄰環(huán)碳原子上的C1-2-亞烷基二氧基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吲哚基或四氫異喹啉基，Ar201為苯并噻吩基或吲哚基以及m為0或1以及任選的其生理相容的酸加成鹽。
10.權(quán)利要求1的式I化合物作為藥物的應(yīng)用。
11.一種藥物，其特征在于包含藥理學(xué)有效量的權(quán)利要求1的式I化合物以及其它常規(guī)藥物助劑和/或賦形劑。
12.將權(quán)利要求1的式I化合物用于制備治療和/預(yù)防肥胖、糖尿病、血胰島素過多、心血管病、進食失調(diào)和/或綜合癥X藥物的應(yīng)用。
13.一種用于制備通式I化合物的方法， 其中A1為CH或，當A2不代表鍵以及同時A3不代表NH，也表示氮，A2為鍵、C1-2-亞烷基或，當A1為CH以及R2為氫，也表示羰基，A3為未經(jīng)取代或經(jīng)C1-4-烷基或C1-4-烷基羰基酰胺取代的亞甲基或，當R2為氫或與R1一并為鍵，也表示NH，R1為氫或，當A2代表羰基，也表示氨基，和R2為氫，或R1和R2一并為C1-2-亞烷基或，當A2為鍵，R1和R2可一并為鍵。R3為氫或甲基，Ar1為未經(jīng)取代或經(jīng)鹵素或C1-4-烷基取代1至2次或由鍵合至兩個相鄰環(huán)碳原子的C1-2-亞烷基二氧基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吲哚基或四氫異喹啉基，Ar2為呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、吡咯基或吲哚基，Ar3為未經(jīng)取代或經(jīng)鹵素取代1至2次的苯基或吡啶基，m為0或1和n為0或1，以及任選的其生理相容的酸加成鹽，特征在于包括a)制備通式Ig化合物 其中A3、R3、Ar1、Ar2、Ar3、m和n如上定義，R101為氫或氨基，通式II化合物， 其中m如上定義，Ar110如上述Ar1所定義的，任何反應(yīng)基團受到保護基團的保護，以及R111如上述R101所定義的，任何氨基受到保護基團的保護，與通式III化合物進行反應(yīng)， 其中R3、Ar3和n如上定義，Ar210如上述Ar2所定義的，任何反應(yīng)基團受到保護基團的保護，以及A310如上述A3所定義的，任何反應(yīng)氮原子受到保護基團的保護，或b)制備通式Ih化合物 其中A1、A2、R1、R2、R3、Ar1、Ar2、Ar3、m和n如上定義，A301如上述A3所定義的(除NH之外)，通式IV化合物， 其中A1、A2、Ar110和m如上定義，A311如上述A301所定義，任何反應(yīng)氮原子受到保護基團的保護，R110如上述R1所定義的，任何氨基受到保護基團的保護，以及R201如上述R2所定義的(除氫之外)，或表示氨基保護基團，與通式V化合物進行反應(yīng)， 其中R3、Ar210、Ar3和n如上定義，或c)制備通式Ii化合物 其中A1、R3、Ar1、Ar2、Ar3、m和n如上定義，以及A201如上述A2所定義的(除羰基之外)，式V化合物與具羰基合成等價物的式V化合物和通式VI化合物反應(yīng)， 其中A1、A201、Ar110和m如上定義，R104為氫或，當A1為氮，也表示氮保護基團，以及SG為適用于肽化學(xué)的保護基團，或d)制備通式Ij化合物 其中A310、R3、Ar1、Ar2、Ar3、m和n如上定義，式III化合物與通式VIII化合物反應(yīng)，Ar110-(CH2)m-CHOVIII其中Ar110和m如上定義，并且隨后再去除任何保護基團，視需要將所產(chǎn)生的的式I化合物轉(zhuǎn)變成其酸加成鹽，或?qū)⑺峒映甥}轉(zhuǎn)變成游離的式I化合物。
全文摘要
新的、選擇性BRS－3激動性的通式I化合物，其中A
文檔編號A61K31/4439GK1649840SQ03810076
公開日2005年8月3日 申請日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月5日
發(fā)明者D·韋伯, H·凱斯勒, C·貝格爾, J·安特爾, T·海因里希 申請人:索爾瓦藥物有限公司