專利名稱：一種綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1及其編碼序列的基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種綠臭蛙抗菌肽及編碼序列的基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著青霉素等傳統(tǒng)抗生素的大規(guī)模和不恰當(dāng)使用，微生物對傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生了越來越強(qiáng)的耐受性，在臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了大量能夠完全耐受青霉素等傳統(tǒng)抗生素的微生物，已有的抗生素對這些病原微生物無能為力?？咕氖且环N新型的抗微生物多肽，大多數(shù)抗菌肽分子量小于10000 Da，帶正電，富含疏水堿基，能夠形成兩親性的結(jié)構(gòu)?？咕牡臍⒕鷻C(jī)制主要是通過靜電相互作用吸引并結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，進(jìn)一步在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜的孔洞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。而傳統(tǒng)抗生素主要是作用于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的一些酶類。正是由于作用方式的不同，抗菌肽介導(dǎo)的殺菌作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)抗生素，并且不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐受性。除此之外，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道表明抗菌肽還具有其他的殺 菌機(jī)制，如抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、改變細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成等。兩棲動物皮膚抗菌肽具有高效、廣譜、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。這使其在耐抗生素病原菌株大量涌現(xiàn)的今天有望成為新一代的臨床抗菌藥物?？咕目梢宰R別革蘭氏陰性菌脂多糖、革蘭氏陽性菌胞壁酸和細(xì)菌未甲基化CpG DNA等細(xì)菌信號分子，并因?yàn)槠涮厥獾陌被峤Y(jié)構(gòu)、兩親性、陽離子特性及小分子特征等，可以較為容易粘附磷脂雙分子層，并以“桶-板模式”、“覆毯模式”、“膠束模式”等方式插入細(xì)菌的細(xì)胞膜，從而在細(xì)胞膜上形成穿膜孔道，引起胞內(nèi)物質(zhì)外漏，最終導(dǎo)致菌體的死亡。研究表明，兩棲類皮膚抗菌肽odorranain-H家族對金黃色葡萄球菌等細(xì)菌有一定得抑制效果,可通過多種不同的機(jī)制發(fā)揮作用，如有的在細(xì)菌內(nèi)形成片層樣的囊泡狀結(jié)構(gòu)，有些可能導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)壁的分離，有些在細(xì)菌的膜上形成穿孔，有些則導(dǎo)致了細(xì)菌染色質(zhì)的固縮。因此，在醫(yī)藥領(lǐng)域和食品防腐具有一定的開發(fā)前景。兩棲類動物作為水生和陸生動物的中間類群，其生活環(huán)境惡劣，容易滋生各種病原微生物。為了避免微生物感染，兩棲類動物進(jìn)化出強(qiáng)大的先天免疫系統(tǒng)，用以抵抗病原微生物的侵襲。其中抗菌肽是兩棲類動物先天免疫系統(tǒng)中的重要組分，在兩棲類動物抵御外界微生物侵襲過程中發(fā)揮了重要的作用。到目前為止，已從各種兩棲類動物中發(fā)現(xiàn)大量抗菌肽，這些抗菌肽具有不同的結(jié)構(gòu)和抗菌活性，是新型多肽類抗微生物藥物開發(fā)的優(yōu)良模板庫。目前，國外對多種兩棲類抗菌肽進(jìn)行了研究開發(fā)，已有多種進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。如來源于非洲爪蟾抗菌肽magainin的改造體MS1-78對糖尿病患者的足部潰瘍有顯著療效且副作用小，已進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)階段。綠臭娃iRana margaratae)屬于兩棲綱無尾目娃科臭娃屬。目前關(guān)于綠臭娃形態(tài)、發(fā)育和分子進(jìn)化已有報(bào)道，但是關(guān)于綠臭蛙抗菌肽的研究還沒有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)要求
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述蛋白的編碼序列。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述蛋白在制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl,它是具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；該綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OMl為環(huán)狀多肽，含有21個氨基酸殘基，分子量為2044.58 Da，等電點(diǎn)為 8.90。綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基因,它是下列核苷酸之一:
(1)序列表中SEQID NO:1所不的核昔酸序列；
(2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸；
(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl在制備抗微生物藥物中的應(yīng)用。有益效果
本發(fā)明克隆得到綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基因，并利用化學(xué)合成的方法合成了 odorranain-H-OMl。該抗菌肽分子量小,對奇異變形桿菌、屎腸球菌和耐氨節(jié)青霉素大腸桿菌、光滑念珠菌具有強(qiáng)的殺滅作用。此外還具有低的溶血活性。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施例1:綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl基因克隆。I)綠臭蛙皮膚總 RNA提取:
①取300 mg綠臭蛙皮膚組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到EP管中，加入Iml總RNA提取緩沖液(Trizol，美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，充分混勻，而后于4°C，12000rpm 離心 10 min。②離心取上清，加入0.2 ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C，12000 rpm離心10分鐘，棄除沉淀。③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000 rpm離心10分鐘，收集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為綠臭蛙皮膚總RNA。
2)綠臭蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建:采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit。(l)cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄):
①經(jīng)DEPC處理(DEPC處理是在含0.1% (V/V) DEPC的水浸泡過夜，高壓滅菌，烘干)的離心管中加入I Ul綠臭娃皮膚總RNA、1 V-1 3’端一鏈合成引物(3’In-Fusion SMARTerCDS Primer)和2.5 yl經(jīng)DEPC處理(DEPC處理是將含0.1%(V/V) DEPC的水，放置過夜，高壓滅菌)的水使總體積達(dá)到4.5 Ul，混勻后短暫離心(2000 rpm, 30 S)，離心后于72°C保溫3分鐘；保溫后再將離心管在42°C孵育2分鐘。②在上述離心管中加入以下試劑(均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)，2.0 u I 5 X第一鏈緩沖液、0.25 u I 100 mM DTT、1.0 u I 10 mM dNTP Mix、1.0 u I SMARTer
VOligonucleotide、。.25 U I RNase Inhibitor 和 1.0 U I SMARTScribe ReverseTranscriptase反轉(zhuǎn)錄酶,混合離心管中試劑并短暫離心(2000 rpm, 30 s),在42°C保溫90 min，然后68°C保溫10 min。保溫處理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2 ill所合成的cDNA第一鏈備用。(2)采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD- PCR)方法擴(kuò)增第二鏈(所用試劑均為CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)
①將 2 u I cDNA 第一鏈(mRNA 反轉(zhuǎn)錄)、80 U I 去離子水、10 U I IOXAdvantage 2PCR 緩沖液、2 u I 50XdNTP 混合物、2 U I 5’PCR 引物、2 u I CDS ni/3，PCR 引物以
及 2 U I 50 XAdvantage 2 Polymerase Mix 在 95°C預(yù)熱的 PCR 管中進(jìn)行混合。②在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增:`
95°C, I min ;18 個循環(huán):95°C，15 sec, 65°C, 30 sec, 68°C, 6 min。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈一 80°C保存。(3)綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl基因克隆篩選:
根據(jù)蛙科抗菌肽信號肽區(qū)保守序列設(shè)計(jì)正向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其序列為5’ -CCAAAGATGITCACCTTGAAG-3’，PCR 另一擴(kuò)增引物為 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3，-PCR 引物，其序列為S’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-S'PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行:94 °C 4 min,94 °C 30 sec,57°C 30 sec和72 V I min，30個循環(huán)。擴(kuò)增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進(jìn)行目的片段回收。將回收的目的片段連接到PMD19-T載體(Takara，大連)，轉(zhuǎn)化進(jìn)CaCl2-MgCl2法制備好的DH5ci感受態(tài)細(xì)胞。涂板并進(jìn)行氨芐青霉素和藍(lán)白斑雙重篩選，挑取單菌落用M13引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌落,搖菌提取質(zhì)粒,使用Applied BiosystemsDNA sequencer, model ABI PRISM 377 進(jìn)行核苷酸測序。測定結(jié)果:
編碼綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl前體的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No:1所示。綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OMl基因核苷酸的序列表為:序列長度為317個堿基，序列類型:核酸，鏈數(shù):單鏈，拓?fù)鋵W(xué):直鏈狀，序列種類:cDNA，來源:綠臭蛙皮膚。實(shí)施例2:綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的化學(xué)合成。1、綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OMl的化學(xué)合成方法:根據(jù)基因推導(dǎo)的成熟肽氨基酸序列，用自動多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,通過HPLC反相柱層析脫鹽。I1、分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F)。II1、純化的綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OMl用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl是綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl基因編碼的一種環(huán)狀多肽，含有二i 個氨基酸殘基，分子量2044.58Da,等電點(diǎn)8.90。綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl全序列如SEQ ID No:2所示。實(shí)施例3:綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl藥理實(shí)驗(yàn):
1、綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl抗菌活性檢測:
分別挑取保存于斜面上的試驗(yàn)菌株(奇異變形桿菌、屎腸球菌、耐氨芐青霉素大腸桿菌和耐氨芐青霉素光滑念珠菌)均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)平板上，將經(jīng)過滅菌的0.5 cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加溶解于滅菌去離子水的2mg/ml的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl樣品溶液10 Ml,于37°C倒置培養(yǎng)18 — 20小時，觀察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會在濾紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明樣品抗菌活性越強(qiáng)。2、綠臭娃抗菌肽 O dorr ana i n-H-0M I 最小抑菌濃度(Minimum InhibitoryConcentration)測定:
試驗(yàn)菌株(奇異變形桿菌、屎腸球菌、耐氨芐青霉素大腸桿菌和耐氨芐青霉素光滑念珠菌)接種到LB液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)中，37°C振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長期，而后用新鮮LB液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的培養(yǎng)液稀釋到2 X IO5 cfu/ml待用。取1.9 mL上述稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)液,加入經(jīng)0.22 ii m孔徑膜過濾的2 mg/ml的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl樣品溶液0.1 mL作為第一管，第一管混勻后取出I mL加入第2管中，依次倍比稀釋(參見表1)， 自第9管吸出I mL棄去，第10管系對照管。表I稀釋方法
權(quán)利要求
1.一種綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl,其特征在于:它是具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ IDNO:2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl,其特征在于:所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；該綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl為環(huán)狀多肽，含有21個氨基酸殘基，分子量為2044.58 Da，等電點(diǎn)為 8.90。
3.—種如權(quán)利要求1所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基因,其特征在于:它是下列核苷酸之一: (1)序列表中SEQID NO:I所不的核昔酸序列； (2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸； (3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基因,其特征在于:綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl的編碼基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.—種如權(quán) 利要求1所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OMl在制備抗微生物藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1，它是具有序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQIDNO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQIDNO2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQIDNO2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明克隆得到綠臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的編碼基因，并利用化學(xué)合成的方法合成了odorranain-H-OM1。該抗菌肽分子量小，對奇異變形桿菌、屎腸球菌和耐氨芐青霉素大腸桿菌、光滑念珠菌具有強(qiáng)的殺滅作用。此外還具有低的溶血活性。
文檔編號A61K38/17GK103172723SQ20131013131
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者周江, 凌桂英, 高久香, 李莉, 王義鵬 申請人:貴州師范大學(xué)