專利名稱：一種激活魚類脂代謝調(diào)控基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種激活魚類脂代謝調(diào)控基因表達(dá) 的誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
xLM, it ^ M W ±1 M ^ # 舌 ^ #(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)是一類能被內(nèi)源性脂肪酸以及外源性過氧化物酶體增殖物(peroxisome proliferator, PP)作為配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬II型核受體超家族成員。PPAR還因能 被內(nèi)源性脂肪酸及其代謝產(chǎn)物激活而稱為脂肪酸受體(fatty acid receptor)。在多種動 物體內(nèi)都存在三類PPARs受體，即PPAR α，PPAR β亦稱PPAR δ及PPAR γ，這三種亞型均有 特異性，能產(chǎn)生不同的生物學(xué)作用。PPAR能夠調(diào)控許多參與細(xì)胞內(nèi)外脂類代謝的目的基因 表達(dá)，尤其是編碼β氧化過程中一些重要酶類的基因，另外PPAR也參與脂肪細(xì)胞的分化， 可能對細(xì)胞的生長、分化甚至凋亡有重要影響。PPARs是脂肪細(xì)胞分化及脂類代謝的重要調(diào) 節(jié)因子，在調(diào)控能量代謝方面起中樞作用，能夠控制脂肪酸吸收、脂肪沉積和脂肪形成，是 穩(wěn)定脂類代謝內(nèi)環(huán)境和胰島素抵抗的主要調(diào)節(jié)因子。因此，對PPARs功能和作用機制的研 究引起了許多研究者的興趣。人工配合飼料在養(yǎng)魚業(yè)中的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛。池塘養(yǎng)魚業(yè)中，由于長期應(yīng)用配 合飼料飼養(yǎng)家魚，常常會引起魚類的脂肪肝和脂肥傾向，影響魚類的生長和魚肉的鮮味。 隨著社會的發(fā)展，人們對畜禽產(chǎn)品的組成和風(fēng)味的要求越來越高，科學(xué)、合理地調(diào)控畜禽機 體脂肪沉積成為動物育種和生產(chǎn)領(lǐng)域的重要課題。PPARs起脂肪感受器的作用，局部改變 基因表達(dá)以調(diào)節(jié)脂類代謝。同時調(diào)控脂肪細(xì)胞分化，對脂肪細(xì)胞均具有轉(zhuǎn)錄激活作用，其中 PPARy具有最強的促進脂肪細(xì)胞分化的能力。根據(jù)PPARs的這些生物學(xué)功能，尋求更高親 和力與特異性的激活劑或拮抗劑，在醫(yī)學(xué)上用于治療肥胖、高血脂癥、II型糖尿病等代謝性 疾??；在畜牧生產(chǎn)中提高畜禽瘦肉率和降低禽類腹脂沉積以改善肉質(zhì)等均具有重要意義。迄今為止，PPAR基因三種亞型已在靈長類、嚙齒類、兩棲類、鳥類和一些魚類中被 鑒定和克隆，但有關(guān)魚類PPAR的研究遠(yuǎn)沒有哺乳類動物多。目前已知PPAR三種亞型有一 些共同的配體，如ΡΡ、多不飽和脂肪酸、胰島素、非甾體類抗炎藥。PPARa配體包括長鏈不 飽和脂肪酸、支鏈、聚合和氧化型脂肪酸、二十烷類化合物、白三烯Β4、貝特類降脂藥物和 Wy-14563等多種。多聚不飽和脂肪酸、前列腺素和視黃酸是PPARi^的天然配基。PPARy 的配體包括某些前列腺素、前列腺素樣分子等，花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧合酶、脂氧合酶作用后的 代謝產(chǎn)物，如15-脫氧前列腺素J2、脂肪酸衍生物為PPAR γ的天然配體。目前尚未見有將 氯貝丁酯、2-溴軟脂酸、15-脫氧-Δ 12，14-前列腺素J2用于調(diào)節(jié)草魚體內(nèi)脂類代謝平衡 的相關(guān)研究報道。HWtenophaiyngodon iWh)是我國主要養(yǎng)殖對象，可以有效利用廉價的植 物蛋白源提供水產(chǎn)品，但是草魚在養(yǎng)殖過程中體脂含量增加及脂肪肝的發(fā)生表現(xiàn)較為突 出。在集約化養(yǎng)殖條件下，由于大量攝入人工配合飼料及缺少運動，草魚體內(nèi)脂肪沉積，生長緩慢，體型異常，降低了魚肉品質(zhì)和風(fēng)味，同時也增加了養(yǎng)殖成本。經(jīng)解剖檢查，體腔內(nèi)脂 肪大部分沉積在腸道周圍、腸系膜上或肝臟表層，嚴(yán)重者肝臟失去血色，呈乳黃色或灰 黃色。因此在魚類飼料中添加降脂因子，降低其體組織脂肪的蓄積成為近幾年水產(chǎn)動物營 養(yǎng)學(xué)的研究熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的魚類養(yǎng)殖中存在的魚體內(nèi)脂肪沉積、生長緩慢、體 型異常等缺點，提供一種可維持魚類營養(yǎng)代謝平衡，減少魚類脂肪沉積，改善魚肉品質(zhì)的誘 導(dǎo)劑。本發(fā)明另一目的在于提供上述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)
一種激活魚類脂代謝調(diào)控基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，包括氯貝丁酯、2-溴軟脂酸、15-脫 氧-Δ 12，14-前列腺素J2中的一種或幾種的混合物。本發(fā)明將氯貝丁酯(Clofibrate)，2-溴軟脂酸(2-bromopalmitate)，15-脫 氧-Δ 12，14-前列腺素 J2 (15-deoxy- Δ 12，14- prostaglandin J2, 15d_J2)作為誘導(dǎo)劑 對草魚進行活體注射，注射微量(mg/kg級)，激活草魚脂類代謝調(diào)控基因，特別是過氧化物 酶體增殖體激活受體(PPAR)基因表達(dá)，以維持養(yǎng)殖魚營養(yǎng)代謝平衡。首先本發(fā)明人研究了魚體內(nèi)PPAR對于脂肪代謝影響
過氧化物酶體增殖物激活受體是作為配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，是脂肪細(xì)胞分化及脂類 代謝的重要調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控能量代謝方面起中樞作用，能夠控制脂肪酸吸收、脂肪沉積和 脂肪形成，是穩(wěn)定脂類代謝內(nèi)環(huán)境的主要調(diào)節(jié)因子。PPAR能夠調(diào)控許多參與細(xì)胞內(nèi)外脂類 代謝的目的基因表達(dá)，尤其是編碼β氧化過程中一些重要酶類的基因，另外PPAR也參與脂 肪細(xì)胞的分化，可能對細(xì)胞的生長、分化甚至凋亡有重要影響。PPAR的3種亞型在不同組織 中的表達(dá)各不相同，雖然在大多數(shù)組織細(xì)胞中PPARa、PPARii和PPARy是共同表達(dá)的，但 表達(dá)水平卻相差懸殊。PPARa主要表達(dá)于心、肝、腎近曲小管、骨骼肌和棕色脂肪等代謝活 躍的組織。PPARii在多種組織、細(xì)胞表達(dá)，其中腦、脂肪細(xì)胞及皮膚最高，而PPARy主要存 在于脂肪組織和免疫系統(tǒng)，在脂肪、腸和乳腺等組織中有較高表達(dá)。本發(fā)明人利用熒光定量PCR方法，以β-肌動蛋白為外參照，研究草魚不同組織 PPAR基因的表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示，PPARa在肝臟中大量表達(dá)，其次是腦，在肌肉和心臟 中有微量表達(dá)；PPARii在心臟、肝臟和肌肉中表達(dá)最多，在腦、脾臟和脂質(zhì)中有微量表達(dá)； PPARy表達(dá)相對較弱，只在肝臟中有較多表達(dá)，而在腦，肌肉和脂質(zhì)中微弱表達(dá)。與哺乳動 物PPAR基因表達(dá)分布不同，魚類PPAR基因主要在肝臟組織中大量表達(dá)，這可能是因為魚類 缺乏皮下脂肪層，其主要脂肪蓄積部位是腹腔腸系膜脂肪組織、肝臟及肌肉。由于肝臟是 動物脂肪酸β -氧化代謝的重要部位，因而它是魚類隨營養(yǎng)狀況而改變脂肪蓄積的主要調(diào) 節(jié)性貯脂器官(PPARa的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；PPARβ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:4 所示；PPAR γ的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所 示)。接著分析了 PPAR三種亞型的配體，它們有一些共同的配體，如PP、多不飽和脂肪酸、胰 島素、非留體類抗炎藥。PPARα配體包括長鏈不飽和脂肪酸、支鏈、聚合和氧化型脂肪 酸、二十烷類化合物、白三烯Β4、貝特類降脂藥物和Wy-14563等多種。通過激活PPARa調(diào) 節(jié)與脂肪酸β氧化有關(guān)的下游基因，如脂酰CoA氧化酶、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I的表達(dá)，進而 加速脂肪酸的分解以達(dá)到降血脂的目的。脂肪酸也可以激活PPARa，加速脂肪酸的分解。 多聚不飽和脂肪酸、前列腺素和視黃酸是PPARii的天然配基。PPAR γ的配體包括某些前列 腺素、前列腺素樣分子等，花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧合酶、脂氧合酶作用后的代謝產(chǎn)物，如15-脫 氧前列腺素j2、脂肪酸衍生物為PPARy的天然配體。因此，本發(fā)明選擇氯貝丁酯(Clofibrate)，2_溴軟脂酸(2-bromo palmitate), 15-脫氧-Δ 12，14-前列腺素 J2 (15-deoxy- Δ 12，14- prostaglandin J2, 15d_J2)分別 作為PPAR三種亞型的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)激活草魚脂類代謝調(diào)控基因——過氧化物酶體增殖體激 活受體(PPAR)表達(dá)。經(jīng)過具體的實驗摸索發(fā)現(xiàn)，注射Clofibrate 25-67 mg/kg魚體重(優(yōu)選50 mg/kg 體重)，2-bromo palmitate 35_58mg/kg 魚體重(優(yōu)選 42 mg/kg 體重)，15d_J2 0.95-1.05 mg/kg魚體重(優(yōu)選1 mg/kg體重)時，注射微量(mg/kg級)，激活過氧化物酶體增殖體激活 受體(PPAR)基因表達(dá)，作為調(diào)節(jié)草魚體內(nèi)脂類代謝平衡的基因表達(dá)誘導(dǎo)劑經(jīng)濟合算。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1.本發(fā)明提供了一種激活魚類脂代謝調(diào)控基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，注射微量(mg/kg級)， 能夠激活草魚脂類代謝調(diào)控基因——過氧化物酶體增殖體激活受體(PPAR)基因表達(dá)，以維 持養(yǎng)殖魚脂肪代謝平衡；
2.草魚是我國特有的草食性養(yǎng)殖魚類，但人工飼料喂養(yǎng)草魚一段時間后，常常發(fā)生脂 肪過量蓄積，影響飼料的增肉效果，降低其營養(yǎng)價值。根據(jù)本發(fā)明提供的三種PPAR激活劑 對魚體腹腔注射，可調(diào)節(jié)草魚體內(nèi)脂類代謝平衡，在魚類養(yǎng)殖上為減少脂肪沉積、改善肉品 質(zhì)提供重要的參考價值，有助于揭示草食性魚類對營養(yǎng)物的利用及其機制。


圖1草魚PPARa基因cDNA部分序列及推導(dǎo)的氨基酸序列，氨基酸序列用單字母 符號于核苷酸序列下對應(yīng)表示出來；
圖2草魚PPARii基因cDNA部分序列及推導(dǎo)的氨基酸序列，氨基酸序列用單字母符號 于核苷酸序列下對應(yīng)表示出來；
圖3草魚PPARy基因cDNA部分序列加3’端序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。氨基酸序列 用單字母符號于核苷酸序列下對應(yīng)表示出來；翻譯終止密碼子用星號(*)表示出來；下劃 線表示PolyA加尾信號；
圖4為草魚肝臟、腦、脾臟、肌肉、脂肪和心臟PPARs基因組成型表達(dá)水平，PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α/beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β/ beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖5為三種濃度Clofibrate腹腔注射草魚24小時后，肝臟PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α /beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖6為三種濃度Clofibrate腹腔注射草魚24小時后，腸系膜脂肪PPARs/ beta-actinmRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPARa /beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖7為三種濃度Clofibrate腹腔注射草魚M小時后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α /beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖8為三種濃度2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，肝臟PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPARa /beta-actin mRNA，2 為 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖9為三種濃度2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，腸系膜脂肪PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α/beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β/ beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖10為三種濃度2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α/beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β/ beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖11為三種濃度15-deoxy-A12, 14- prostaglandin J2腹腔注射草魚24小時后， 肝臟 PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPARα/beta-actin mRNA，2 為 PPAR^ /beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖12為三種濃度15-deoXy-A 12，14- prostaglandin J2腹腔注射草魚M小時后，腸 系膜脂肪PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為PPARα/beta-actin mRNA，2為 PPAR^ /beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖13為三種濃度15-deoxy-A12, 14- prostaglandin J2腹腔注射草魚24小時后， 肌肉 PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α /beta-actin mRNA, 2 為 PPAR^ /beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖14為PBS和50mg/kg Clofibrate腹腔注射草魚M小時后，肝臟PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射50mg/kg Clofibrate ；
圖15為PBS和50mg/kg Clofibrate腹腔注射草魚M小時后，腸系膜脂肪 PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射50mg/kg Clofibrate ；
圖16為PBS禾口 50mg/kg Clofibrate腹腔注射草魚24小時后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射50mg/kg Clofibrate ；
圖17為PBS和125umol/kg 2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，肝臟PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射125umol/kg 2-bromo palmitate ；
圖18為PBS和125umol/kg 2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，腸系膜脂肪 PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射125umol/kg 2-bromo palmitate ；
圖19為PBS和125umol/kg 2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射125umol/kg 2-bromo palmitate；
權(quán)利要求
1.一種激活魚類脂代謝調(diào)控基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，其特征在于所述誘導(dǎo)劑為氯貝丁酯、 2-溴軟脂酸、15-脫氧-Δ 12，14-前列腺素J2中的一種或幾種的混合物。
2.權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，其特征在于所述誘導(dǎo)劑對魚類進行活體注射或飼料 添加，用于激活魚類脂代謝調(diào)控基因表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，其特征在于所述氯貝丁酯的加入量為25-67 mg/kg魚體重。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，其特征在于所述氯貝丁酯的加入量為50mg/kg魚體重。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，其特征在于所述2-溴軟脂酸的加入量為 35-58mg/kg 魚體重。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，其特征在于所述2-溴軟脂酸的加入量為42mg/ kg魚體重。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，其特征在于所述15-脫氧-Δ12，14-前列腺素 J2的加入量為0. 95-1. 05 mg/kg魚體重。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，其特征在于所述2-溴軟脂酸的加入量為Img/ kg魚體重。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，其特征在于所述激活魚類脂代謝調(diào)控基因為過 氧化物酶體增殖體激活受體基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，其特征在于所述魚類為草魚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種激活魚類脂代謝調(diào)控基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用。本發(fā)明誘導(dǎo)劑為氯貝丁酯、2-溴軟脂酸、15-脫氧-Δ12,14-前列腺素J2中的一種或幾種的混合物。本發(fā)明誘導(dǎo)劑可以激活魚類體細(xì)胞脂類代謝調(diào)控基因——過氧化物酶體增殖體激活受體基因的表達(dá)，因此本發(fā)明誘導(dǎo)劑可用于魚類養(yǎng)殖中，維持魚類養(yǎng)殖中的營養(yǎng)代謝平衡，減少魚類脂肪沉積、改善肉品質(zhì)。
文檔編號A61K31/20GK102125544SQ201010593480
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者何珊, 姚煜, 梁旭方, 鄒奕, 郁穎, 陳亮, 陳小佳 申請人:暨南大學(xué)