專(zhuān)利名稱(chēng)：Plga豬流感dna疫苗微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA疫苗微球的制備方法。
背景技術(shù)：
豬流感是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種豬的急性、傳染性呼吸道疾病， 傳播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴發(fā)。因?yàn)樨i流感病毒亞型較多、抗原易發(fā)生變異和可在種間傳播，給流感疾病的預(yù)防乃至人類(lèi)的健康帶來(lái)很多挑戰(zhàn)。所以豬流感在人流感和禽流感之間發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，具有重大的公共衛(wèi)生意義。DNA疫苗是將含有編碼抗原基因的真核表達(dá)質(zhì)粒直接接種體內(nèi)，在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生保護(hù)性免疫。目前，DNA疫苗大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、 人體臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DNA疫苗存在著給藥劑量較大，生物利用度低，免疫效果個(gè)體差異大，不夠理想的缺點(diǎn)，極大地阻礙了 DNA疫苗的研究進(jìn)展。因此如何增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果、誘導(dǎo)產(chǎn)生粘膜免疫等課題是當(dāng)前DNA疫苗研究的國(guó)際熱點(diǎn)。國(guó)外DNA疫苗微球/納米粒黏膜免疫遞送系統(tǒng)的研究發(fā)展十分迅速，取得了不少階段性成果，有的已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。國(guó)內(nèi)DNA疫苗微球/納米粒黏膜免疫遞送系統(tǒng)的研究工作開(kāi)展較少，尤其是豬流感DNA疫苗黏膜免疫遞送系統(tǒng)的研究還尚未見(jiàn)有報(bào)道。DNA疫苗黏膜免疫遞送系統(tǒng)的研究結(jié)果已經(jīng)顯示出了巨大的應(yīng)用潛力，微球/納米粒遞送系統(tǒng)具有靶向作用，對(duì)DNA疫苗具有保護(hù)作用， 提高細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率，提高免疫效果并可經(jīng)口服和鼻腔給藥，誘導(dǎo)黏膜免疫等特點(diǎn)。因此，DNA 疫苗微球/納米粒黏膜免疫遞送系統(tǒng)是一個(gè)很好的遞送系統(tǒng)，將促進(jìn)DNA疫苗在畜牧業(yè)和臨床的實(shí)際應(yīng)用，屆時(shí)用于預(yù)防、治療、診斷動(dòng)物和人的疾患，將拯救諸多病畜或病者的生命或延長(zhǎng)其壽命，其經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益無(wú)疑是巨大的。目前，普通豬流感DNA疫苗的持續(xù)時(shí)間短，在體內(nèi)易被降解，不能夠?qū)崿F(xiàn)緩釋的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)在豬流感DNA疫苗存在持續(xù)時(shí)間短，在體內(nèi)易被降解，不能緩釋的問(wèn)題，而提供了 PLGA (聚乳酸/羥基乙酸共聚物)豬流感DNA疫苗微球的制備方法。PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法按以下步驟制備一、稱(chēng)取25mg的PLGA溶于0. 75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA溶液，冰浴條件下超聲乳化10s，得初乳，然后在轉(zhuǎn)速為7000r/min的條件下加入20mL質(zhì)量濃度為2%的聚乙烯醇，得復(fù)乳；二、復(fù)乳在轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下磁力攪拌5h，然后在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下離心lOmin，收集微球并用滅菌水洗滌3次，再置于-10 -50°C的條件下真空冷凍干燥，即完成PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備；其中步驟一 40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA 基因重組質(zhì)粒DNA溶液中有2mg豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA ；步驟一中豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA的濃度為120 μ g/mL。
本發(fā)明以可生物降解材料聚乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA)為載體，以豬流感病毒 H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA為模型藥物，采用復(fù)乳化-溶劑揮發(fā)法制備PLGA豬流感DNA 疫苗微球，通過(guò)考察超聲乳化時(shí)間、乳化器攪拌速度、PVA的濃度、油相中PLGA的濃度(m/v) 和DNA疫苗與PLGA比例(mg/mg)等影響因素，篩選出了粒徑適宜、載藥量大、包封率高、藥物穩(wěn)定性好、工藝簡(jiǎn)便、制備成本低、工藝重現(xiàn)性好、樣品需要量少，較好保持了 DNA疫苗的活性、具有適宜釋藥速率的PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法，并且本發(fā)明中的處方和工藝也可放大到生產(chǎn)應(yīng)用，因而對(duì)產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。本發(fā)明制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球大小均勻，外形圓整，表面光滑，粒徑為 6. 08 士 2. 34 μ m，包封率平均為60 % 士 3. 8 %，載藥量平均為5. 5 % 士 0. 5 % ；在保證DNA疫苗穩(wěn)定性的條件下具有較高的包封率，可以保持體內(nèi)最佳的藥物濃度，并且延長(zhǎng)藥物作用的時(shí)間；因此，實(shí)現(xiàn)了藥物的緩釋、靶向給藥，具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用前景，用于動(dòng)物體或人體一些流行性疾病的預(yù)防、治療和診斷，市場(chǎng)規(guī)模巨大，必將創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球生物相容性和生物黏附性好，經(jīng)黏膜免疫大大增強(qiáng)了豬流感疫苗的機(jī)體局部和全身的體液免疫及細(xì)胞免疫效果；同時(shí)克服了傳統(tǒng)注射疫苗造成的順應(yīng)性差、注射器和針頭導(dǎo)致感染、減活疫苗在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中易失活等缺點(diǎn)，且制備方法簡(jiǎn)單易行，條件溫和，生產(chǎn)成本較低。 本發(fā)明制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球可用于豬流感免疫，經(jīng)口服給藥，按體重免疫注射給藥，給藥量為95 105 μ g/100 μ L。


圖1是具體實(shí)施方式
一中PLGA豬流感DNA疫苗微球的掃描電子顯微鏡觀(guān)察圖；圖2是具體實(shí)施方式
一中超聲時(shí)間對(duì)DNA疫苗穩(wěn)定性的影響瓊脂糖凝膠電泳圖， 其中M泳道=DL 15000 Markers ； 1-6泳道超聲乳化時(shí)間分別為0、6、8、0、12、14s ；圖3是具體實(shí)施方式
一中攪拌速度對(duì)DNA疫苗穩(wěn)定性的影響瓊脂糖凝膠電泳圖， 其中 M 泳道=DL 15000 Markers ； 1-5 泳道攪拌速度分別為 0、6000、7000、8000、9000r/ min ；圖4是Western blot檢測(cè)蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況，其中1泳道293T細(xì)胞對(duì)照，2泳道質(zhì)粒DNA，3泳道PLGA豬流感DNA疫苗微球，4泳道空白PLGA微球；圖5是免疫鼠血清中IgG抗體檢測(cè)結(jié)果的曲線(xiàn)圖，其中·表示裸DNA疫苗組， 表示PLGA微球疫苗試驗(yàn)組， 表示生理鹽水對(duì)照組，▲表示空白微球。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法按以下步驟制備一、稱(chēng)取25mg的PLGA溶于0. 75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA溶液，冰浴條件下超聲乳化10s，得初乳，然后在轉(zhuǎn)速為7000r/min的條件下加入20mL質(zhì)量濃度為2%的聚乙烯醇，得復(fù)乳；
二、復(fù)乳在轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下磁力攪拌5h，然后在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下離心lOmin，收集微球并用滅菌水洗滌3次，再置于-10 -50°C的條件下真空冷凍干燥，即完成PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備；其中步驟一 40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA 基因重組質(zhì)粒DNA溶液中有2mg豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA ；步驟一中豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA的濃度為120 μ g/mL。豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒按以下步驟構(gòu)建根據(jù)對(duì)豬流感病毒四川分離株HA基因的分析，采用primer軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性擴(kuò)增引物，上游 PBl :5，-GTGGTACCATGAAGACTATCATTGCTTTGAG-3，；下游 PB2 :5’ -TTGCG GCCGCTTACTAATACACT-CAAATG-3，。在其中分別引入KpnI和NotI酶切位點(diǎn)(加下劃線(xiàn)部分)。采用PCR方法，以重組質(zhì)粒pMD-HA為模板，擴(kuò)增出豬流感病毒四川分離株HA基因； PCR反應(yīng)參數(shù)為先95 °C預(yù)變性4min ；后94°C變性30s，60°C退火40s，72 °C延伸2min， 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。采用0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳，回收目的DNA片段，連接到pMDIS-T-simplevector，陽(yáng)性質(zhì)粒送往大連寶生物公司測(cè)序驗(yàn)證正確，命名為 pMD-simpIe-HA0將pMD-simple-HA經(jīng)KpnI和NotI雙酶切之后，回收約1. 7Kb大小的DNA片段。 同時(shí)用KpnI和NotI雙酶切pcDNA3. 1 (+)，并回收；將經(jīng)過(guò)雙酶切后回收的目的DNA片段與 pcDNA3. 1 (+)的酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α克隆菌，采用氨芐抗性篩選獲得的質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送往大連寶生物公司測(cè)序，得到豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質(zhì)粒。將豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質(zhì)粒命名為pcDNA3. 1_HA。豬流感病毒H3N2 亞型HA基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法記載于《中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)》2009年第25 (22) “豬流感H3N2 亞型HA基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及其對(duì)小鼠的免疫效果的研究”中。本實(shí)施方式步驟一中豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA溶液的制備按照下述步驟1)轉(zhuǎn)化豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒的感受態(tài)菌接種到加入相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)；形成菌落后，挑取單個(gè)菌落接種于5mL相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C搖菌培養(yǎng)8 12h ；2)按1/1000的比例將新鮮的菌液接種到500mL LB培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)搖菌培養(yǎng) 8 12h ；于37°C劇烈搖12 16h ；取1 2mL菌液用試劑盒提取后，用酶切電泳分析，以確定正確的質(zhì)粒擴(kuò)增；3)離心培養(yǎng)物4°C，8000r/min,離心IOmin后的沉淀物用STE溶液洗(每個(gè)500 離心管IOOmL),溶解重懸沉淀后，8000r/min、離心8min，4°C離心去上清；4)加18mL Solution I (染液I)重懸沉淀菌體，再加入ImL新配制的30mg/mL溶菌酶溶液；5)加40mL新配制的Solution II (染液II)，蓋緊瓶蓋，緩慢顛倒離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，于室溫放置5 IOmin ；6)加30mL冰預(yù)冷的Solution III (染液III)，蓋緊瓶蓋，緩慢顛倒離心管數(shù)次， 以充分混勻內(nèi)容物，此時(shí)應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個(gè)液相；置于冰上lOmin，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀；
7) 4°C，9000r/min,離心25min ；(如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000r/min再離心 20min，然后將上清轉(zhuǎn)入另一瓶中；未形成緊密沉淀塊的原因通常是由于Solution III與細(xì)菌裂解物混合部充分)；8)用4層干凈紗布把上清濾至500mL離心管中；根據(jù)上清液的體積，加入上清液體積0. 6倍的異丙醇，混勻后室溫放置IOmin以上；9)室溫下12000r/min離心25min，棄上清，回收核酸；10) 倒掉上清，敞開(kāi)瓶口倒置離心管是殘余上清流盡，于室溫用1 2mL、70%乙醇洗1 2沉淀和管壁；于室溫將離心管倒置于吸水紙上，使其殘余痕量乙醇揮發(fā)殆盡；11)用 3mL TE (pH 8. 0)溶解核酸沉淀；12)將核酸溶液轉(zhuǎn)入15mL離心管中，再加3mL冰預(yù)冷的5mol/L的LiCl溶液，充分混勻；再 4°C，12000r/min,離心 15min ；13)將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)30mL離心管中，加等量的異丙醇，充分混勻，室溫 12000r/min，離心 IOmin ；14)小心去掉上清，敞開(kāi)管口，將管倒置以使最后的殘留的液滴流盡；用1 2mL、 70%乙醇洗沉淀及管壁；倒掉乙醇，于室溫將離心管倒置于吸水紙上，使其殘余痕量乙醇揮發(fā)殆盡；(應(yīng)使沉淀保持濕潤(rùn))15)用2mL含RNase (20 μ g/mL)的TE (pH 8. 0)溶解沉淀物，分裝到1. 5mL的微量離心管中，室溫或者37°C放置30min ；16)將質(zhì)粒-RNase混合物用酚-氯仿(1 1)抽提一次，然后用氯仿抽提一次；17)加入2倍體積的無(wú)水乙醇，室溫放置30min后，12000r/min, 4°C離心20min，棄
上清；18)用1 2mL、70 %的乙醇洗滌1 2次，離心管倒置在吸水紙或者濾紙上幾分鐘，浙干，但沉淀物應(yīng)濕潤(rùn)；19)將質(zhì)粒DNA沉淀用ImL滅菌水溶解，再加入0. 5mL PEG-MgCl2溶液；20)室溫放置30min以上，用室溫微量離心管機(jī)12000r/min離心15 20min，以回收沉淀質(zhì)粒DNA ；21)沉淀用0. 5mL 70%乙醇重懸以去除微量PEG，用微量離心機(jī)13000r/min離心 5min以回收核酸；22)吸去乙醇，重復(fù)步驟21)，二次洗滌后，在離心管架上放置10 20min，使乙醇揮發(fā)；23)濕潤(rùn)的質(zhì)粒沉淀用500 μ L TE (pH 8. 0)溶解，以1 100用TE稀釋?zhuān)米贤夥止夤舛扔?jì)測(cè)定OD26tl和OD28tl,并計(jì)算OD26tZOD28tl比值及質(zhì)粒DNA的濃度，調(diào)整濃度為2mg/ mL, _20°C保存，備用，得到豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA溶液。本實(shí)施方式步驟一中超聲乳化的時(shí)間為10s，所得初乳的乳化效果較好，且豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA的降解不明顯(如圖2所示)。本實(shí)施方式步驟一中采用7000r/min的轉(zhuǎn)速，所得復(fù)乳的乳化效果較好，且豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA的降解不明顯(如圖3所示)。本實(shí)施方式步驟一中所得復(fù)乳的油相中PLGA的濃度(m/v)為4% ；DNA疫苗與 PLGA 的比例(mg/mg)為 0. 5%。
本實(shí)施方式方法制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球在_20°C條件下保存3個(gè)月，然后電鏡觀(guān)察(如圖1所示)，PLGA豬流感DNA疫苗微球形態(tài)規(guī)貝U、外形圓整，表面光滑、分散性好，粒徑為6. 08 士 2. 34 μ m。本實(shí)施方式制 備的PLGA豬流感DNA疫苗微球，加入2mL 二氯甲烷使其完全溶解， 溶解后加入5mL PBS,渦旋振蕩30min，4000r/min離心lOmin，取上清用紫外分光光度儀測(cè)定萃取出的DNA的濃度，即可計(jì)算出DNA的含量。再根據(jù)公式計(jì)算出包封率和載藥量包封率(％ ) = PLGA豬流感DNA疫苗微球中DNA疫苗的測(cè)得含量+制備時(shí)豬流感DNA疫苗的理論載藥量X 100%載藥量(％ ) = PLGA豬流感DNA疫苗微球中DNA疫苗的測(cè)得含量+PLGA豬流感 DNA疫苗微球的重量X 100%結(jié)果本實(shí)施方式中制備的制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球的包封率平均為 60% 士3.8%，載藥量平均為 5.5% 士0.5%。本實(shí)施方式制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球，通過(guò)Western-blot檢測(cè)微球包裹后豬流感DNA疫苗的體外表達(dá)情況。檢測(cè)步驟如下接種293T細(xì)胞于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，次日將豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA從PLGA微球中提取出來(lái)。然后將提取出的4yg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(LipOfectamineTM2000reagent)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞并用 RIPA裂解液溶解，將溶解物低溫高速離心后，-20°C備用。Western blot實(shí)驗(yàn)按李國(guó)新等 艮道的方法執(zhí)行(Li GX, Qiu HJ, Han CG, et al. Vaccination of plasmid DNA encoding somatostatin gene fused with GP5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces anti_GP5 antibodies and promotes growth performance in immunized pigs [J]. Agricultural Sciences in China. 2006,5(3) :234_240.)。上清液樣品與IX SDS上樣緩沖液混合，煮沸5min，制備10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，按20 μ L/ 孔點(diǎn)樣，在100-120V條件下電泳，電泳結(jié)束后，在半干電轉(zhuǎn)印儀上3ν條件下電轉(zhuǎn)2h，將蛋白充分轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。IXPBS洗膜5min，5%的脫脂乳4°C封閉過(guò)夜，然后用1 500稀釋的兔抗H3N2亞型豬流感病毒的陽(yáng)性血清與膜在37°C孵育lh，PBST洗4次(每次5min)， 然后用1 5000稀釋的Odyssey紅外標(biāo)記的第二抗體于37°C避光孵育lh，PBST洗5次后， 再用PBS洗2次，每次5min。用Odyssey紅外成像系統(tǒng)掃描分析。結(jié)果表明(見(jiàn)圖4)，微球包裹后的豬流感DNA疫苗能夠在體外培養(yǎng)的293T細(xì)胞中進(jìn)行抗原表達(dá)，較好地保持了生物學(xué)活性。質(zhì)粒TM主要是以非分泌形式表達(dá)，蛋白表達(dá)后大部分附著在細(xì)胞上，很少分泌到培養(yǎng)液中，其轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裂解液在72-lOOkDa之間檢測(cè)到了一條帶。本實(shí)施方式制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球，通過(guò)BALB/c小鼠免疫接種試驗(yàn)檢測(cè)本實(shí)施方式制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球的免疫效果。檢測(cè)步驟如下選取6-8周齡健康雌性BALB/c小鼠40只(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng))，隨機(jī)分成4組，分別為PLGA微球疫苗試驗(yàn)組、裸DNA疫苗組、空白微球和生理鹽水對(duì)照組。肌注給藥的微球混懸于生理鹽水中。免疫前2d，各組小鼠每只脛骨前肌注0.2%的鹽酸利多卡因100 μ L，每個(gè)腿各50 μ L0免疫劑量為每只小鼠100 μ g質(zhì)粒，后腿肌肉注射，共免疫3次，每次間隔3周。分別在三免后第2周、第4周、第6周、第8周斷尾采血，分離血清。采用ELISA法和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)抗血清抗體水平。 試驗(yàn)結(jié)果(如圖5和表1所示)表明，經(jīng)PLGA微球包裹后的豬流感DNA疫苗能刺激特異性B細(xì)胞，增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的結(jié)合抗體水平有了顯著的提高，PLGA豬流感 DNA疫苗微球組體液免疫明顯高于裸豬流感DNA疫苗組，且抗體水平持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)起到了緩釋的作用。 表1免疫小鼠HI抗體檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1. PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法，其特征在于PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法按以下步驟制備一、稱(chēng)取25mg的PLGA溶于0.75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA溶液，冰浴條件下超聲乳化10s，得初乳，然后在轉(zhuǎn)速為 7000r/min的條件下加入20mL質(zhì)量濃度為2%的聚乙烯醇，得復(fù)乳；二、復(fù)乳在轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下磁力攪拌5h，然后在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下離心lOmin，收集微球并用滅菌水洗滌3次，再置于-10 _50°C的條件下真空冷凍干燥，即完成PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備；其中步驟一 40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA溶液中有2mg豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA ；步驟一中豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA的濃度為120 μ g/mL。
全文摘要
PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法，它涉及DNA疫苗微球的制備方法。它解決了現(xiàn)在豬流感DNA疫苗存在持續(xù)時(shí)間短，在體內(nèi)易被降解，不能緩釋的問(wèn)題。方法一、PLGA溶于二氯甲烷中，加豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質(zhì)粒DNA溶液，乳化后加聚乙烯醇，得復(fù)乳；二、復(fù)乳磁力攪拌后離心，收集微球并洗滌，再真空冷凍干燥即完成。本發(fā)明制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球大小均勻，外形圓整，表面光滑，粒徑為6.08±2.34μm，包封率平均為60％±3.8％，載藥量平均為5.5％±0.5％；在保證DNA疫苗穩(wěn)定性的條件下具有較高的包封率，可以保持體內(nèi)最佳的藥物濃度，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了藥物的緩釋。
文檔編號(hào)A61K9/14GK102319441SQ20111028058
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者趙凱 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)