專利名稱：：治陰道病的乳桿菌及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于治療陰道炎的德氏乳桿菌乳酸亞種的乳桿菌和含有該菌株活菌的外用微生態(tài)制劑。近年來，隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，微生物菌體制劑的開發(fā)和其在臨床醫(yī)學(xué)中的利用，已報(bào)導(dǎo)的微生態(tài)制劑，包括利用乳酸桿菌、雙歧桿菌等用于防治腸道治病菌群過渡繁殖引起疾病的制劑，已在臨床應(yīng)用中顯示出良好的效果(康白正常菌群在仿制腸道傳染病中的意義，中國微生態(tài)學(xué)雜志1989年康白論文集專刊p28-30)。對(duì)于治療陰道病還是使用抗生素，抗生素不但殺死有害致病菌，也殺死有利健康的菌損壞人體的微生態(tài)及健康。用過抗生素后，細(xì)菌性陰道病易復(fù)發(fā)，更易引起外界治病菌的感染。長期使用抗生素，致病菌易產(chǎn)生抗藥性。美國的性傳染疾病雜志1992；19(3)第146-148頁報(bào)導(dǎo)的乳桿菌對(duì)細(xì)菌性陰道病的治療，是利用凍干的嗜酸乳桿菌按雙盲動(dòng)法，對(duì)照組使用安慰劑，對(duì)60例細(xì)菌性陰道病進(jìn)行治療，觀察其療效。28例用藥組中，16例陰道涂片恢復(fù)正常，而用安慰劑的對(duì)照組29例病人的陰道涂片均未恢復(fù)。但是，其治愈率只有56％，而且嗜酸乳桿菌在陰道的粘附定植性差，用藥后復(fù)發(fā)率較高，復(fù)發(fā)率在81％。其所用的菌對(duì)白色念球菌無拮抗作用。本發(fā)明的目的是提供一種生長旺盛、遺傳穩(wěn)定、產(chǎn)酸量較高、在陰道的粘附定植性好，最好需氧條件下生長良好，用于治療陰道病，特別是細(xì)菌性陰道病的新乳桿菌菌株，進(jìn)而提供治療細(xì)菌陰道病的乳桿菌制劑。針對(duì)本發(fā)明的目的，進(jìn)行了健康人陰道乳桿菌屬的分析、患有陰道病者陰道微生物群的分析，特別是細(xì)菌性陰道病陰道微生物的分析。結(jié)果表明陰道病及細(xì)菌性陰道病病人的陰道乳桿菌的平均濃度明顯低于健康人，而腸桿菌、葡萄球菌、棒狀桿菌、類桿菌屬、支原體卻明顯增多，菌群失調(diào)是細(xì)菌性陰道病發(fā)病的原因。本發(fā)明用于治療細(xì)菌性陰道病的乳桿菌DM8908菌株，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所確定為德氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis)。這株德氏乳桿菌乳酸亞種的乳桿菌DM8909是申請(qǐng)人于1996年11月4日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCCNO.0277的乳桿菌菌株。該菌具有產(chǎn)乳酸高和產(chǎn)過氧化氫，殺死有害治病菌，而且具有很好的在陰道上皮細(xì)胞粘附定植優(yōu)勢(shì)，抑制有害治病菌的生長繁殖，是很好的調(diào)節(jié)陰道菌群平衡、拮抗外侵菌生長的乳桿菌。其具有遺傳的穩(wěn)定性，經(jīng)測(cè)定和動(dòng)物試驗(yàn)其無毒、無副作用。乳桿菌DM8909主要對(duì)苦杏仁、乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，對(duì)蜜二糖不產(chǎn)酸，DNA的G+C含量測(cè)定為49.12％，而且不含質(zhì)粒。該菌株的其他生物特性為1、形態(tài)和染色革蘭氏陽性，直桿菌，喳狀排列或不規(guī)則，無芽苞、鞭毛、莢膜。2、培養(yǎng)特性為兼性厭氧菌，傳代后需氧培養(yǎng)生長良好，35℃-42℃均能夠生長，最佳溫度37℃，pH值3.0-8.0，最佳pH6.0。3、生化反應(yīng)葡萄糖甘露糖果糖半乳糖蔗糖麥糖纖維糖乳糖棉糖甘露醇山梨醇七葉靈++++±++±+--+苦杏仁木糖鼠李糖阿拉伯糖+---乳桿菌DM8909菌對(duì)滅滴靈、碳胺甲基異惡唑、頭孢甲氧霉素耐藥；對(duì)麥迪霉素、先鋒霉素、慶大霉素、妥布霉素、青霉素、氨卞、鏈霉素、紅霉素、潔霉素、先鋒5號(hào)、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、痢特靈、氯霉素高度敏感；對(duì)多粘菌素、羧芐青霉素、丁胺卡那霉素中度敏感。乳桿菌DM8909菌對(duì)酸耐性強(qiáng)，在pH2.5、8.0均可存活。乳桿菌DM8909菌在液體中50℃條件下30分鐘可存活，但60℃時(shí)10分鐘即被滅活，在干燥粉末中60℃條件下30分鐘仍可存活。乳桿菌DM8909菌株自1989年分離以來已傳代50次和傳代72代都未發(fā)現(xiàn)變異菌株，遺傳穩(wěn)定，至今仍未發(fā)現(xiàn)變異菌株。乳桿菌DM8909菌種有斜面、半固體和凍干三種保存方式。斜面及半固體每月傳代一次，凍干保存每年復(fù)蘇一次。在Lbs(lc)液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，活菌數(shù)在試管內(nèi)36小時(shí)可達(dá)到高峰，48小時(shí)并不增加，72小時(shí)開始下降。乳桿菌DM8909菌在Lbs(Lc)平板上，37℃72小時(shí)培養(yǎng)，形成直徑1.5-2.5mm的白色、光滑、隆起、周邊整齊的菌落；在Lbs(Lc)液體培養(yǎng)基內(nèi)生長均勻、不形成菌膜，培養(yǎng)24小時(shí)以上管底有微細(xì)顆粒；在Lbs(Lc)半固體穿刺培養(yǎng)，菌體沿接種線生長，上下粗細(xì)一致。乳桿菌DM8909菌在普通營養(yǎng)鯨脂及ENB平板上不生長。發(fā)酵葡萄糖主要產(chǎn)生乳酸。將乳桿菌DM8909菌單獨(dú)培養(yǎng)，同時(shí)將葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌分別單獨(dú)培養(yǎng)，并分別與乳桿菌DM8909菌混合培養(yǎng)，進(jìn)行比較?；旌吓囵B(yǎng)的葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌的活菌數(shù)明顯低于單獨(dú)培養(yǎng)的活菌數(shù)(P＜0.02，P＜0.005，P＜0.05)，而且葡萄球菌、大腸桿菌混合培養(yǎng)的pH也隨時(shí)間的延長而下降(P＜0.01，P＜0.011)。乳桿菌DM8909單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)之間，活菌數(shù)無明顯差異，pH值無差異(見表1、表2)。乳桿菌DM8909是一株很好的生態(tài)優(yōu)勢(shì)常住菌對(duì)有害菌之間有拮抗關(guān)系，與酵母菌呈共生關(guān)系，所代謝的產(chǎn)物乳酸、過氧化氫是形成陰道酸性環(huán)境的有效物質(zhì)，有效地保持了生態(tài)的平衡。但據(jù)資料報(bào)導(dǎo)，德氏乳桿菌乳酸亞種為非陰道正常定植菌。為此，將葡萄球菌、腸桿菌、白色念球菌分別單獨(dú)與陰道上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)，并分別與乳桿菌DM8909菌混合后再與陰道上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)，進(jìn)行比較粘附競爭能力。取陰道上皮細(xì)胞懸液及菌液各1ml混合，37℃2小時(shí)溫育后用RPMI-1640洗滌細(xì)胞3次，G3玻璃濾器抽濾除去未粘附細(xì)菌。涂片，室溫干燥，甲醇固定10分鐘，革蘭氏染色，鏡下觀察。為了分析pH對(duì)細(xì)菌粘附能力的影響，菌液、細(xì)胞懸液制備及溫育全過成分別在pH3.5、4.5、5.5、7.2環(huán)境中進(jìn)行。計(jì)數(shù)采取每載玻片隨機(jī)數(shù)50個(gè)上皮細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)上皮細(xì)胞上粘附的細(xì)菌數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采取比較組間均數(shù)差異用student′s-t檢測(cè)，見表3表4。另外，單獨(dú)對(duì)致病率較高的金黃葡萄菌進(jìn)行了試驗(yàn)。將等量的乳桿菌DM8909、金黃葡萄菌混合，分別制成pH7.2混合液1和pH4.5混合液2。同樣制成含等量金黃葡萄菌的菌液3。A組是取混合液1與陰道上皮細(xì)胞液混合培養(yǎng)。B組是取混合液2，37℃溫育8-12小時(shí)后加入陰道上皮細(xì)胞液混合培養(yǎng)。C組是取菌液3與陰道上皮細(xì)胞液混合培養(yǎng)。D組是菌液3在pH4.5條件下37℃孵育8-12小時(shí)，然后與陰道上皮細(xì)胞液混合調(diào)制pH7.2后培養(yǎng)。具體見實(shí)施例5及表15?？梢钥闯觯闂U菌8909在陰道上皮細(xì)胞有極強(qiáng)的粘附能力，不但能在陰道里定植，而且有抑制有害細(xì)菌的粘附的能力，特別是在其產(chǎn)酸造成陰道酸性環(huán)境下其抑制有害菌粘附生長的能力更強(qiáng)，對(duì)有害菌有極強(qiáng)的拮抗能力。不僅對(duì)葡萄球菌、腸桿菌有拮抗能力，而且對(duì)白色念球菌也有拮抗能力。為適應(yīng)作為藥物，經(jīng)培養(yǎng)乳桿菌DM8909具有兼厭氧性。本發(fā)明治陰道炎的乳桿菌制劑是含有該乳桿菌DM8909活性成分的乳桿菌制劑。以該菌為有效活性成分配制的外用藥，置于人體陰道內(nèi)，用于治療陰道病，特別是治療細(xì)菌性陰道病(或稱非特異性陰道炎)。本發(fā)明的乳桿菌制劑，是德氏乳桿菌乳酸亞種的DM8909乳桿菌與載體或賦形劑混合的外用活菌制劑。劑型可為粉劑或膜劑或囊劑或片劑或拴劑。這樣更便于對(duì)乳桿菌DM8909的使用，更有利于其活性和藥性的發(fā)揮。粉劑和膜劑在冰箱4℃及室溫20℃±2℃下的活菌數(shù)按月檢測(cè)結(jié)果見表6。采用本發(fā)明的乳桿菌制劑進(jìn)行了臨床應(yīng)用，對(duì)細(xì)菌性陰道病的病人進(jìn)行了治療，并用該病通常的診斷方法進(jìn)行了治療效果的檢測(cè)。經(jīng)對(duì)治療的病人陰道pH值、陰道分泌物清潔度、細(xì)菌的檢出數(shù)的檢測(cè)，有效率達(dá)百分之百，治愈率達(dá)到87％以上，復(fù)發(fā)率極低，幾乎不復(fù)發(fā)。本發(fā)明的乳桿菌制劑對(duì)滴蟲性陰道炎也非常有效。由于該菌具有產(chǎn)乳酸量高，形成了陰道酸性環(huán)境，以控制陰道微生物群組成、維持陰道微生態(tài)平衡。該菌產(chǎn)生較高的過氧化氫，HO測(cè)定的含量為0.04％，是較好的陰道優(yōu)勢(shì)生態(tài)菌，特別是能有效的殺害有害菌和外來侵入菌，抑制其他菌種的生長和繁殖，具有極好的療效。該菌沒有質(zhì)粒，不傳遞耐藥性。該菌繁殖遺傳穩(wěn)定，能大量粘附于陰道組織表面而阻止腸桿菌、葡萄球菌、白色念球菌對(duì)陰道上皮細(xì)胞的粘附，阻止它們的定植生長，是極佳的生物醫(yī)藥菌種。乳桿菌DM8909是極好的預(yù)防和治療細(xì)菌性陰道病又無副作用的生態(tài)制劑菌。下面結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1、將乳桿菌DM8909菌株接種于Lbc肉湯37℃培養(yǎng)48小時(shí)，再接種于培養(yǎng)液中37℃下培養(yǎng)。將培養(yǎng)液分離收集菌體，并將干燥無水碳酸鈣與收集到的菌體混合成散狀粉劑。干燥后80目過篩制成干菌粉。將賦形劑藥用淀粉、乳糖干燥后與菌粉混合成粉劑。使藥粉活菌數(shù)達(dá)10億/g。配比為DM8909活菌菌粉10克、藥用淀粉80克、乳糖10克。將該乳桿菌粉劑按0.2克包容于10×20mm避孕膜內(nèi)，用于防治陰道病。實(shí)施例2、將上述的粉劑用聚乙烯醇制成的膜，包成片狀，制成膜劑。每片含0.2克菌粉，用塑料袋密封，每袋10片。用該膜劑對(duì)33例診斷為細(xì)菌性陰道病的病人進(jìn)行治療。將膜劑直接放入陰道后穹窿，每天一次，每次一片，連續(xù)兩周。用健康人32例進(jìn)行對(duì)照觀察，化驗(yàn)陰道分泌物pH、清潔度、菌群檢測(cè)。非特異性陰道炎病人治療前后陰道的pH值有明顯的差異，治療后的pH明顯低于治療前，而對(duì)照的健康人的pH治療前后無明顯差別。細(xì)菌性陰道病的病人陰道乳桿菌數(shù)治療前后明顯增加，治療后達(dá)到健康人的水平，陰道葡萄球菌、腸桿菌、酵母菌數(shù)治療前后明顯減少，恢復(fù)到健康人的水平。細(xì)菌性陰道病的病人經(jīng)治療后的陰道清潔度也由原來的三、四級(jí)恢復(fù)到健康人的一、二級(jí)水平。細(xì)菌性陰道病的病人的治愈率達(dá)88.75％，好轉(zhuǎn)率93.75％，有效率100％，尤其是對(duì)10例經(jīng)抗生素治療不愈者效果更佳。見表7、8、9、10。實(shí)施例3、將實(shí)施例1的菌粉與賦形劑(乳糖20％，藥用淀粉70-80％)混合成藥粉，使藥粉的乳桿菌DM8909活菌數(shù)大于0.25億/g。將藥粉分裝在于2號(hào)藥用膠囊內(nèi)，每粒裝入0.2克的藥粉，制成膠囊劑型。該藥主要用于治療細(xì)菌性陰道病，用法是臨睡前將該膠囊藥粒放入陰道深道，每天一次，每次一粒，連續(xù)10天。經(jīng)對(duì)29例細(xì)菌性陰道病的病人臨床治療，患者自覺癥狀明顯好轉(zhuǎn)或消失，婦科檢查陰道壁充血小時(shí)、白帶量及性狀明顯改善或恢復(fù)正常。29位細(xì)菌性陰道病的病人治療前陰道乳桿菌對(duì)數(shù)量為4.01±1.18，而治療后乳桿菌對(duì)數(shù)量增為6.12±1.66。治愈率89.65％，好轉(zhuǎn)率93.10％。經(jīng)與29位對(duì)照組的安慰劑治療的比較，見表10、11、12，效果是非常顯著的。表1單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)的功數(shù)對(duì)數(shù)值(單單獨(dú)培養(yǎng)乳+葡；乳桿菌與葡萄菌混合培養(yǎng)，其余類推)表2單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)的pH</tables>(單單獨(dú)培養(yǎng)乳+葡；乳桿菌與葡萄球菌混合培養(yǎng)，其余類推)表3不同pH時(shí)每陰道上皮細(xì)胞粘附細(xì)菌數(shù)(X±SD)</tables>說明1、()括號(hào)中數(shù)字為上皮細(xì)胞來源的志愿者例數(shù)2、**P＜0.013、*P＜0.05表4</tables>說明同表1。表6DM8909菌株活菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果(lgn/gn=3)表6-1室溫下定菌生留樣觀察活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果(億/g)<>表6-24℃下定菌生留樣觀察活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果(億/g)表7陰道pH的比較表8陰道微生物的比較(平均對(duì)數(shù)值比較)表9各組微生物平均對(duì)數(shù)值比較的P值表10微生物檢出率的比較(32例表12陰道菌群的變化分組例數(shù)陰道菌群定量(10n/g)乳桿菌腸桿菌酵母菌治療前治療后29294.01±1.186.12±1.664.34±1.001.11±1.282.02±1.530.71±1.19表2指出，治療前乳桿菌少，腸桿菌多，治療后乳桿菌增加，腸桿菌減少，酵母菌(主要是白色念珠菌)治療前多，治療后明顯減少。實(shí)施例4、在大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院對(duì)患細(xì)菌性陰道病的志愿病人進(jìn)行了臨床治療。所用的定菌生是含本發(fā)明的乳桿菌DM8909活菌的丸藥，每丸藥所含乳桿菌DM8909活菌數(shù)大于2×10。材料與方法1、藥品及給藥方法大連醫(yī)科大學(xué)微生態(tài)學(xué)研究所研制的乳桿菌生態(tài)制品——定菌生，活菌數(shù)2×107/丸。每晚臨睡前由患者自行將藥品放入陰道深處1丸，連續(xù)10天；用藥期間禁止性生活，避免全身使用抗生素及陰道局部用藥。2、研究對(duì)象2.1正常對(duì)照32例，年齡24-38歲，排除婦科疾病，3天內(nèi)無性生活史，2周內(nèi)無全身抗生素應(yīng)用史及陰道局部用藥史；2.2定菌生治療組62例，年齡23-52歲，按實(shí)用婦產(chǎn)科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)確診為非特異性陰道炎患者。3、化驗(yàn)檢查3.1陰道pH值測(cè)定用上海試劑三廠精密pH試紙；3.2陰道微生物學(xué)檢查用自制0.2ml不銹鋼長柄小釣刮取陰道分泌物，定性、定量檢測(cè)乳桿菌、腸桿菌、葡萄球菌、白色念珠菌；3.3陰道清潔度檢查根據(jù)陰道分泌物涂片染色確定。3.4膠丸崩解度測(cè)定將膠丸放入陰道后穿窿后2h觀察其溶解度。4、治療效果觀察5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Studet′s-t檢驗(yàn)。結(jié)果1、治療前后陰道pH值變化(見表16)表16定菌生治療前后陰道pH值的變化</tables>*P＜0.05由表-16可見，陰道炎組陰道平均pH值顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)；治療后陰道pH值恢復(fù)正常，與正常對(duì)照組比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、陰道微生物群的變化(見表-、表-18)。表17定菌生治療前后陰道微生物群變化(lgnCFU/ml*P＜0.05從表17可見，治療前陰道乳桿菌數(shù)量顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.01)；治療后乳桿菌數(shù)量增多，與正常組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。葡萄球菌、腸桿菌、白色念珠菌經(jīng)治療后均有所降低(P＜0.05)。表18定菌生治療前后各微生物檢出率比較(％)由表-18可見，治療前、后及正常對(duì)照組間各微生物檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3、陰道清潔度變化(見表-19)。表19定菌生治療前后陰道清潔度</tables>可見，經(jīng)定菌生治療后陰道清潔度有明顯改善。4膠丸崩解度測(cè)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)所用藥用膠丸在蒸餾水內(nèi)全部于30分鐘內(nèi)溶解。將此膠丸加入陰道后穿窿2h檢測(cè)崩解度。在臨床上共觀察20例用藥病人，19例病人陰道內(nèi)的膠丸，在2h內(nèi)全部崩解，1例未全崩解，經(jīng)查該患者患陰道干燥癥。5定菌生對(duì)陰道炎治療效果經(jīng)定菌生治療后，患者自覺癥狀明顯好轉(zhuǎn)或消失；婦科檢查陰道壁充血消失、白帶量及性狀明顯改善或恢復(fù)正常。本組62例，經(jīng)定菌生治療后，治愈率87.10％(54/62)；好轉(zhuǎn)率91.93％(57/62)；尤其對(duì)抗菌素治療無效者療效更佳。小結(jié)上述結(jié)果說明，定菌生對(duì)菌群失調(diào)性陰道炎有一定療效。治愈率達(dá)87.10％，有效率為91.93％。在所有病例中，均未出現(xiàn)任何副作用及不良反應(yīng)。根據(jù)陰道pH值、清潔度測(cè)定及陰道微生物群定量分析，定菌生可降低陰道pH值及清潔度；調(diào)整陰道菌群結(jié)構(gòu)，維持陰道微生態(tài)平衡。初步認(rèn)為，定菌生具有高效、無副作用、用藥方便等特點(diǎn)。實(shí)施例5、用本發(fā)明的乳桿菌DM8909對(duì)致病率較高的金黃葡萄菌在陰道上皮細(xì)胞粘復(fù)的抑制作用進(jìn)行了試驗(yàn)1、材料與方法1.1陰道上皮細(xì)胞取自10例婦科節(jié)育上環(huán)的就診者，年齡為25-40歲，婦科檢查正常，均為月經(jīng)周期的9-12天，3天內(nèi)無性生活史。用棉球擦去陰道粘液及用刮匙輕刮陰道中后段上皮細(xì)胞，懸浮于15mlpH7.2RPMI-1640中，于旋渦混合器振蕩后，1000rpm離心5min，重復(fù)2-3次，鏡檢觀察內(nèi)源性細(xì)菌是否全部除去，如沒有完全除去，用G3玻璃濾器抽濾除去內(nèi)源性細(xì)菌。以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml。1.2菌液制備1.2.1乳桿菌DM8909菌液制備將本室保存DM8909凍干管復(fù)蘇，鑒定后接種于LC斜面培基上，需氧培養(yǎng)18hr，刮取菌苔至pH7.2RPMI-1640中，且用RPMI-1640洗滌細(xì)菌3次(2500rpm，10min)，比濁調(diào)整細(xì)菌濃度為1×103/ml。1.2.2金黃色葡萄球菌菌液制備取婦科門診患者陰道分泌物，劃線于SP培基上需氧培養(yǎng)，37℃，18hr，挑取典型金黃色菌落，經(jīng)鑒定確認(rèn)為金黃色葡萄球菌，接種于Nb斜面，需氧培養(yǎng)，37℃，18hr，刮取菌苔用pH7.2RPmI-1640洗滌3次(2500rpm，10min)，調(diào)整細(xì)菌濃度為1×103/ml。1.2.3乳桿菌金黃色葡萄球菌混懸液制備粘附前將等量DM8909與等量葡萄球菌液分別離心去上清液后用總量的1/2RPMI1640將其混合，制成pH7.2混合液1。同理制成pH4.5RPMI1640混合菌液2。1.3粘附競爭實(shí)驗(yàn)1.3.1分組本試驗(yàn)分為4組A組取1ml混合液1與1ml陰道上皮細(xì)胞混合B組取1ml混合液2，37℃溫育8-12h，加入1ml陰道上皮細(xì)胞混合，調(diào)pH7.2。C組為對(duì)照組1，取1ml金黃色葡萄菌液和1ml上皮細(xì)胞懸液混合D組為對(duì)照組2，取1ml金葡菌液pH4.5條件下于37℃孵育8-12h，然后與1ml上皮細(xì)胞混合，調(diào)pH7.2。A、B、C、D均于37℃孵育2h(pH均為7.2)，然后用RPMI-1640或PBS洗滌3次，每次1000rpm，5min。然后于G3玻璃濾器抽濾以去除未粘附細(xì)菌，其間用巴氏吸管輕輕吹打。最后加入10mlRPMI-1640，1000rpm離心5min，去上清液，加入適量RPMI1640，涂片，室溫干燥，甲醇固定10min，革蘭氏染色，鏡下觀察并隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)陰道上皮細(xì)胞粘附的各類細(xì)菌數(shù)。2、結(jié)果表15不同條件下每個(gè)陰道上皮細(xì)胞粘附的細(xì)菌數(shù)</tables>*A組金黃色葡萄球菌的粘附數(shù)與DM8909的粘附數(shù)無顯著差別P＞0.05；與C組(對(duì)照1)相比，金葡菌的粘附數(shù)有顯著差別，P＜0.01**B組金黃色葡萄球菌的粘附數(shù)與DM8909的粘附數(shù)有顯著差別P＜0.01；與D組相比，金葡菌的粘附數(shù)有顯著差別，P＜00權(quán)利要求1.一種治療陰道炎新的乳桿菌菌株，其特征在于菌株是保藏號(hào)為CGMCCNO.0277的德氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis)乳桿菌DM909菌株。2.一種治陰道炎的乳桿菌制劑，其特征在于含有有效成分德氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis)保藏號(hào)為CGMCCNO.0277的乳桿菌DM8909。3.如權(quán)利要求2所說的乳桿菌制劑，其特征在于德氏乳桿菌乳酸亞種的乳桿菌DM8909與載體或賦形劑混合的外用活菌制劑。4.如權(quán)利要求3所說的乳桿菌制劑，其特征在于劑型為粉劑或膜劑或囊劑或片劑或拴劑。全文摘要本發(fā)明治陰道病的乳桿菌及制劑涉及用于治療細(xì)菌性陰道病的德氏乳桿菌乳酸亞種的乳桿菌和含有該菌株活菌的外用微生態(tài)制劑。以該菌為有效活性成分配制的外用藥,置于人體陰道內(nèi),用于治療陰道病,特別是治療細(xì)菌性陰道病。本發(fā)明的乳桿菌制劑,是以該乳桿菌與載體或賦形劑混合的外用活菌制劑劑型可為粉劑或膜劑或囊劑或片劑或栓劑。文檔編號(hào)A61K35/66GK1184637SQ9612228公開日1998年6月17日申請(qǐng)日期1996年12月7日優(yōu)先權(quán)日1996年12月7日發(fā)明者康白申請(qǐng)人:大連醫(yī)科大學(xué)科達(dá)藥業(yè)有限公司