專利名稱：一種兩親性γ-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高分子與醫(yī)用生物材料領(lǐng)域，具體來講是一種具有環(huán)境響應(yīng)特性和疏水核-親水殼結(jié)構(gòu)的Y-聚谷氨酸納米微粒的方法。
背景技術(shù)：
目前，基于功能基因組分析的藥物篩選已獲得各種藥物活性物質(zhì)，如蛋白、多肽、DNA等生物大分子藥物，但這些潛在的候選藥物由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，易因環(huán)境和載體材料的影響失去藥物活性，而利用兩親性嵌段/接枝聚合物以超分子自組裝的方式實(shí)現(xiàn)藥物負(fù)載和控緩釋的有效途徑，特別是采用兩親性嵌段/接枝聚合物獲得自組裝載藥納米微粒是目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。從體內(nèi)安全性考慮，天然高分子材料具有良好的水溶性、生物相容性、生物可降解性和非免疫原性等，用于藥物載體更具優(yōu)勢。此外，由于天然高分子鏈上通常含有大量游離的功能基團(tuán)(如羧基和氨基等)，其自身性質(zhì)(如二級結(jié)構(gòu)、體積、形狀、表面積、力學(xué)性能等將)對溫度、離子、pH、酶、電場等環(huán)境因子具有一定響應(yīng)特性。目前，針對多糖及其改性衍生物的聚合物膠束的研究較多，如殼聚糖、支鏈淀粉、透明質(zhì)酸等。由于高分子多糖水溶性較差，往往還需引入親水基團(tuán)改善其水溶性，導(dǎo)致改性產(chǎn)物的自組裝性能變差、包封藥物以及控釋藥物的能力減弱，而水溶性小分子多糖藥物負(fù)載量不高，應(yīng)用于藥物載體受到極大限制。聚氨基酸是目前研究較多的另一種重要的功能高分子材料，包括化學(xué)法合成的聚氨基酸材料和天然聚氨基酸。目前，基于化學(xué)法合成聚氨基酸材料的功能化改性及用于藥物載體的研究較多，如α -聚谷氨酸(谷氨酸單體經(jīng)α_酰胺鍵結(jié)合)(Liang, etal.Biomaterials, 2006，27:2051-2059)、聚天冬氨酸(Yang, etal. BiotechnologyLetter，2005，27，977-982)。作為迄今發(fā)現(xiàn)的三種天然聚氨基酸之一，Y-聚谷氨酸(Y -polyglutamic acid,簡稱Y-PGA)是一種由D, L-谷氨酸單體經(jīng)Y-酰胺鍵結(jié)合形成的多聚氨基酸，較化學(xué)合成的聚氨基酸具有更好的組織親和性、相容性和可生物降解性能，能被機(jī)體吸收、代謝和排泄，不易產(chǎn)生積蓄和毒副作用，初步研究結(jié)果已顯示出在藥物傳輸領(lǐng)域的應(yīng)用潛力(Shih IL, Van YT. Bioresour Technol, 2001，79: 207-225 ;Bajaj I, SinghalR.Bioresour Technol,2011, 102:5551-5561)。微生物發(fā)酵法合成的Y-PGA分子量與聞分子多糖相近,分子量在ICTlOOOKDa,但具有更好的水溶性，側(cè)鏈修飾后獲得兩親性Y-PGA接枝衍生物，在水介質(zhì)中可自組裝為穩(wěn)定的親水殼-疏水核結(jié)構(gòu)，可作為疏水性藥物或活性大分子藥物的理想載體。值得注意的是Y-PGA 二級結(jié)構(gòu)與側(cè)鏈羧基的電離度有關(guān)，未電離的側(cè)鏈羧基對二級結(jié)構(gòu)的分子內(nèi)氫鍵有穩(wěn)定作用，當(dāng)羧基電離時(shí)會破壞其氫鍵穩(wěn)定從而發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，具體表現(xiàn)為Y -PGA二級結(jié)構(gòu)對PH非常敏感，在酸性條件下呈平行的β -折疊片層，在中性條件下呈無規(guī)卷曲，而在堿性條件下是更為收縮的無規(guī)卷曲形式(Ashiuchi M, Misono H. Biopolymers[Μ].Weinheimiffiley-VCH, 2002，7:123)，由于人體內(nèi)各組織的環(huán)境pH值各有差別，特別是腫瘤組織的pH值一般低于正常組織，設(shè)計(jì)針對腫瘤組織或特定器官的pH敏感的給藥系統(tǒng)無疑具有重要的意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。除PH敏感特性外，Y-PGA還可被生物體內(nèi)特異性的Y -酰胺鍵水解酶一谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)外切水解為寡聚氨基酸或谷氨酸單體(KimuraK, Tran PL, Uchida I, etal. Microbiology, 2004，150:4115-4123)，而人血清中 GGT 主要來自肝臟，因此，Y-PGA的pH-酶雙重敏感特性使得開發(fā)針對特定器官(如肝臟)腫瘤組織的刺激-應(yīng)答式給藥系統(tǒng)成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種兩親性Y-PGA納米藥物載體的制備方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的思路是以Y-PGA為主鏈，將內(nèi)源性的疏水基團(tuán)引入其側(cè)鏈游離的羧基上，使獲得的接枝Y -PGA衍生物同時(shí)具有優(yōu)異的生物相容性、生物降 解性和環(huán)境響應(yīng)特性(pH-GGT復(fù)合敏感)。將此接枝聚合物溶于水介質(zhì)中，在超聲條件下，通過分子自組裝原理，可快速形成Y-PGA納米膠束，并可作為蛋白、DNA以及疏水性藥物的良好載體。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種兩親性Y -PGA納米藥物載體的制備方法，該方法包括以下步驟(I)兩親性Y-聚谷氨酸接枝產(chǎn)物的合成(Ia)將Y-聚谷氨酸溶解于溶劑I中，形成l(T20g/L的Y -聚谷氨酸溶液；(Ib)將催化劑加入步驟(Ia)得到的Y-聚谷氨酸溶液中，催化劑與Y-聚谷氨酸中的谷氨酸單體殘基的摩爾比為(12 2. O) :l，50(Tl000r/min反應(yīng)活化6 12h，形成反應(yīng)活化液；(Ic)將疏水性修飾物H溶解于溶劑II中，疏水性修飾物H與Y-聚谷氨酸中谷氨酸單體殘基的摩爾比為(O. 2^1. O) :1 ；(Id)將步驟(Ic)得到的疏水性修飾物H溶液于3(T90min內(nèi)緩慢滴加到步驟(Ib)得到的反應(yīng)活化液中，l(T40°C、50(Tl000r/min條件下反應(yīng)12 24h，形成反應(yīng)液；(Ie)將步驟(Id)得到的反應(yīng)液加入溶劑III中使Y _聚谷氨酸接枝產(chǎn)物沉淀，溶劑III的體積用量為步驟(Id)得到的反應(yīng)液體積的廣2倍，過濾收集沉淀，先用溶劑III清洗，再用乙醚清洗，反復(fù)透析-凍干后得兩親性Y -聚谷氨酸接枝產(chǎn)物；(2)兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備將步驟(Ie)得到的兩親性Y-聚谷氨酸接枝產(chǎn)物加入到pH4 7.5、0. I飛mol/L的磷酸鹽緩沖液中，兩親性Y-聚谷氨酸接枝產(chǎn)物在磷酸鹽緩沖液中的濃度為f5mg/mL，于25 37°C下震蕩12 36h獲得準(zhǔn)備液，隨后利用分子組裝的原理，將準(zhǔn)備液采用探針型超聲儀于冰水浴中超聲處理后獲得粒徑為20(Tl000nm、粒徑多分散系數(shù)PDI為O. Γθ. 5的納米膠束分散液，再經(jīng)離心或超濾，冷凍干燥獲得兩親性Y -聚谷氨酸納米藥物載體。步驟(Ia)中，Y-PGA可采用不同分子量的Y-PGA原料(10KDa 1000KDa)，其分子量分布系數(shù)應(yīng)在l.f 2. O之間。步驟(Ia)中，所述的溶劑I 為 0. 3^1. OmoI/L 的 Na2CO3 水溶液、0. 3^1. OmoI/L 的NaHCO3水溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS )、二甲亞砜(DMSO )、吡啶、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF )、N, N- 二乙基甲酰胺(DEF)和N，N- 二甲基乙酰胺(DMAC)中的任意一種或幾種的混合物。步驟(Ib)中，所述催化劑為碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)中的任意一種或兩種的混合物。步驟(Ic)中，所述的疏水性修飾物H為帶有非極性或疏水側(cè)鏈的氨基酸的酯化衍生物、或固醇類化合物、或烷醇、或油醇、或生育酚、或聚(N-異丙基丙烯酰胺)、或糖皮質(zhì)激素、或阿霉素、或紫杉醇；其中，所述的帶有非極性或疏水側(cè)鏈的氨基酸的酯化衍生物為酪氨酸、或色氨酸、或苯丙氨酸、或纈氨酸、或亮氨酸、或異亮氨酸、或脯氨酸、或丙氨酸的酯化衍生物；所述的固醇類化合物為膽留醇；所述的烷醇為辛醇、十二烷醇、十四烷醇或十六烷醇；所述的糖皮質(zhì)激素為地塞米松或氫化可的松。優(yōu)選酪氨酸乙酯、纈氨酸乙酯、異亮氨酸乙酯、苯丙氨酸甲酯、膽甾醇、生育酚、聚(N-異丙基丙烯酰胺)、十六烷醇、油醇、阿霉素、紫杉醇、地塞米松。步驟(Ic)中，所述的溶劑II為二甲亞砜(DMS0)、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、 N, N-二乙基甲酰胺(DEF)、N, N-二甲基乙酰胺(DMAC)和氯仿中的任意一種或幾種的混合物。步驟(Ie)中，所述的溶劑III為低級醇或丙酮，所述的低級醇為甲醇或乙醇。步驟(2)中，超聲的功率為40 90W，工作2 5s，停I 3s，總時(shí)間3 9min。步驟(2)中，所述的離心為高速離心，離心力在IOOOOg以上。步驟⑵中，獲得的兩親性接枝Y-PGA的自組裝性能(膠束形態(tài)、粒徑、粒徑分布、臨界膠束濃度)可通過Y -PGA原料的分子量特性、疏水改性基團(tuán)的選擇以及接枝產(chǎn)物側(cè)鏈取代度來調(diào)控。上述方法制備得到的兩親性Y -PGA納米藥物載體。上述兩親性Y -PGA納米藥物載體在負(fù)載蛋白、DNA以及疏水性藥物中的應(yīng)用。所述的疏水性藥物為阿霉素、紫杉醇或糖皮質(zhì)激素等。兩親性Y -PGA納米藥物載體在負(fù)載藥物時(shí)，一般將要負(fù)載的藥物投加至上述兩親性Y -PGA納米藥物載體分散液中，室溫、避光條件下低速振蕩(5(Tl00r/min) 12 24h，利用藥物與載體間的疏水作用、氫鍵作用、靜電作用等實(shí)現(xiàn)自組裝Y-PGA納米藥物載體對藥物的負(fù)載，采用超濾或透析的方法除去游離的藥物，或以高速離心(> IOOOOg)的方法收集載藥納米膠束，冷凍干燥后即獲得載藥Y -PGA納米膠束。載藥Y -PGA納米膠束的釋藥行為(環(huán)境響應(yīng)特性)可通過介質(zhì)pH和是否存在GGT作用來控制。對于阿霉素、紫杉醇或糖皮質(zhì)激素等疏水性藥物，其本身即可作為疏水接枝基團(tuán)，可按照本發(fā)明所述的兩親性Y-PGA納米藥物載體的制備方法直接制備出兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物從而不再需要利用自組裝原理額外負(fù)載藥物的步驟；或者，以阿霉素、紫杉醇或糖皮質(zhì)激素以外的物質(zhì)(即帶有非極性或疏水側(cè)鏈的氨基酸的酯化衍生物、或固醇類化合物、或烷醇、或油醇、或生育酚、或聚(N-異丙基丙烯酰胺))為疏水性修飾物H，接枝于Y-聚谷氨酸上得到得兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體，再利用自組裝原理負(fù)載阿霉素、紫杉醇或糖皮質(zhì)激素。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢
I)本發(fā)明所用的Y -PGA可采用微生物發(fā)酵法大量合成，所用的側(cè)鏈改性基團(tuán)、催化劑等均可通過市場渠道獲得。2)本發(fā)明以酰胺合成與酯化反應(yīng)中常用的EDC或NHS為催化劑制備兩親性的
Y-PGA接枝衍生物，產(chǎn)量可控，易于放大。3)本發(fā)明獲得的兩親性Y -PGA在水介質(zhì)中的自組裝性能(膠束形態(tài)、粒徑、粒徑分布、臨界膠束濃度)可通過Y-PGA原料的分子量特性、疏水改性基團(tuán)的選擇、接枝產(chǎn)物側(cè)鏈的取代度的調(diào)控來控制。 4)本發(fā)明利用兩親性聚合物自組裝的原理，在超聲條件下制備納米膠束，工藝簡單，易于操作。疏水核-親水殼結(jié)構(gòu)的納米膠束適合于疏水性或生物利用度較差的藥物及生物活性大分子藥物的負(fù)載和傳輸，利于保留藥物的活性和提高其生物利用度。5)獲得的Y -PGA納米膠束同時(shí)具備環(huán)境響應(yīng)特性(pH-GGT復(fù)合敏感)、生物相容性以及可降解性，因而可在藥物控制釋放、生物智能開關(guān)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。


圖I為本發(fā)明方法的Y-PGA接枝改性的化學(xué)反應(yīng)式。圖2為本發(fā)明方法的Y -PGA原料(a)及其接枝改性后graft- Y -PGA(b)的紅外譜圖(FTIR)。 圖3為本發(fā)明方法的Y -PGA原料(A)及其接枝改性后graft- Y -PGA⑶的1H-NMR譜圖。圖4為實(shí)施例2中芘熒光探針表征Y-PGA接枝改性物兩親性的發(fā)射光譜圖。圖5為實(shí)施例2中芘熒光探針表征的特征峰比值(1372/1385)與Y-PGA接枝改性物濃度的對數(shù)圖。圖6為實(shí)施例4制備的兩親性Y -PGA納米膠束的投射電鏡照片。圖7為實(shí)施例15不同pH的釋藥介質(zhì)中載藥Y -PGA納米膠束的體外釋藥曲線。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例I :一種兩親性Y -PGA納米藥物載體的制備方法，該方法包括以下步驟。(I)室溫下，將Ig Y -PGA(分子量380KDa，分子量分布系數(shù)I. 3)溶解于IOOmL DMSO(溶劑I)中，形成透明的10g/L Y -PGA溶液。(2)按與步驟⑴中所取Y -PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為I. 2的量稱取EDC加入上述Y -PGA溶液中，并在室溫下于500r/min反應(yīng)活化12h，形成反應(yīng)活化液。(3)按與步驟⑴中所取Y -PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為O. 4的量稱取膽甾醇，溶于IOOmL等比例混合的DMSO-吡啶(溶劑II)中。(4)將步驟(3)得到的含膽甾醇的溶液于30min內(nèi)緩慢滴加到步驟(2)得到的反應(yīng)活化液中，30°C下于50(Tl000r/min反應(yīng)12h，形成反應(yīng)液。
(5)將步驟⑷得到的反應(yīng)液加入到I倍體積的丙酮中，使Y -PGA接枝產(chǎn)物沉淀。過濾收集沉淀，先用甲醇(或乙醇)清洗，再用乙醚清洗，反復(fù)透析-凍干后得合成產(chǎn)物。根據(jù)產(chǎn)物1H-NMR圖譜分析，側(cè)鏈取代度約為22%。實(shí)施例2 溶劑I采用I. OmoI/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，催化劑EDC用量與所取Y -PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為2. 0，膽留醇用量與所取γ-PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為I. O外，其他條件同實(shí)施例I。該條件下制備的Y -PGA接枝產(chǎn)物的FTIR與1H-NMR如圖2(b)和圖3(B)所示。根據(jù)1H-NMR圖譜分析，側(cè)鏈取代度約為37%。采用芘熒光探針法考察該條件下制備的Y-PGA接枝改性產(chǎn)物的兩親性及臨界膠束濃度(CMC)，其芘發(fā)射光譜如圖4所示，芘熒光探針表征的特征峰比值(1372/1385 )與
Y-PGA接枝改性物濃度的對數(shù)圖如圖5，變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)(即兩條直線的交點(diǎn))對應(yīng)的濃度即為 CMC (O. 027mg/mL)o 實(shí)施例3 將實(shí)施例I的合成產(chǎn)物，加入到pH4. O的lmol/L PBS緩沖液中，使得合成產(chǎn)物濃度為lmg/mL，于25°C下低速震蕩12h，隨后用探針型超聲儀于冰水浴中超聲處理，工作2s，停2s，超聲時(shí)間2min，重復(fù)3次，獲兩親性Y -PGA納米膠束的分散液，再通過14000g離心收集沉淀-冷凍干燥步驟即可獲得兩親性Y-PGA納米膠束。電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則；平均粒徑約為220nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為 O. 35。實(shí)施例4 將實(shí)施例I的合成產(chǎn)物，加入到pH7. 42mol/L的PBS緩沖液中，其余同實(shí)施例3。該條件下制備的納米膠束的投射電鏡照片如圖6所示，平均粒徑約為350nm、形態(tài)規(guī)則、粒徑分布較為均一；粒徑分析儀的測定結(jié)果與電鏡觀測結(jié)果基本一致，其粒徑多分散系數(shù)(PDI)為 O. 16。實(shí)施例5:除原料Y -PGA的分子量為lOOOKDa，分子量多分散系數(shù)I. 4，兩親性Y -PGA接枝產(chǎn)物的制備同實(shí)施例1，CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y-PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 014mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y -PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為780nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 42。實(shí)施例6 除疏水性修飾物H采用酪氨酸乙酯，兩親性Y -PGA接枝產(chǎn)物的制備和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y-PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 033mg/mL ;電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y -PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為260nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 19。實(shí)施例7 溶劑I采用等比例混合的吡唆、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)的復(fù)合溶劑，溶劑II采用等比例混合的N，N- 二甲基乙酰胺(DMAC)和氯仿的復(fù)合溶劑，疏水性修飾物H采用十六烷醇，催化劑采用EDC (催化劑與Y-PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為I. 2)，其余兩親性Y -PGA接枝產(chǎn)物的制備條件和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 056mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y -PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為210nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 22。實(shí)施例8 溶劑I采用N，N-二乙基甲酰胺(DEF)，溶劑II采用等比例混合的N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)和氯仿的復(fù)合溶劑，疏水性修飾物H采用油醇，催化劑采用EDC (催化劑與Y -PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為I. 5)，其余兩親性Y-PGA接枝產(chǎn)物的制備條件和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 008mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為440nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 28。實(shí)施例9 溶劑I采用N，N- 二甲基乙酰胺(DMAC)，溶劑II采用N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，疏水性修飾物H采用生育酚，其余兩親性Y-PGA接枝產(chǎn)物的制備條件和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 013g/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為520nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 20。實(shí)施例10 溶劑I采用I. OmoI/L的NaHCO3水溶液，溶劑II采用N，N- 二乙基甲酰胺(DEF)，疏水性修飾物H采用聚(N-異丙基丙烯酰胺)，催化劑采用NHS (催化劑與Y -PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為I. 5)，其余兩親性Y-PGA接枝產(chǎn)物的制備條件和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 011mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為370nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 17。實(shí)施例11 溶劑I采用N，N-二乙基甲酰胺(DEF)，溶劑II采用N，N-二乙基甲酰胺(DEF)，疏水性修飾物H采用氫化可的松，催化劑采用EDC (催化劑與Y-PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為I. 2)，其余兩親性Y-PGA接枝產(chǎn)物的制備條件和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 041mg/mL ;電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為310nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為 O. 16。實(shí)施例12 將實(shí)施例4制備的兩親性Y -PGA納米膠束分散于ρΗ7· 4的PBS溶液中(10g/L)。以卵清蛋白(OVA)作為負(fù)載的模型蛋白藥物，按終濃度3mg/ml的量投加OVA至上述兩親性
Y-PGA納米藥物載體的分散液中，室溫、避光、100r/min條件下振蕩12h，14000g離心收集沉淀，冷凍干燥即得負(fù)載OVA的Y -PGA納米膠束。并采用Lowry法測定離心上清液游離的OVA或沉淀中包含的OVA (即裝載的0VA)，Y-PGA納米膠束的載藥量=負(fù)載藥物量/納米載體質(zhì)量(μ g/mg)，包封率=(負(fù)載藥物量/投加藥物量)X 100%。根據(jù)上式計(jì)算得Y -PGA納米膠束對OVA的載藥量為145 μ g/mg，包封率為45%。實(shí)施例13 以鹽酸阿霉素作為負(fù)載藥物，按終濃度5mg/ml的量投加至實(shí)施例4制備的兩親性Y-PGA納米膠束的分散液中(10g/L),室溫、避光、50r/min條件下振蕩12h，透析、冷凍干燥后即得載藥Y-PGA納米膠束。計(jì)算得Y-PGA納米膠束對阿霉素的載藥量為K^yg/mg，包封率為79%。實(shí)施例14 以地塞米松磷酸鈉作為負(fù)載藥物，按終濃度5mg/ml的量投加至實(shí)施例4制備的兩親性￥- 64納米膠束的分散液中(1(^/1)，室溫、避光、501'/1^11條件下振蕩12h，透析、冷凍干燥后即得載藥Y -PGA納米膠束。計(jì)算得Y -PGA納米膠束對地塞米松的載藥量為26 μ g/mg，包封率為75%。實(shí)施例15 將實(shí)施例12制備的Y -PGA載藥(OVA)納米膠束分散于不同pH的PBS緩沖溶液中，考察介質(zhì)PH對其體外釋藥特性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩親性的Y-PGA納米膠束具有PH敏感的特性，具體表現(xiàn)為其釋藥行為對介質(zhì)pH條件具有響應(yīng)特性在pH7. 4的PBS溶液中OVA釋放較慢，12h內(nèi)的釋藥率僅為19. 6 %，84h內(nèi)的釋藥率為42. I %，無突釋現(xiàn)象；而在PH4. O與pH8. O的PBS溶液中，釋放速率明顯增加(如圖7所示)。實(shí)施例16 除原料Y -PGA的分子量為lOKDa，分子量多分散系數(shù)I. 1，兩親性Y -PGA接枝產(chǎn)物的制備條件和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y-PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 010mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y -PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為180nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 17。實(shí)施例17 疏水性修飾物H采用十二烷醇，催化劑采用EDC (催化劑與Y -PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為2. 0)，其余兩親性Y-PGA接枝產(chǎn)物的制備條件和CMC濃度的測定同實(shí)施例7，兩親性Y -PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 019mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為310nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 32。實(shí)施例18 除疏水性修飾物H采用十四烷醇，催化劑采用EDC (催化劑與Y -PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為I. 5)，兩親性Y -PGA接枝產(chǎn)物的制備和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 027mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為290nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為 O. 26。實(shí)施例19 除疏水性修飾物H采用纈氨酸乙酯，兩親性Y -PGA接枝產(chǎn)物的制備和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 039mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為305nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 16。實(shí)施例20:除疏水性修飾物H采用苯丙氨酸甲酯，兩親性Y -PGA接枝產(chǎn)物的制備和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 055mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為405nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 29。實(shí)施例21 溶劑I采用L OmoI/L的NaHCO3水溶液，溶劑II采用等比例混合的N，N- 二甲基乙酰胺(DMAC)和DMSO溶液，疏水性修飾物H采用阿霉素，催化劑采用NHS (催化劑與Y -PGA中谷氨酸單體殘基的物質(zhì)量之比為I. 2)，其余兩親性Y-PGA接枝產(chǎn)物的制備條件和CMC濃度的測定同實(shí)施例2，兩親性Y -PGA納米膠束的制備同實(shí)施例4。CMC為O. 044mg/mL ；電鏡觀測與粒徑分析儀的測定結(jié)果顯示，兩親性Y-PGA納米膠束的形態(tài)較規(guī)則、平均粒徑約為333nm，粒徑多分散系數(shù)(PDI)為O. 38。
實(shí)施例22 將實(shí)施例4制備的兩親性Y-PGA納米膠束分散于pH7. 4的PBS溶液中(IOg/L)。以質(zhì)粒DNA (pEGFP :其中含有編碼綠色熒光蛋白的報(bào)告基因)作為負(fù)載模型藥物(50 μ g/100ul)，取載體分散液與質(zhì)粒DNA溶液等比例混合，其余同實(shí)施例12。測定游離的質(zhì)粒DNA濃度，計(jì)算得包封率為96%。
權(quán)利要求
1.一種兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)兩親性Y-聚谷氨酸接枝產(chǎn)物的合成 (Ia)將Y-聚谷氨酸溶解于溶劑I中，形成l(T20g/L的Y-聚谷氨酸溶液； (Ib)將催化劑加入步驟(Ia)得到的Y-聚谷氨酸溶液中，催化劑與Y-聚谷氨酸中的谷氨酸單體殘基的摩爾比為(12 2. 0) :l，50(Tl000r/min反應(yīng)活化6 12h，形成反應(yīng)活化液； (Ic)將疏水性修飾物H溶解于溶劑II中，疏水性修飾物H與Y-聚谷氨酸中谷氨酸單體殘基的摩爾比為(0. 2 I. 0):1 ; (Id)將步驟(Ic)得到的疏水性修飾物H溶液于3(T90min內(nèi)緩慢滴加到步驟(Ib)得到的反應(yīng)活化液中，l(T40°C、50(Tl000r/min條件下反應(yīng)12 24h，形成反應(yīng)液； (Ie)將步驟(Id)得到的反應(yīng)液加入溶劑III中使Y-聚谷氨酸接枝產(chǎn)物沉淀，溶劑III的體積用量為步驟(Id)得到的反應(yīng)液體積的f 2倍，過濾收集沉淀，先用溶劑III清洗，再用乙醚清洗，反復(fù)透析-凍干后得兩親性Y -聚谷氨酸接枝產(chǎn)物； (2)兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備 將步驟(Ie)得到的兩親性Y-聚谷氨酸接枝產(chǎn)物加入到pH4 7.5、0. f 5mol/L的磷酸鹽緩沖液中，兩親性Y-聚谷氨酸接枝產(chǎn)物在磷酸鹽緩沖液中的濃度為f5mg/mL，于25 37°C下震蕩12 36h獲得準(zhǔn)備液，隨后利用分子組裝的原理，將準(zhǔn)備液采用探針型超聲儀于冰水浴中超聲處理后獲得粒徑為20(Tl000nm、粒徑多分散系數(shù)PDI為0. f 0. 5的納米膠束分散液，再經(jīng)離心或超濾，冷凍干燥獲得兩親性Y -聚谷氨酸納米藥物載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法，其特征在于，步驟(Ia)中，所述Y-聚谷氨酸的分子量為10KDa 1000KDa,其分子量分布系數(shù)應(yīng)在I.1 2. 0之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法，其特征在于，步驟(Ia)中，所述的溶劑I為0. 3^1. OmoI/L的Na2CO3水溶液、0. 3^1. OmoI/L的NaHCO3水溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS )、二甲亞砜(DMSO)、吡啶、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N，N- 二乙基甲酰胺(DEF)和N，N- 二甲基乙酰胺(DMAC)中的任意一種或幾種的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法，其特征在于，步驟(Ib)中，所述催化劑為碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)中的任意一種或兩種的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法，其特征在于，步驟(Ic)中，所述的疏水性修飾物H為帶有非極性或疏水側(cè)鏈的氨基酸的酯化衍生物、或固醇類化合物、或烷醇、或油醇、或生育酚、或聚(N-異丙基丙烯酰胺)、或糖皮質(zhì)激素、或阿霉素、或紫杉醇；其中，所述的帶有非極性或疏水側(cè)鏈的氨基酸為或酪氨酸、或色氨酸、或苯丙氨酸、或纈氨酸、或亮氨酸、或異亮氨酸、或脯氨酸、或丙氨酸；所述的固醇類化合物為膽甾醇；所述的烷醇為辛醇、十二烷醇、十四烷醇或十六烷醇；所述的糖皮質(zhì)激素為地塞米松或氫化可的松。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法，其特征在于，步驟(Ic)中，所述的溶劑II為二甲亞砜(DMS0)、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二乙基甲酰胺(DEF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)和氯仿中的任意一種或幾種的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法，其特征在于，步驟(Ie)中，所述的溶劑III為低級醇或丙酮。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，超聲的功率為40 90W，工作2 5s，停I 3s，總時(shí)間3 9min。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的離心為高速離心，離心力在IOOOOg以上。
10.權(quán)利要求I所述方法制備得到的兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體。
11.權(quán)利要求10所述的兩親性Y-聚谷氨酸納米藥物載體在負(fù)載蛋白、DNA以及疏水性藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兩親性γ-聚谷氨酸納米藥物載體的制備方法，即以γ-聚谷氨酸為主鏈接枝疏水性基團(tuán)，從而獲得一種生物相容性好、可降解的兩親性γ-聚谷氨酸衍生物，在水介質(zhì)中可自組裝形成粒徑為200～1000nm的納米膠束，其疏水核-親水殼結(jié)構(gòu)有利于提高疏水性藥物在水介質(zhì)中的溶解度，進(jìn)而有望提高藥物在體內(nèi)的生物利用度，此外還可以用于蛋白及DNA的負(fù)載。本發(fā)明所述γ-聚谷氨酸納米微球的制備方法簡單易行，原料均可工業(yè)化生產(chǎn)，重現(xiàn)性好，且載藥率高，具有良好的緩釋效果和環(huán)境智能響應(yīng)(pH-酶復(fù)合敏感)等相應(yīng)特性，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號A61K47/34GK102698279SQ201210230209
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月3日
發(fā)明者姚俊, 曹新, 阮文輝, 陳寬婷, 魏欽俊, 魯雅潔 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)