專利名稱：：一種華蟾素提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種提取物及其制備方法，特別涉及一種華蟾素提取物及其制備方法。技術(shù)背景華蟾素提取物為蟾蜍科(Bufonidae)動(dòng)物中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor的干燥皮經(jīng)提取純化制得的棕黃色浸膏；華蟾素具解毒、消腫、止痛功效，用于中、晚期腫瘤、慢性乙型肝炎等癥，其生理活性物質(zhì)主要是蟾蜍毒素類(bufotoxins)及其水解產(chǎn)物蟾毒配基類(bufageins)、蟾毒色胺類(bufoteinines)，還含膽甾醇等其它化合物。目前華蟾素注射劑、口服液、片劑已應(yīng)用于臨床，但在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)由于提取物中無效物質(zhì)(雜質(zhì))含量高、有效成分含量低，導(dǎo)致產(chǎn)品有一定的毒副作用，并且療效降低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于公開一種提取物；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開一種華蟾素提取物；本發(fā)明還有一個(gè)目的在于公開該提取物的制備工藝。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述華蟾素提取物中華蟾酥毒基含量為0.15%以上，脂蟾毒配基含量為0.10%以上。本發(fā)明所述華蟾素提取物的制備方法為取干蟾皮l重量份，煎煮1-3次，每次加4-12體積份的水煎煮20分鐘-2小時(shí),合并煎煮液，濾過，濾液冷卻至4(TC以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用3-9倍柱體積水洗脫，再加2-8倍柱體積的50%-95%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。本發(fā)明所述華蟾素提取物的制備方法優(yōu)選為取干蟾皮1重量份，煎煮2-3次，每次加5-10體積份的水煎煮0.5-1.5小時(shí)，合并煎煮液，濾過，濾液冷卻至4(TC以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用5-7倍柱體積水洗脫，再加3-6倍柱體積的60%_85%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。本發(fā)明所述華蟾素提取物的制備方法優(yōu)選為取干蟾皮l重量份，加10體積份的水，煎煮45分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入5體積份的水，煎煮30分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至4(TC以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用6倍柱體積水洗脫，再加5倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。本發(fā)明所述華蟾素提取物的制備方法優(yōu)選為取干蟾皮1重量份，加7體積份的水，煎煮45分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入5體積份的水，煎煮45分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至40'C以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用7倍柱體積水洗脫，再加6倍柱體積的60%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。本發(fā)明所述華蟾素提取物的制備方法優(yōu)選為取干蟾皮l重量份，加10體積份的水，煎煮30分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入8體積份的水，煎煮30分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至4(TC以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用5倍柱體積水洗脫，再加4倍柱體積的80%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。上述制備方法中大孔吸附樹脂型號(hào)優(yōu)選為DlOl、AB-8或NKA-9等中性或低極性吸附樹脂。本發(fā)明所述重量份/體積份的關(guān)系是克/毫升取本發(fā)明所述華蟾素提取物，加入輔料，按照制劑工藝，制成臨床接受的劑型，包括但不限于注射劑、膠囊、滴丸、軟膠囊、片劑、分散片、口服液、含片、軟膏劑、滴鼻劑、顆粒劑等藥物劑型。本發(fā)明所述技術(shù)方案制備所得的華蟾素提取物中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量較現(xiàn)有大孔樹脂純化技術(shù)(申請(qǐng)?zhí)?00410083994.4)所述方法制得的提取物高5倍以上，說明本發(fā)明蟾蜍毒素類有效成分保留完全；且通過與提取物[按專利(申請(qǐng)?zhí)?00510005277.4)"華蟾素(蟾皮)提取物生產(chǎn)工藝"制備而得]的藥效學(xué)對(duì)比試驗(yàn)，證明本發(fā)明所得提取物藥效提高且毒性減小。本發(fā)明有效去除了提取物中的無效物質(zhì)(雜質(zhì))，富集了有效成分，達(dá)到了提高療效降低毒副作用的目的。下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例1提取物收率及吲哚類總生物堿含量1.1儀器及試藥UV-2401紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)；提取物I(實(shí)施例1所述本發(fā)明提取物)；提取物II[按專利(申請(qǐng)?zhí)?00510005277.4)"華蟾素(蟾皮)提取物生產(chǎn)工藝"制備而得];5-羥色胺對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所)。1.2實(shí)驗(yàn)方法吲哚類總生物堿含量測(cè)定參照華蟾素注射液(WS3-Bb-0027-95)"含量測(cè)定"項(xiàng)下方法進(jìn)行，結(jié)果見表1。表l提取物收率及吲哚類總生物堿含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果證明，本發(fā)明提取物收率降低但吲哚類總生物堿含量明顯提高，有效成分吲哚類總生物堿得到富集，并丟棄大量無效物質(zhì)(雜質(zhì))。實(shí)驗(yàn)例2提取物中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量分析2.1儀器與試藥HP-1100高效液相色譜儀及檢測(cè)器(美國惠普)，實(shí)施例l所述本發(fā)明提取物；華蟾酥毒基對(duì)照品和脂蟾毒配基對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所)；2.2實(shí)驗(yàn)方法參照《中國藥典》2005年版一部265頁(2000年版一部316頁)蟾酥項(xiàng)下含量測(cè)定方法進(jìn)行，結(jié)果見表2。表2各提取物華蟾酥毒基、脂由魯毒配基含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*專利提取物數(shù)據(jù)引用專利(申請(qǐng)?zhí)?00410083994.4)"—種華蟾毒凍干粉針及其制備方法"說明書"三、華蟾素醇提物含量分析"中提取物的華蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量。結(jié)果證明，本發(fā)明提取物中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量大大提高，蟾蜍毒素類有效成分得到較大程度富集。實(shí)驗(yàn)例3提取物藥效學(xué)比較研究試驗(yàn)3.1試驗(yàn)材料及試劑3.1.1提取物I:實(shí)施例1所述本發(fā)明提取物；每g浸膏相當(dāng)于60.61g原生藥。臨用前用蒸餾水配成所需濃度的溶液備用。本實(shí)驗(yàn)劑量按原生藥g/kg計(jì)算。提取物II:按專利(申請(qǐng)?zhí)?00510005277.4)"華蟾素(蟾皮)提取物生產(chǎn)工藝"制備而得；每g浸膏相當(dāng)于27.78g原生藥。臨用前用蒸餾水配成所需濃度的溶液備用。本實(shí)驗(yàn)劑量按原生藥g/kg計(jì)算。環(huán)磷酰胺注射用，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格0.2g/瓶，批號(hào):06071721，臨用前用蒸餾水新鮮配制。3.1.2瘤株S180瘤株購自四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤研究所。H22瘤株購自四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤研究所。3.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠SPF級(jí)，雌性，體重2426g,四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1口服各提取物對(duì)S180小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響復(fù)蘇小鼠S180瘤株，加入適量的滅菌生理鹽水，充分混勻，配制成瘤細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)〉1X1072X107ml)接種于5只同種異體小鼠腹腔內(nèi)(一代種鼠)。7天后抽取腹水，再次接種于5只同種異體小鼠腹腔內(nèi)(二代種鼠)。選取生長(zhǎng)7天后的二代種鼠抽取腹水，混勻，稀釋10倍，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。調(diào)整細(xì)胞濃度至2X107ml，接種于70只小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2ml，在接種后第2天，將動(dòng)物稱重并隨機(jī)分為6組，分別灌胃HC120g/kg、4.0g/kg，HC1120g/kg、4.0g/kg、環(huán)磷酰胺20mg/kg及等量溶媒，蒸餾水對(duì)照組則給予等體積的蒸餾水。每天一次，連續(xù)10天。末次給藥后24小時(shí)處死動(dòng)物，稱重，剝?nèi)∧[瘤，稱濕重。結(jié)果見表3。表3各提取物對(duì)S180小鼠的抑制作用組別劑量動(dòng)物數(shù)(只)體重(g)體重(g)瘤重抑瘤率(ml/kg)開始結(jié)束開始結(jié)束(g)(%)蒸餾水對(duì)照組等體積111130.8±1.339.9±2.61.90±0.63提取物I4.0121230.7±1.439.2±2.80.68±0.28"*64.0提取物I20.0121230.0±1.638.5±2.60.48±0.24"'74.6提取物n4.0121229.6±1.937.3±3.2*0.59±0.24*"68.6提取物n20.0121230.9±1.937.2±3.2*0.57±0.22***69.7環(huán)磷酰胺20mg/kg111131.1±2.035.1±2.6*"0.22±0.09*"88.4與溶媒對(duì)照組比較*P〈0.05，**P〈0.01,***P<0.001。結(jié)果證明，提取物I和提取物II各劑量組均可顯著抑制小鼠S180的生長(zhǎng)，其抑瘤率分別為74.6%、64.0%，69.7%和68.6%，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從表3還可看出提取物I各劑量組在產(chǎn)生抑瘤作用的同時(shí)對(duì)動(dòng)物體重的增長(zhǎng)并無明顯影響，而提取物II在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)也減慢動(dòng)物的生長(zhǎng)速度，提示提取物II在產(chǎn)生治療作用的同時(shí)具有一定的毒性作用。3.2.2口服各提取物對(duì)H22肝癌小鼠生存期的影響復(fù)蘇小鼠H22瘤株，加入適量的滅菌生理鹽水，充分混勻，配制成瘤細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)>1X1072X107ml)接種于5只同種異體小鼠腹腔內(nèi)(一代種鼠)。7天后抽取腹水，再次接種于5只同種異體小鼠腹腔內(nèi)(二代種鼠)。選取生長(zhǎng)7天后的二代種鼠抽取腹水，混勻，稀釋10倍，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。調(diào)整細(xì)胞濃度至2X107ml，接種于67只小鼠腹腔，每只小鼠注射0.2ml，在接種后第2天，將動(dòng)物稱重并隨機(jī)分為6組，分別灌胃提取物I20g/kg、4.0g/kg,提取物II20g/kg、4.0g/kg，環(huán)磷酰胺20mg/kg,蒸餾水對(duì)照組則給予等體積的蒸餾水。每天一次，連續(xù)10天。末次給藥后繼續(xù)觀察并記錄動(dòng)物在接種腫瘤后的死亡時(shí)間，結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。表4口服各提取物對(duì)H22肝癌小鼠生存期的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與溶媒對(duì)照組比較*P〈0.05，**P〈0.01。從表4可見，提取物I20g/kg、4.0g/kg和提取物I120g/kg、4.0g/kg均可顯著延長(zhǎng)H22小鼠的生存期，與溶媒對(duì)照比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其延長(zhǎng)率分別為43.8%、28.5%，21.5%和11.1%?？梢娞崛∥颕延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期的作用明顯優(yōu)于提取物II。3.3小結(jié)以上結(jié)果證明，兩種提取物均有抗腫瘤作用，但以提取物I(本發(fā)明制備方法所得提取物)的作用較好，毒性較低。下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例的效果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:取干蟾皮lkg，加10L水煎煮45分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入5L水煎煮30分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至3(TC，上DIOI大孔吸附樹脂柱吸附，先用6L水洗脫，再加5L70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，得華蟾素提取物16.5g，經(jīng)測(cè)定提取物中華蟾酥毒基總量為31.2mg，脂蟾毒配基總量為20.8mg。實(shí)施例2:取干蟾皮lkg，加7L水煎煮45分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入5L水再煎煮45分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至25。C，上AB-8大孔吸附樹脂柱吸附，先用7L水洗脫，再加6L60%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，得華蟾素提取物15.3g，經(jīng)測(cè)定提取物中華蟾酥毒基總量為22.9mg，脂蟾毒配基總量為15.6mg。實(shí)施例3:取干蟾皮lkg，加10L水,煎煮30分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入8L水煎煮30分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至35°C，上NKA-9大孔吸附樹脂柱吸附，先用5L水洗脫，再加4L80%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，得華蟾素提取物18.4g，經(jīng)測(cè)定提取物中華蟾酥毒基總量為36.5mg，脂蟾毒配基總量為24.2mg。實(shí)施例4:取干蟾皮lkg，加5L水，煎煮1小時(shí)，即一煎；一煎后藥渣加入4L水再煎半小時(shí)，煎煮液濾過，濾液冷卻至32'C，上D101大孔吸附樹脂柱吸附，先用8L水洗脫，再加7L55%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，得華蟾素提取物13.8g，經(jīng)測(cè)定提取物中華蟾酥毒基總量為20.8mg,脂蟾毒配基總量為13.9mg。實(shí)施例5:取干蟾皮lkg，加22L水，煎煮45分，煎煮液濾過，濾液冷卻至38'C，上AB-8大孔吸附樹脂柱吸附，先用4L水洗脫，再加3L909&乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，得華蟾素提取物17.lg，經(jīng)測(cè)定提取物中華蟾酥毒基總量為30.6mg，脂蟾毒配基總量為24.3mg。實(shí)施例6:取干蟾皮lkg,每次加4L水煎煮25分鐘，煎煮3次；合并三次煎煮液，濾過，濾液冷卻至28-C，上NKA-9大孔吸附樹脂柱吸附，先用8L水洗脫，再加2L959&乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，得華蟾素提取物15.8g，經(jīng)測(cè)定提取物中華蟾酥毒基總量為24.Omg，脂蟾毒酉己基總量為16.5mg。權(quán)利要求1、一種華蟾素提取物，其特征在于該提取物中華蟾酥毒基含量為0.15％以上，脂蟾毒配基含量為0.10％以上。2、如權(quán)利要求1所述的華蟾素提取物，其特征在于該提取物是由如下方法制備的取干蟾皮1重量份，煎煮1-3次，每次加4-12體積份的水煎煮20分鐘-2小時(shí)，合并煎煮液，濾過，濾液冷卻至4(TC以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用3-9倍柱體積水洗脫，再加2-8倍柱體積的50%_95%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。3、如權(quán)利要求2所述的華蟾素提取物，其特征在于該提取物是由如下方法制備的取干蟾皮l重量份，煎煮2-3次，每次加5-10體積份的水煎煮0.5-1.5小時(shí)，合并煎煮液，濾過，濾液冷卻至4(TC以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用5-7倍柱體積水洗脫，再加3-6倍柱體積的60%-85%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。4、如權(quán)利要求2所述的華蟾素提取物，其特征在于該提取物是由如下方法制備的取干蟾皮1重量份，加10體積份的水，煎煮45分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入5體積份的水，煎煮30分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至4(TC以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用6倍柱體積水洗脫，再加5倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。5、如權(quán)利要求2所述的華蟾素提取物，其特征在于該提取物是由如下方法制備的取干蟾皮l重量份，加7體積份的水，煎煮45分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入5體積份的水，煎煮45分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至4(TC以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用7倍柱體積水洗脫，再加6倍柱體積的60%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。6、如權(quán)利要求2所述的華蟾素提取物，其特征在于該提取物是由如下方法制備的取干蟾皮1重量份，加10體積份的水，煎煮30分鐘，即一煎;一煎后藥渣加入8體積份的水，煎煮30分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至40'C以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用5倍柱體積水洗脫，再加4倍柱體積的80%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。7、如權(quán)利要求2-6任一所述的華蟾素提取物，其特征在于該提取物的制備方法中大孔吸附樹脂型號(hào)為DlOl、AB-8或NKA-9中性或低極性吸附樹脂。8、如權(quán)利要求1所述的華蟾素提取物的制備方法，其特征在于該方法為取干蟾皮l重量份，煎煮1-3次，每次加4-12體積份的水煎煮20分鐘-2小時(shí),合并煎煮液，濾過，濾液冷卻至40'C以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用3-9倍柱體積水洗脫，再加2-8倍柱體積的50%-95%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。9、如權(quán)利要求8所述的華蟾素提取物的制備方法，其特征在于該方法為取干蟾皮l重量份，煎煮2-3次，每次加5-10體積份的水煎煮0.5-1.5小時(shí)，合并煎煮液，濾過，濾液冷卻至40'C以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用5-7倍柱體積水洗脫，再加3-6倍柱體積的60%-85%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。10、如權(quán)利要求8所述的華蟾素提取物的制備方法，其特征在于該方法為取干蟾皮l重量份，加10體積份的水，煎煮45分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入5體積份的水，煎煮30分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至40。C以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用6倍柱體積水洗脫，再加5倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。11、如權(quán)利要求8所述的華蟾素提取物的制備方法，其特征在于該方法為取干蟾皮l重量份，加7體積份的水，煎煮45分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入5體積份的水，煎煮45分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至40。C以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用7倍柱體積水洗脫，再加6倍柱體積的60%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。12.如權(quán)利要求8所述的華蟾素提取物的制備方法，其特征在于該方法為取干蟾皮l重量份，加10體積份的水，煎煮30分鐘，即一煎；一煎后藥渣加入8體積份的水，煎煮30分鐘，即二煎；合并兩次煎煮液，濾過，濾液冷卻至4(TC以下，上大孔吸附樹脂柱吸附，先用5倍柱體積水洗脫，再加4倍柱體積的80%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后，濃縮，干燥，即得華蟾素提取物。13.如權(quán)利要求8-12任一所述的華蟾素提取物的制備方法，其特征在于該方法中大孔吸附樹脂型號(hào)為DlOl、AB-8或NKA-9中性或低極性吸附樹脂。全文摘要本發(fā)明公開了一種華蟾素提取物及其制備方法，該提取物中的主要有效成分華蟾酥毒基含量在0.15％以上，脂蟾毒配基含量在0.10％以上。該提取物是由干蟾皮經(jīng)過水煮、過柱、洗脫、濃縮、干燥等工藝制備而成，本發(fā)明有效去除提取物中的無效物質(zhì)(雜質(zhì))，富集有效成分，達(dá)到了提高療效降低毒副作用的目的。文檔編號(hào)A61P31/00GK101396373SQ200710175439公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2007年9月29日優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日發(fā)明者張愛軍,譚正懷申請(qǐng)人:四川省中醫(yī)藥科學(xué)院