專利名稱：具有類胰島素作用的肌醇聚糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有類胰島素作用的肌醇聚糖，這些化合物適于治療糖尿癥。
已知胰島素的代謝作用還形成同樣具有類胰島素作用的小分子量化合物(US 4446064)。已建議了一些具有類胰島素作用的肌醇聚糖化合物(WO96/14075，JP 6/293790，JP 4/120089)。
II型糖尿病，一種非胰島素依賴性糖尿病，伴隨著外周組織如肌肉或脂肪組織的胰島素抗性。因此降低的葡萄糖利用率是由于胰島素對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和隨后代謝過程的刺激缺乏造成的。
本發(fā)明者試圖發(fā)現(xiàn)其它具有類胰島素作用的化合物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物具有體外類胰島素作用，表現(xiàn)出良好的血清穩(wěn)定性并對(duì)胰島素抗性組織也具有類胰島素作用，適于治療糖尿癥。
因此本發(fā)明涉及式I的具有類胰島素作用的肌醇聚糖A-Z-R(I)和/或式I化合物的生理可耐受鹽和/或立體異構(gòu)體形式的式I化合物，其中A是基團(tuán)1)H-P(O)(OH)-，2)H-P(S)(OH)-，3)HO-P(S)(OH)-，4)HS-P(S)(OH)-，5)(C1-C4)-烷基-P(O)(OH)-，6)(C1-C4)-烷基-P(S)(OH)-，7)S(O)2(OR1)-，8)S(O)(OR1)-，9)NH2-C(O)-，10)R1R2N-，11)R1R2N-C(O)-NH-，12)R1O-SO2-NH-，13)(C1-C4)-烷基-SO2-，14)(C1-C4)-烷基-S(O)-或15)R1-S-其中R1和R2彼此獨(dú)立地是氫或(C1-C4)-烷基，Z是 1)2-6個(gè)糖基，2)被下述基團(tuán)彼此獨(dú)立地單至六取代的2-6個(gè)糖基，所述取代基是2.1 甲基，2.2 糖基，2.3 二糖基，2.4 -SO2-OH，2.5 -C(O)-NR1R2，2.6 -C(O)-(C1-C4)-烷基，2.7 -P(O)(H)OH，2.8 -P(O)(OH)2，2.9 -P(S)(H)OH，2.10-P(S)(OH)2，2.11-P(S)(SH)(OH)，2.12-P(O)(OH)-O-CH2-CH2-NR1R2或2.132-6個(gè)糖基間的配糖鍵被-CH2-或-S-取代一至六次，且其中R1和R2彼此獨(dú)立地是氫或(C1-C4)-烷基，R是 1)肌醇，2)肌醇磷酸酯，3)肌醇硫代磷酸酯，4)肌醇環(huán)磷酸酯，
5)肌醇環(huán)硫代磷酸酯，6)被下述基團(tuán)彼此獨(dú)立地單或二取代的R2)至5)下定義的基團(tuán)，所述取代基是6.1 磷酸(酯)基或6.2 硫代磷酸(酯)基，7)被下述基團(tuán)單取代的R2)至5)下定義的基團(tuán)，所述取代基是7.1 環(huán)磷酸(酯)基或7.2 環(huán)硫代磷酸(酯)基，8)肌醇，其中兩個(gè)相鄰的OH基被下述取代基取代，所述取代基是8.1-CH2-SO2-NH-。
優(yōu)選的式I化合物中，是其中A是 1)H-P(O)(OH)-，2)S(O)2(OR1)-或3)NH2-C(O)-，Z是 1)源于下述糖的2-6個(gè)糖基，所述糖是1.1 甘露糖，1.2 葡萄糖，1.3 葡糖酸，1.4 半乳糖酸，1.5 甘露糖酸，1.6 葡糖胺，1.7 果糖或1.8 半乳糖，2)源于Z 1.1至1.8下定義的并且被下述取代基彼此獨(dú)立地單至六取代的2-6個(gè)糖基，所述取代基是2.1 甲基，2.2 甘露糖，
2.3 葡糖胺，2.4 二甘露糖，2.5 甘露糖-葡糖胺基，并且兩個(gè)糖分子甘露糖和葡糖胺間的配糖鍵是介于兩個(gè)糖分子的1-3、1-2或1-6個(gè)碳原子之間，且R是 1)肌醇，2)肌醇磷酸酯，3)肌醇硫代磷酸酯，4)肌醇環(huán)硫代磷酸酯或5)肌醇環(huán)磷酸酯。
特別優(yōu)選的式I化合物中，其中A是1)H-P(O)(OH)-，Z是1)源于下述糖的2-4個(gè)糖基，所述糖是1.1 甘露糖或1.2 葡糖胺，2)源于下述糖的2-4個(gè)糖基，所述糖是2.1 甘露糖或2.2 被甘露糖基單取代的葡糖胺，且R是 1)肌醇，2)肌醇磷酸酯，3)肌醇環(huán)磷酸酯。
糖基應(yīng)理解為含3-7個(gè)碳原子的醛糖或酮糖，它們可以是D或L構(gòu)型的；它們還包括氨基糖或糖醛酸?？商峒暗膶?shí)例是葡萄糖，甘露糖，果糖，半乳糖，核糖，赤蘚糖，甘油醛，景天庚酮糖，葡糖胺，半乳糖胺，葡糖醛酸，半乳糖醛酸，葡糖酸，半乳糖酸或甘露糖酸。
二糖是指由兩個(gè)糖單位組成的多糖。三、四、五或六糖由3-6個(gè)糖通過類似縮醛的鍵合形成。在此，所述鍵合可以以α-或β-形式存在。糖單位間的鍵合優(yōu)選通過一個(gè)糖單位的1位與另一個(gè)糖單位的6位碳原子、一個(gè)糖單位的1位與另一個(gè)糖單位的2位以及一個(gè)糖單位的1位與另一個(gè)糖單位的4位進(jìn)行。糖單位間的鍵合優(yōu)選是α-形式的。
A與Z例如通過Z的一個(gè)氧原子或者通過Z的一個(gè)碳原子鍵合，優(yōu)選通過Z的CH2基的碳原子進(jìn)行鍵合?；鶊F(tuán)A10)至12)的鍵合優(yōu)選通過Z的碳原子進(jìn)行，其它A的鍵合優(yōu)選通過Z的氧原子進(jìn)行。
R與Z的鍵合與二、三、四、五或六糖的鍵合類似。另外，R與Z的鍵合也可被-CH2-或-S-取代一次或多次。
如果糖是取代的，則取代優(yōu)選發(fā)生在糖OH基的氫原子上。
術(shù)語胰島素抗性組織意指例如大鼠脂肪細(xì)胞，它們根本不含有胰島素受體。
本發(fā)明的化合物可包含一個(gè)或多個(gè)磷酸(酯)基，另外該磷酸(酯)基也可由磷酸基保護(hù)基衍生。磷酸(酯)基保護(hù)基是例如苯基、芐基或羥丙基氰基(Houben Weyl，Methoden der Organi schen Chemie[有機(jī)化學(xué)方法]，12卷/1或12卷/2；Teiheimer，有機(jī)化學(xué)合成方法，45卷)。
式I化合物的生理可耐受性鹽具體是指可藥用的或者非毒性的鹽。這類鹽是例如由含酸性基團(tuán)，如磷酸基或硫酸基的式I化合物與堿金屬或堿土金屬，如鈉、鉀、鎂和鈣形成的；也可與生理可耐受性有機(jī)胺，如三乙胺和三(2-羥乙基)胺形成。含堿性基團(tuán)，如氨基的式I化合物可與無機(jī)酸，如鹽酸、硫酸或磷酸形成鹽，以及與有機(jī)羧酸或磺酸，如乙酸、檸檬酸、苯甲酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸和對(duì)甲苯磺酸形成鹽。其中堿性和酸性基團(tuán)以相同數(shù)量存在的化合物可形成內(nèi)鹽，且不依賴于第三種成鹽組分。
本發(fā)明還涉及式I化合物的制備方法，包括由保護(hù)的糖和肌醇前體合成肌醇聚糖的步驟，然后加入基團(tuán)A，除去化合物的一種或多種臨時(shí)引入的用以保護(hù)其它功能基的保護(hù)基，如果需要，可將如此獲得式I化合物轉(zhuǎn)化為其生理可耐受性鹽。
二糖或多糖可采用已知方法合成(H.Paulsen，Angew.Chem.Int.Ed.21(1982)p.155)。優(yōu)選采用三氯乙酰亞氨酸酯法合成寡糖(R.R.Schmidt，Angew.Chem.Int.Ed.25(1986)212-235；T.Ogawa，四面體通訊，31(1990)2439-2442)。
磷酸酯借助H-磷酸酯和氨基磷酸酯法合成(W.Bannwath等，Helvetica Chemica Acta，70(1987)，175-186；L.A.Slotin，合成(1977)737-752)。
可作為糖的羥基保護(hù)基的有芐基、乙酰基、苯甲?；?、新戊酰基、三苯甲游基、叔丁基二甲硅烷基、亞芐基、亞環(huán)己基或異亞丙基保護(hù)基。
式I化合物和它們的生理可耐受性鹽主要可用作治療糖尿癥或非胰島素依賴性糖尿病的藥物制劑的活性化合物。
因此，本發(fā)明還涉及藥物制劑，該制劑含有至少一種式I化合物和/或至少一種其生理可耐受性鹽，式I化合物或其鹽是以溶解、無定形和/或結(jié)晶形式存在的，優(yōu)選以無定形和/或結(jié)晶形式存在。
藥物制劑優(yōu)選是注射溶液或懸浮液，其pH約為3.0-9.0，優(yōu)選約為5.0-8.5，在無菌水溶液或懸浮液中含有適宜的等滲調(diào)節(jié)劑、適宜的防腐劑，如果需要，還含有適宜的緩沖劑，如果需要，還含有適宜的緩釋成分。除活性化合物外，所有這些制劑成分構(gòu)成制劑賦形劑。適宜的等滲調(diào)節(jié)劑是例如甘油、葡萄糖、甘露醇糖、氯化鈉、鈣或鎂化合物如氯化鈣或氯化鎂。適宜的防腐劑是例如苯酚、間甲酚、苯甲醇和/或?qū)αu基苯甲酸酯。
可使用緩沖劑物質(zhì)如乙酸鈉、檸檬酸鈉或磷酸鈉將pH調(diào)節(jié)到約5.0-8.5。另外，生理可接受的稀酸(典型的是鹽酸)或堿(典型的是氫氧化鈉)也適用于調(diào)節(jié)pH。
為改變本發(fā)明制劑的作用曲線，還可摻入改性(EP-B 132769和EP-B132770)和/或未改性的胰島素，優(yōu)選牛、豬或人胰島素，尤其是人胰島素。
藥物制劑的制備可如下進(jìn)行將至少一種式I化合物和/或其生理可耐受性鹽，如果需要與改性和/或未改性的胰島素或胰島素衍生物一起加到有生理可接受的賦形劑的適宜給藥的劑型中，如果需要該劑型中還可加入添加劑和輔助劑。
通過下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。實(shí)施例1化合物B的制備可由實(shí)施例1末尾的反應(yīng)路線圖獲知該反應(yīng)過程?；衔?的合成將60g(94mmol)的1(T.G.Mayer，B.Kratzer，R.R.Schmidt，Angew.Chem，106(1994)2289-93)和21.2g的2(42.4mmol)2(A.Termin，R.R.Schmidt，Liebigs Ann.Chem.(1989)789-795)溶于200ml干燥二氯甲烷和400ml干燥正庚烷中。加入70g干燥分子篩(0.4nm)后，該混合物在室攪拌15分鐘。然后加入5ml 0.05M三甲硅烷基三氟甲烷-磺酸的二氯甲烷溶液(在下面的反應(yīng)中稱之為催化劑溶液)。15分鐘后，加入300ml正庚烷/乙酸乙酯(1∶1)，將該混合物濾過硅膠。硅膠用正庚烷/乙酸乙酯(1∶1)洗，然后濃縮濾液。借助閃式色譜純化后，獲得41.0g無色油狀物3(99％)。TLC正庚烷/乙酸乙酯(1∶1)，Rf＝0.6，MS(M+Li)+＝981.1，計(jì)算值C55H67N3O11Si，M＝974.21。亞氨酸酯4的合成將41g(42.0mmol)的3溶于400ml(THF)和9ml乙酸中。加入70ml 1MTBAF/THF溶液后，使混合物在室溫放置8小時(shí)。冷凍(在-30℃冷凍16小時(shí))除去乙酸，過濾濃縮后經(jīng)閃式色譜純化。獲得34.1g(94％)脫保護(hù)的化合物。將該化合物溶于300ml干燥二氯甲烷中。加入50ml三氟乙腈和20g碳酸鉀后，使該混合物在室溫放置4小時(shí)。濾過硅膠，硅膠用正庚烷/乙酸乙酯(1∶1)洗，濾液濃縮。獲得粗品42.1g。TLC正庚烷/乙酸乙酯(2∶1)，Rf＝0.5.1H-NMR(CDCl3)乙酸氨酸酯特征峰；σ＝8.78(NH)和5.63(端基異構(gòu)體)(β-亞氨酸酯)。三糖6的合成將33.2g(33.30mmol)的4和13.3g(25.0，，ol)的5(R.Aneja，S.G.Aneja，A.Parra，四面體，Asymmetry 6(1995)17-18；C.J.J.Elie，R.Verduyn，C.E.Dreef，D.M.Braunts，G.A.van der Marel，J.H vanBoom，四面體，46(1990)8243-54)溶于120ml干燥二氯甲烷和360ml干燥正庚烷中。加入100g分子篩后，將該混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。在氬氣氛下將混合物冷卻到-20℃，然后用20ml催化劑溶液處理。30分鐘后，使混合物溶化到室溫。為進(jìn)行后處理，將混合物濾過硅膠，該硅膠用正庚烷/乙酸乙酯(1∶1)洗。濾液濃縮并將粗品(46.2g)溶于150ml二氯甲烷中。加入400ml甲醇和15ml 1M NaOMe/MeOH溶液后，使混合物在室溫放置16小時(shí)。該溶液用1ml水處理并濃縮。所得油溶于50ml乙酸乙酯，用200ml正庚烷/乙酸乙酯(1∶1)稀釋并濾過硅膠。濃縮后，殘余物經(jīng)閃式色譜純化。得到32.5g(97％)白色泡沫狀端基異構(gòu)體混合物。TLC正庚烷/乙酸乙酯(2∶1)，Rf＝0.5，MS(M+Li)+＝1336.7，計(jì)算值C80H87N3O15，M＝1330.59。三糖7的合成端基異構(gòu)體6可經(jīng)簡(jiǎn)單的色譜分離為衍生物7。32.4g(24.4mmol)的6溶于200ml二氯甲烷。加入500ml 0.5M HCl/MeOH(由17.5ml AcCl的500ml MeOH溶液制備)和20ml乙二醇后，該混合物在室溫放置17小時(shí)。濃縮后，殘余物經(jīng)閃式色譜純化。所得產(chǎn)物(26.9g，88％)溶于300ml二氯甲烷中。加入3.0g咪唑和4.6g TBDMSC1。在室溫16小時(shí)后，該混合物用500ml正庚烷/乙酸乙酯(2∶1)稀釋并濾過硅膠。該硅膠用正庚烷/乙酸乙酯(2∶1)洗，并濃縮濾液。獲得21.1g(72％)的7和6.3gα-產(chǎn)物。(22％)TLC正庚烷/乙酸乙酯(2∶1)，Rf＝0.5(7)和Rf＝0.3(α-產(chǎn)物)。MS(M+Li)+＝1370.6，計(jì)算值C80H93N3O15Si，M＝1364.71。三糖8的合成將21.2g(15.5mmol)的7溶于60ml二氯甲烷和180ml二甲氧基丙烷。加入250mg TsOH并使混合物在室溫放置1小時(shí)。加入2ml三乙胺后，濃縮獲得23.1g粗品。將粗品溶于150ml THF，用30ml 1M TBAF/THF溶液處理。16小時(shí)后，濃縮并經(jīng)閃式色譜純化。獲得20.0g(99％)白色泡沫狀的8。TLC正庚烷/乙酸乙酯(2∶1)，Rf＝0.4，MS(M+Li)+＝1296.7，計(jì)算值C77H83N3O15，M＝1290.51。四糖10的合成類似于化合物6的合成方法，將20.0g(15.4mmol)的8與15.0g(23.5mmol)的9(T.G.Mayer，B.Kratzer，R.R.Schmidt，Angew.Chem.106(1994)2289-93)反應(yīng)，獲得20.3g(76％)白色泡沫狀的四糖10。TLC正庚烷/乙酸乙酯(2∶1)，Rf＝0.6，MS(M+Li)+＝1770，計(jì)算值C107H115N3O20，M＝1763.09。五糖12的合成類似于化合物6的合成方法，將20.3g(11.8mmol)的10與12.0g(23.5mmol)的11(T.G.Mayer，B.Kratzer，R.R.Schmidt，Angew.Chem.106(1994)2289-93)反應(yīng)，獲得19.4g(80％)脫酰基化合物。將該產(chǎn)物溶于200ml二氯甲烷并用3.4g(50.0mmol)咪唑處理。加入6.0g(40.0mmol)TBDMSC1，使該混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。加入5ml甲醇后，將其放置10分鐘，然后用200ml正庚烷/乙酸乙酯(1∶1)稀釋并濾過硅膠。硅膠用另外的200ml正庚烷/乙酸乙酯(1∶1)洗，濾液濃縮并經(jīng)閃式色譜純化。獲得19.4g(95％)白色泡沫狀的12。TLC正庚烷/乙酸乙酯(2∶1)，Rf＝0.7，MS(M+Li)+＝2226，計(jì)算值C133H151N3O25Si，M＝2219.75。六糖14的合成將19.4g(8.9mmol)的12和14.0g(20.0mmol)的13(T.G.Mayer，B.Kratzer，R.R.Schmidt，Angew.Chem，106(1994)2289-93)溶于100ml干燥二氯甲烷和300ml干燥正庚烷中。加入40g分子篩(0.4nm)后，該混合物在室攪拌15分鐘。然后加入10ml催化劑溶液并將混合物繼續(xù)攪拌15分鐘。為進(jìn)行后處理，將混合物濾過硅膠，硅膠用正庚烷/乙酸乙酯(1∶1)洗，然后濃縮濾液，獲得33g粗產(chǎn)物。將其溶于200ml二氯甲烷中并用500ml 0.5MHCl的甲醇溶液處理。在室溫2小時(shí)后，將混合物濃縮并用二氯甲烷濃縮數(shù)次。所得中間體溶于200ml二氯甲烷并用3.4g(50mmol)咪唑和6.0g(40mmol)TBDMSC1處理。16小時(shí)后，類似于化合物12合成方法進(jìn)行后處理。獲得20.2g(85％)白色泡沫狀的化合物14。TLC正庚烷/乙酸乙酯(2∶1)，Rf＝0.3，MS(M+Li)+＝2669，計(jì)算值C161H177N3O30Si，M＝2662.26。化合物15的合成將30.0g三唑溶于800ml干燥THF。在10℃下滴加13.5ml磷酰氯。然后滴加60ml三乙胺，將混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。過濾沉淀并用少量干燥THF洗。將濾液加到19.1g(7.2mmol)的14中。該溶液濃縮至100ml。15分鐘后，用500ml乙酸乙酯稀釋，用100ml水洗兩次。有機(jī)相經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾并濃縮。經(jīng)閃式色譜后，獲得19.0g(97％)白色泡沫狀環(huán)狀磷酸酯衍生物。TLC二氯甲烷/甲醇/33 ％ NH3(100/7/1)，Rf＝0.3.MS；(M+2Li-H)+＝2737；計(jì)算值C161H174N3O32PSi，M＝2724.22。將環(huán)狀磷酸酯溶于350ml THF，加入100ml TBAF(1M的THF溶液)。20小時(shí)后，濃縮混合物，殘余物用閃式色譜純化。獲得18.1g(99％)的白色泡沫狀的15。TLC二氯甲烷/甲醇/33 ％ NH3(100/7/1)，Rf＝0.3(與原料的展開條件相同)，(M+2Li-H)+＝2622；計(jì)算值C155H162N3O32P，M＝2609.96。化合物16的合成將14g亞磷酸用吡啶濃縮四次，然后加到200ml干燥吡啶中，在10℃滴加新戊酰氯16ml。使該反應(yīng)溶液在室溫放置15分鐘。將18.1g(6.9mmol)的15加到上述反應(yīng)溶液中。1小時(shí)后，用200ml甲苯和150ml二氯甲烷/甲醇/33％NH3(30/10/3)。濃縮后，用甲苯將殘余吡啶蒸除三次。將殘余物懸浮在200ml二氯甲烷/甲醇(20∶1)中。過濾不溶性成分并用50ml二氯甲烷/甲醇(20∶1)洗。濾液濃縮并經(jīng)閃式色譜純化。獲得16.9(91％)的保護(hù)終產(chǎn)物。TLC二氯甲烷/甲醇/33 ％ NH3(100/7/1)，Rf＝0.25。MS(M+3Li-2H)+＝2691；計(jì)算值C155H163N3O34P2，M＝2673.94。為脫保護(hù)，在-78℃下，將600ml氨冷凝。在其中溶入4.7g(204mmol)鈉。該溶液用300ml干燥THF稀釋，然后在-78℃的反應(yīng)溫度下，緩慢滴加16.9g(6.3mmol)保護(hù)的終產(chǎn)物的100ml干燥THF溶液，反應(yīng)15分鐘后(藍(lán)色不必消失)，用10g氯化銨小心地處理反應(yīng)混合物。當(dāng)藍(lán)色消失時(shí)，該混合物小心地用100ml水和300ml甲醇稀釋。使其融化，然后濃縮至約150ml。該溶液用21二氯甲烷/甲醇/33％NH3(3/3/1)稀釋，上閃式硅膠柱(700ml的硅膠)。先用3升二氯甲烷/甲醇/33％NH3(3/3/2)，然后用3升(比率為3/3.5/3)洗脫。如果混合物進(jìn)行色譜，則用正丁醇/乙醇/水/33％NH3(2/2/2/1)洗脫產(chǎn)物。獲得5.5g(78％)白色固體狀的16。TLC(2/2/2/1)，Rf＝0.4.MS(M+H)+＝1116.5；計(jì)算值C36H63NO34P2，M＝1115.83.31P-NMR(D2O)σ＝16.3ppm(環(huán)磷酸酯)和7.9(H-磷酸酯)。
實(shí)施例2類似于實(shí)施例1的方法制備混合物A、C、D、E、F、G、H和I。表1顯示結(jié)構(gòu)式、實(shí)驗(yàn)式和質(zhì)譜。
化合物 實(shí)驗(yàn)式 質(zhì)譜(M+H)+C36H63NO34P21116.5
C36H63NO34P21116.5
化合物 實(shí)驗(yàn)式 質(zhì)譜(M+H)+C36H63NO33P2S 1132.7
C36H65NO35P21134.4
化合物實(shí)驗(yàn)式 質(zhì)譜(M+H)+C40H75N3O40P41362.8
C36H65NO35P21134.4
化合物 實(shí)驗(yàn)式 質(zhì)譜(M+H)+C18H33NO19P2630.3
C18H34NO17P568.2
化合物實(shí)驗(yàn)式 質(zhì)譜(M+H)+
實(shí)施例3藥物活性借助由大鼠分離的脂肪細(xì)胞測(cè)定本發(fā)明式I化合物的生物活性。由大鼠制備脂肪細(xì)胞的過程如下用膠原酶消化付睪的白色脂肪組織(Wistar大鼠，160-180g，未禁食)，所得分離的脂肪細(xì)胞通過過濾出未消化的組織得以分離并用Krebs-Ringer-Henseleit緩沖液(KRH緩沖液)將其懸浮洗滌數(shù)次。A)脂肪形成該試驗(yàn)測(cè)定葡萄糖向甲苯可溶性產(chǎn)物(甘油三酯、磷脂、脂肪酸)的胰島素可刺激性轉(zhuǎn)化，該轉(zhuǎn)化促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和甘油三酯(甘油-3-P合成，酯化)/磷脂/脂肪酸合成(包括胰島素信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián))。在試驗(yàn)中，葡萄糖的濃度為2.5mM，酯化反應(yīng)(不是包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的甘油-3-P合成)是刺激脂肪形成的定速反應(yīng)。
在胰島素(10ng/ml)或本發(fā)明的式I化合物存在或不存在條件下，將200微升(3×105細(xì)胞/ml)KRH緩沖液中的的大鼠脂肪細(xì)胞與100微升D-[3-3H]葡萄糖(25mM，0.4μCi)在37℃培養(yǎng)90分鐘(終體積1ml)。通過加入甲苯可溶的閃爍合劑(10ml)使細(xì)胞破裂，將脂質(zhì)從水溶性產(chǎn)物和保溫介質(zhì)中分離出來。分層后，無需除去水相即可直接用閃爍測(cè)定法測(cè)定結(jié)合于脂質(zhì)產(chǎn)物中的放射性([3H][dpm×10-3])。將該放射性值減去對(duì)照值(在相同條件下保溫，但不加細(xì)胞)。至120分鐘脂肪形成率都是線性的。最大刺激因子(與胰島素保溫的結(jié)果和未與胰島素保溫的結(jié)果的比率)定為100％。“％Insmax”下的百分?jǐn)?shù)是以此定義的最大刺激因子的部分。EC50表示通過觀察各種式I化合物獲得的50％最大刺激時(shí)的式I化合物的濃度。B)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)將100微升KRH緩沖液中的大鼠脂肪細(xì)胞(滴度5×105細(xì)胞/ml)與胰島素或本發(fā)明的式I化合物在37℃輕輕振搖下培養(yǎng)15分鐘。加入15微升2-[3H]-脫氧葡萄糖(0.3mM，0.2μCi)后，在室溫繼續(xù)培養(yǎng)。在一定時(shí)間(0-20分鐘)后，取出100微升該試驗(yàn)液并將其轉(zhuǎn)入一反應(yīng)容器中(有400微升內(nèi)容物)，該容器中有起初加入的250微升鄰苯二甲酸二壬酯。離心(15000xg，1分鐘)后，在油層下通過切取油層水平管(tube)從培養(yǎng)基的油層分離出細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到閃爍容器中。加入5ml水溶性閃爍液體后，測(cè)定放射性。將總的細(xì)胞相關(guān)的放射性減去對(duì)照值(在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑細(xì)胞松弛素B存在下培養(yǎng))進(jìn)行[3H]-脫氧葡萄糖校正，[3H]-脫氧葡萄糖是被動(dòng)釋放到細(xì)胞中的并存在于細(xì)胞間隙中。直至15分鐘起初的(刺激的)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率都是線性的。最大刺激因數(shù)是有胰島素的培養(yǎng)結(jié)果與沒有胰島素的培養(yǎng)結(jié)果的比率，設(shè)為100％。
權(quán)利要求
1.式I的化合物A-Z-R(I)和/或式I化合物的生理可耐受鹽和/或立體異構(gòu)體形式的式I化合物，其中A是基團(tuán)1)H-P(O)(OH)-，2)H-P(S)(OH)-，3)HO-P(S)(OH)-，4)HS-P(S)(OH)-，5)(C1-C4)-烷基-P(O)(OH)-，6)(C1-C4)-烷基-P(S)(OH)-，7)S(O)2(OR1)-，8)S(O)(OR1)-，9)NH2-C(O)-，10)R1R2N-，11)R1R2N-C(O)-NH-，12)R1O-SO2-NH-，13)(C1-C4)-烷基-SO2-，14)(C1-C4)-烷基-S(O)-或15)R1-S-其中R1和R2彼此獨(dú)立地是氫或(C1-C4)-烷基，Z是1)2-6個(gè)糖基，2)被下述基團(tuán)彼此獨(dú)立地單至六取代的2-6個(gè)糖基，所述取代基是2.1甲基，2.2 糖基，2.3 二糖基，2.4 -SO2-OH，2.5 -C(O)-NR1R2，2.6 -C(O)-(C1-C4)-烷基，2.7 -P(O)(H)OH，2.8 -P(O)(OH)2，2.9 -P(S)(H)OH，2.10-P(S)(OH)2，2.11-P(S)(SH)(OH)，2.12-P(O)(OH)-O-CH2-CH2-NR1R2或2.13 2-6個(gè)糖基間的配糖鍵被-CH2-或-S-替代一至六次，且其中R1和R2彼此獨(dú)立地是氫或(C1-C4)-烷基，R是1)肌醇，2)肌醇磷酸酯，3)肌醇硫代磷酸酯，4)肌醇環(huán)磷酸酯，5)肌醇環(huán)硫代磷酸酯，6)被下述基團(tuán)彼此獨(dú)立地單或二取代的R2)至5)下定義的基團(tuán)，所述取代基是6.1 磷酸(酯)基或6.2硫代磷酸(酯)基，7)被下述基團(tuán)單取代的R2)至5)下定義的基團(tuán)，所述取代基是7.1 環(huán)磷酸(酯)基或7.2 環(huán)硫化磷酸(酯)基，8)肌醇，其中兩個(gè)相鄰的OH基被下述取代基取代，所述取代基是8.1 -CH2-SO2-NH-
2.權(quán)利要求1的式I化合物，其中A是 1)H-P(O)(OH)-，2)S(O)2(OR1)-或3)NH-C(O)-，Z是1)源于下述糖的2-6個(gè)糖基，所述糖是1.1 甘露糖，1.2 葡萄糖，1.3 葡糖酸，1.4 半乳糖酸，1.5 甘露糖酸，1.6 葡糖胺，1.7 果糖或1.8 半乳糖，2)源于Z 1.1至1.8下定義的并且被下述取代基彼此獨(dú)立地單至六取代的2-6個(gè)糖基，所述取代基是2.1 甲基，2.2 甘露糖，2.3 葡糖胺，2.4 二甘露糖，2.5 甘露糖-葡糖胺，并且兩個(gè)糖分子甘露糖和葡糖胺間的配糖鍵是介于兩個(gè)糖分子的1-3、1-2或1-6位碳原子之間，且R是 1)肌醇，2)肌醇磷酸酯，3)肌醇硫代磷酸酯，4)肌醇環(huán)硫代磷酸酯或5)肌醇環(huán)磷酸酯。
3.權(quán)利要求1的式I化合物，其中A是 1)H-P(O)(OH)-，Z是 1)源于下述糖的2-4個(gè)糖基，所述糖是1.1 甘露糖或1.2 葡糖胺，2)源于下述糖的2-4個(gè)糖基，所述糖是2.1 甘露糖或2.2 被甘露糖基單取代的葡糖胺，且R是 1)肌醇，2)肌醇磷酸酯，3)肌醇環(huán)磷酸酯。
4.一種制備如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)或多項(xiàng)要求的式I化合物的方法，包括由保護(hù)的糖和肌醇前體合成肌醇聚糖的步驟，然后加入基團(tuán)A，除去化合物的一種或多種臨時(shí)引入的用以保護(hù)其它功能基的保護(hù)基，如果需要，可將如此獲得式I化合物轉(zhuǎn)化為其生理可耐受性鹽。
5.一種藥物制劑，含有有效量的至少一種權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)或多項(xiàng)要求的式I化合物，所述式I化合物是溶解、無定形或結(jié)晶形式的。
6.權(quán)利要求5的藥物制劑，含有一定量的至少一種改性或未改性的胰島素或胰島素衍生物。
7.一種生產(chǎn)權(quán)利要求5或6的藥物制劑的方法，包括將將至少一種式I化合物加到有生理可接受的賦形劑的適宜給藥的劑型中，如果需要該劑型中還可加入添加劑和輔助劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中加入至少一種改性和/或未改性的胰島素或胰島素衍生物。
9.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)或多項(xiàng)要求的式I化合物或者根據(jù)權(quán)利要求4的方法獲得的式I化合物用于生產(chǎn)治療糖尿病或非胰島素依賴性糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明描述了式Ⅰ化合物A－Z－R(Ⅰ),其中A是基團(tuán)H－P(O)(OH)－,H－P(S)(OH)－,HO－P(S)(OH)－,HS－P(S)(OH)－,(C
文檔編號(hào)A61P3/10GK1184112SQ97122958
公開日1998年6月10日 申請(qǐng)日期1997年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月28日
發(fā)明者W·福里克, G·默勒 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司