專利名稱：融合表達(dá)重組制備t4核酸內(nèi)切酶v的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)和藥物領(lǐng)域，涉及通過(guò)融合表達(dá)的重組T4N5，含編碼該融合蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞，用于基因工程制備該蛋白的方法，以及該蛋白在治療疾病領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期暴露于紫外線是皮膚癌(非黑色素性)的重要發(fā)病原因，實(shí)驗(yàn)表明皮膚角朊細(xì)胞DNA的嘧啶堿基可吸收紫外線產(chǎn)生環(huán)丁烷嘧啶二聚體(5，6-Cyclobutyl dipycimidines，CPD)，造成DNA損傷。DNA損傷后細(xì)胞發(fā)生有絲分裂增殖時(shí)經(jīng)常發(fā)生突變， 從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老、癌變。因此防止紫外線輻射引起皮膚病變，對(duì)DNA的防護(hù)和修復(fù)就顯得尤為重要。T4核酸內(nèi)切酶VCMendonuclease V，簡(jiǎn)稱jMNS)是噬菌體!"4感染宿主E. coli后由基因DenV表達(dá)的一種修復(fù)酶，分子量約16000道爾頓。它能特異性地識(shí)別CPD，并在該損失部位切斷磷酸二酯鍵，從而啟動(dòng)體內(nèi)的DNA切除修復(fù)途徑。T4N5通過(guò)兩種酶活的作用方式完成對(duì)CPD位點(diǎn)的切割第一步是通過(guò)PD-DNA糖苷酶活力切割PD中的5’嘧啶與其脫氧核糖間的N-糖苷鍵形成一個(gè)脫嘧啶(AP)位點(diǎn)；第二步由AP內(nèi)切酶活力在所產(chǎn)生AP位點(diǎn)的3’端切斷磷酸二酯鍵，形成具有5-P，3’ -OH末端的單鏈缺刻。T4N5作用范圍不限于噬菌體和E. coli的DNA，在細(xì)胞內(nèi)外它也能作用于各種DNA，且特異性強(qiáng)，只針對(duì)被紫外損傷的DNA有修復(fù)作用，對(duì)正常DNA無(wú)任何切割作用。近年來(lái)，國(guó)際上已有大公司將T4N5開(kāi)發(fā)成護(hù)膚品成分和藥品。美國(guó)TPSG公司將T4N5包埋于脂質(zhì)體中，作為護(hù)膚產(chǎn)品的主要成分； 美國(guó)AGI公司開(kāi)發(fā)的T4N5脂質(zhì)體藥品已在皮膚癌的預(yù)防和治療中進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道T4N5的基因工程制備，其工藝主要包括1、用基因克隆方法，將 T4N5基因構(gòu)建到重組質(zhì)粒，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株；2、篩選高表達(dá)工程菌株，誘導(dǎo)表達(dá)；3、收集菌體破菌，離心去除沉淀，上清分別經(jīng)過(guò)離子柱、疏水柱、DNA親合柱等層析， 獲得純品。Yusaku Nakabeppu 等(THE J0URNA0LF BIOLOGICALC HEMISTRY, Vol.257, No. 5，Issueof March 10, Pages 2556-2562，198 經(jīng)過(guò)抽提、萃取、CM S印hadex 層析、 Bio-Gel-P-IO層析、Phosphocellulose層析、單鏈DNA親合柱層析，獲得的T4N5工藝復(fù)雜且Bl比 舌個(gè)生{氐。K. MHiggins 等(Mutation Research/DNA Repair Reports, Volume 183， Issue 2，Marchl987，Pages 117-121)通過(guò)破菌、單鏈DNA親合柱層析、Pharmacia PBE94層析、CM kphadex層析雖可獲得較高純度的T4N5，但回收率低，工藝無(wú)法放大。兩者采用分泌型可溶性表達(dá)T4N5，但表達(dá)量?jī)H為左右。Carol ina Alvarez Roger等(Journal of Dermatological Science (2005) 39,81-88)經(jīng)過(guò)破菌、復(fù)性、DEAE 層析、單鏈 DNA 親合柱層析，可獲得一定量的T4N5。但由于T4N5為包涵體表達(dá)，工藝中需要變性、復(fù)性步驟，而復(fù)性的T4N5存在一定量的非活性形式，并難以有效控制變性過(guò)程。已報(bào)道的T4N5純化工藝中均采用了單鏈DNA親和柱層析，該方法成本高，限制了 T4N5的規(guī)?；苽?。
T4N5的體外活性檢測(cè)采用DNA缺刻法，其原理是利用被紫外線照射的質(zhì)粒DNA的三種不同構(gòu)型在瓊脂糖凝膠電泳中遷移率不同達(dá)到測(cè)活的目的。T4N5在I型DNA的CPD位點(diǎn)造成一個(gè)缺口后，I型DNA即轉(zhuǎn)變成遷移率更低的II型質(zhì)粒DNA，如果在互補(bǔ)雙鏈上相距很近的CPD位點(diǎn)均造成缺口，II型DNA轉(zhuǎn)變成遷移率更低的III型DNA，通過(guò)觀察電泳結(jié)果中三種DNA的分布，即可獲得酶活力的定性結(jié)果，計(jì)算I型DNA減少的量，可獲得酶活力的定量結(jié)果。1個(gè)國(guó)際活性單位定義為20 μ 1反應(yīng)體系中，37°C條件下，30分鐘內(nèi)使大于95% 的Ing經(jīng)紫外線照射的超螺旋PBR322DNA變成切刻型質(zhì)粒的酶量。

發(fā)明內(nèi)容
目前T4N5以包涵體的形式表達(dá)，工藝中需要先變性再?gòu)?fù)性，制備工藝復(fù)雜，在工業(yè)生產(chǎn)中難以控制，且比活性偏低。另外有用非包涵體表達(dá)(分泌和可溶性表達(dá))T4N5 的工藝，但表達(dá)量和回收率很低，表達(dá)水平在1-2% (Expression of the bacteriophage T4denV structural genein Escherichia coli., J Bacteriol. 1986November ； 168 (2) 1014-1018)。本發(fā)明以硫氧還原蛋白(TRX)作為融合表達(dá)蛋白，將T4N5以TRX-Linker-1MNS融合表達(dá)的方式，實(shí)現(xiàn)了可溶性形式表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到30%左右。通過(guò)在TRX與T4N5之間設(shè)計(jì)不同蛋白酶酶切位點(diǎn)，能高效專一的切除并分離融合蛋白TRX，經(jīng)進(jìn)一步無(wú)需單鏈DNA親和柱純化，制備到重組T4N5，產(chǎn)率和回收率高。為了有利于表達(dá)的融合蛋白的純化，在連接肽Linker中引入6 X His標(biāo)簽。工程菌經(jīng)發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)后，加入IPTG誘導(dǎo)，然后收集菌體。在特定的破菌緩沖液中破菌后離心收集上清，上清通過(guò)M柱層析獲得融合蛋白，經(jīng)特定的蛋白酶酶切后通過(guò)反相層析、離子交換層析，制備的重組T4N5純度大于98%，酶比活性大于2. 5X106IU/mg。每100克濕菌體可獲IOOmg以上的T4N5，具有高表達(dá)、高回收率和工藝簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的內(nèi)容在于提供一種以融合方式表達(dá)的重組T4N5蛋白并進(jìn)行重組制備。 還提供了編碼所述融合表達(dá)的T4N5蛋白的DNA分子、含該DNA序列的載體以及含該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的提供一種無(wú)需復(fù)性即可的獲得生物比活性更高的重組T4N5的制備工藝。本發(fā)明的另一目的是提供一種可預(yù)防器官移植(主要是腎移植)后因長(zhǎng)期服用免疫抑制劑的皮膚癌的發(fā)生，和治療著色性干皮病(XP)、毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)(AT)、 Fanconi貧血(FA)、Bloom綜合癥(BS)等疾病和化妝品中用于修復(fù)紫外損傷DNA的重組 T4N50本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明T4N5為天然野生型結(jié)構(gòu)，由138個(gè)氨基酸組成，同時(shí)提供了其N端第一或二位氨基酸替代衍生物；2、TRX-Linker-T4N5是可溶性表達(dá)，無(wú)需復(fù)性即有生物活性，酶切后獲得的T4N5 生物活比酶切前提高10倍，達(dá)到2. 5X106IU/mg ；3、Linker含有6XHis標(biāo)簽，此標(biāo)簽由4-10個(gè)組氨酸串聯(lián)起來(lái)。該標(biāo)簽有利于破菌后目的蛋白純化和酶切后含標(biāo)簽的TRX和T4N5分離。制備工藝通過(guò)M螯合層析、蛋白酶切、反相層析和離子柱層析，重組T4N5蛋白純度達(dá)到98%，回收率大于60%。本工藝簡(jiǎn)單高效，成本低，適用于規(guī)?；a(chǎn)。發(fā)明概述在本發(fā)明的第一方面，提供了一種融合表達(dá)重組T4N5蛋白的上游構(gòu)建體系，它包括通過(guò)與TRX融合表達(dá)重組T4N5。更具體的，該融合蛋白中包含不同的連接肽(Linker)， 在Linker中設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)簽。特定的蛋白酶酶切位點(diǎn)是腸激酶酶切位點(diǎn) Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DDDDK)，或凝血酶酶切位點(diǎn) Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (LVPRGS)，或煙草蝕紋病毒蛋白酶酶切位點(diǎn)Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)。還提供了所述 T4N5的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)，以及N端第一位或二位氨基酸被替代的衍生物序列，包含Met替代成Gly、MetThr替代成Gly Ser0在本發(fā)明的第二方面，提供了編碼本發(fā)明上述的T4N5蛋白(氨基酸序列為SEQ IDNO 1)的 cDNA 序列(SEQ ID NO :2)。在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的載體，以及構(gòu)建該表達(dá)載體的方法。在本發(fā)明的第四方面，提供了包含上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞以及可能的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種重組產(chǎn)生本發(fā)明融合表達(dá)T4N5蛋白的方法，它包括以下步驟在適合表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，表達(dá)出所述的融合蛋白，分離純化所述的融合蛋白的方法。至此已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，參照以下實(shí)例能夠?qū)χ懈宄睦斫猓鰧?shí)例僅為說(shuō)明目的而并不旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。


圖1 重組質(zhì)粒pET-32a_T4N5構(gòu)建示意2 :pET32-T改造質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程示意3 重組質(zhì)粒pET32-T-T4N5構(gòu)建示意4 重組質(zhì)粒pET32-T和ρΕΤβΖ-Τ- ^Νδ雙酶切驗(yàn)證瓊脂糖電泳分析圖，其中，1 pET32a 經(jīng) XbaI 和 KpnI 雙酶切；2 :TRX_6XHis PCR 片段；3 :pET32_T 經(jīng) XbaI 和 KpnI 雙酶切；4 :pET32-T-T4N5 經(jīng) XbaI 和 KpnI 雙酶切；5 :pET32a-T_T4N5 經(jīng) KpnI 和 HindIII 雙酶切； M =DNA Marker，從下往上依次為 100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp圖5 :TRX-EK-T4N5融合表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析圖，其中，1 誘導(dǎo)前；2 誘導(dǎo)后； M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從下往上依次為14. 4KD、20KDJ6KD、33KD、45KD、66. 2KD、94KD圖6 :TRX-T-T4N5融合蛋白Ni柱層析SDS-PAGE電泳分析圖，其中，1 =Ni柱上樣； 2 =Ni柱穿透峰；3 :20mM咪唑洗脫峰；4 :200mM咪唑洗脫峰；M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)圖7 :TRX-T-T4N5經(jīng)凝血酶酶切后的C18反相HPLC分析圖，其中，峰1為GS-T4N5 ； 峰 2 為 TRX-Linker圖8 融合蛋白和T4N5分別經(jīng)過(guò)Ni柱和SP柱純化后的SDS-PAGE電泳分析圖，其中，1、M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 :TRX-T-T4N5 ；3 :TRX-EK-T4N5 ；4 :GS-T4N5 ；5 :T4N具體實(shí)施例方式
實(shí)例1融合蛋白TRX-EK-T4N5重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及制備方法在本實(shí)施例中，所涉及的融合蛋白具有TRX-EK-T4N5結(jié)構(gòu)，EK為含腸激酶酶切位點(diǎn)DDDDK的連接肽，T4N5氨基酸序列為SEQ ID NO 1。該序列的cDNA堿基序列(SEQ IDNO 2)采用全基因人工合成后，嵌入pMD-18質(zhì)粒中經(jīng)DNA測(cè)序分析合成序列與設(shè)計(jì)序列完全一致，用于以下重組質(zhì)粒的構(gòu)建，命名為PMD18-T4N5。1. lpET-32a-T4N5 重組質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)附圖1的構(gòu)建示意圖設(shè)計(jì)并合成1對(duì)引物P1、P2 Pl 5' -CGGGTACCGATGACGATGACAAGCGTATTAATCTGACCCTGGTG-3' (SEQ ID NO 3)P2 5' -GCAAGCTTTCATTACGCATAAAT CGC TTT GCC-3‘ (SEQ ID NO 4)注P1中CG為引物保護(hù)堿基，GATGACGATGACAAG為腸激酶酶切識(shí)別位點(diǎn)DDDDK的序列，GGTACC為Kpn I酶切位點(diǎn)；P2中GC為引物保護(hù)堿基，AAGCTT為Hand III酶切位點(diǎn)， TCATTA為雙終止密碼子。以pMD18-T4N5為模板Pl和P2引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94 °C lmin， 58°C lmin, 72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)94°C變性lOmin，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸 lOmin，獲得420bpT4N5用Kpn I和Hind III雙酶切后，回收目的片段，用T4DNA連接酶與同樣經(jīng)KpnI和Hind III雙酶切回收的質(zhì)粒pET_32a(+)(購(gòu)于hvitrogen)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌ToplOF'。陽(yáng)性克隆經(jīng)雙酶切鑒定和cDNA測(cè)序分析正確后，其重組質(zhì)粒命名為pET-3h-T4N5，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami DE3 (Novagen)，經(jīng)表達(dá)篩選高效表達(dá) TRX-EK-T4N5融合蛋白菌種，保存并命名為pET3h_T4N5/0rigami DE3。1. 2TRX-EK-T4N5 融合表達(dá)將表達(dá)最佳表達(dá)菌株劃線接種于LA瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。從過(guò)夜培養(yǎng)的LA 平板上挑取菌苔接種于含LB液體培養(yǎng)基試管中，30°C培養(yǎng)12小時(shí)，然后按的比例轉(zhuǎn)接到含200mL LB培養(yǎng)液的IOOOmL三角瓶中，30°C培養(yǎng)過(guò)夜即成為上罐種子液。將上罐種子液按5%的比例接種于含YT培養(yǎng)液的30L發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)，整過(guò)發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通空氣量、通純氧量來(lái)保持溶氧在30%以上，用觀％的氨水調(diào)節(jié)pH并維持在7. O。至菌液0D600 = 10 12時(shí)，加入終濃度為0. 3mMol/L IPTG，同時(shí)下調(diào)溫度為^°C，繼續(xù)培養(yǎng) 4小時(shí)后停止發(fā)酵，收集菌液，SOOOrpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體放入_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?.3重組T4N5的制備從_20°C冰箱中取出菌體，放入細(xì)菌裂解液(50mMol/L Tris-HCl、2mMol/L EDTA, PH10. 0)中溶解菌體，37°C下攪拌1小時(shí)后加入終濃度為5 μ g/ml的DNase I酶作用3小時(shí)至鏡檢完全破菌，12000rpm離心10分鐘，棄沉淀，收集上清。粗純化將收集的上清通過(guò)Ni親合純化回收融合蛋白TRX-EK-T4N5，平衡液條件為 20mMol/L Tris、200mMol/L NaCl、PH9. 50，洗脫液條件為 20mMol/L Tris、200mMol/L 咪唑、200mMol/L NaCl、PH9. 50 ；洗脫的目的蛋白在透析液 QOmMol/L Tris_HCl、PH9. 0)中透析過(guò)夜。融合蛋白(TRX-EK-T4N5)酶切取透析后的融合蛋白，加入按質(zhì)量比1 200的腸激酶(EK，購(gòu)于Novagen)，于4°C攪拌酶切12小時(shí)，酶切效率不低于90%。
精純化酶切后的樣品經(jīng)反相(Waters公司C18柱)層析純化，流動(dòng)相A液條件為 0. 三氟乙酸和5%乙腈，流動(dòng)相B液條件為0. 三氟乙酸和95%乙腈，流速5ml/min、 0-100% B線性洗脫，收集含T4N5的洗脫峰。該洗脫峰再進(jìn)行陽(yáng)離子交換(SP Sepharose FF)層析，平衡液條件為 20mMol/L NaAC PH3. 00，洗脫液 20mMol/L Na2HP04、PH9. 50，獲得重組jMNS蛋白，純度大于98. 0 %。實(shí)例2融合蛋白TRX-T-T4N5重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和制備方法在本實(shí)施例中，所涉及的融合蛋白具有TRX-T-T4N5結(jié)構(gòu)。T為含凝血酶酶切位點(diǎn)LVPRGS的連接肽，T4N5為序列SEQ ID NO 1的N端的衍生物即Gly Ser T4N5 (以下稱GS-T4N5)。為實(shí)現(xiàn)此融合蛋白表達(dá)TRX-T-T4N5的表達(dá)，對(duì)pET-32a(+)質(zhì)粒中從 Thrombinrecognition site+S*Tag的序列用PCR方法切除后改造。2. lpET-32a(+)質(zhì)粒改造根據(jù)附圖2構(gòu)建示意圖設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物P3、P4 P3 5' -CTCTAGAAATAATTTTGTTTAA-3‘ (SEQ ID NO 5)P4 5' -CGGTACCACCAGAAGAATGATG-3‘ (SEQ ID NO 6)注P3中C為引物保護(hù)堿基，TCTAGA為)(ba I酶切位點(diǎn)；P4中C為引物保護(hù)堿基， GGTACC為Kpn I酶切位點(diǎn)。具體實(shí)驗(yàn)方法pET_3h⑴質(zhì)粒經(jīng))(ba I和Kpn I雙酶切后分別回收小片段 TRX-6XHis-thrombin-S · Tag和質(zhì)粒大片段。以小片段為模板，用引物P3和P4通過(guò)PCR 擴(kuò)增無(wú) Tlirombin-s. Tag 序列的 TRX-6 XHis 片段。PCR 反應(yīng)條件為94°C lmin,56°C lmin, 72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)94°C變性lOmin，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin。獲得的400bp TRX-6XHis的DNA片段產(chǎn)物，用)(ba I和Kpn I雙酶切并用低熔點(diǎn)瓊脂糖回收此片段后，用iMDNA連接酶與同樣經(jīng))(ba I和Kpn I雙酶切pET_32a (+)回收大片段MOObp連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌ToplOF'。陽(yáng)性克隆經(jīng)雙酶切鑒定，改造后質(zhì)粒命名為PET32-T。2. 2Trx-T-T4N5 重組質(zhì)粒構(gòu)建用實(shí)例1中pMD-T4N5質(zhì)粒做模板，根據(jù)附圖3構(gòu)建示意圖設(shè)計(jì)并合成以下一對(duì)引物P5禾口 P6。P5 5' -CGGGTACCCTGGTGCCACGCGGTTCTCGTATTAATCTGACCCTGGTG-3' (SEQID NO 7)P6 5' -CG AAGCTTTCATTACGCATAAATCGCTTTGCC-3‘ (SEQ ID NO 8)注P5中CG為引物保護(hù)堿基，CTG GTG CCA CGC GGT TCT為凝血酶酶切識(shí)別位點(diǎn) LVPRGS的序列，GGTACC為Kpn I酶切位點(diǎn)，CGT ATT為編碼GlySer的堿基序列；P6中GC為引物保護(hù)堿基，AAGCTT為Hand III酶切位點(diǎn)，TCATAA為雙終止密碼子PCR 反應(yīng)條件為94°C lmin, 56°C lmin, 72V lmin,共 30 個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán) 94°C 變性lOmin，最后一個(gè)循環(huán)72°C延伸lOmin。獲得含GS-T4N5和凝血酶酶切位點(diǎn)的DNA片段，大小為420bp。經(jīng)Kpn I和Hind III雙酶切和低熔點(diǎn)瓊脂糖回收此片段，用T4DNA連接酶與經(jīng)Kpn I和Hind III雙酶切回收的改造質(zhì)粒pET3h-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆宿主菌ToplOF'。陽(yáng)性克隆用雙酶切驗(yàn)證和DNA測(cè)序分析正確后，命名為pET32-T-T4N5。轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌Origami DE3 (Novagen)，表達(dá)篩選高表達(dá)Trx-T_T4N5含目的蛋白的菌種，將重組表達(dá)質(zhì)粒保存并命名為pET32-T-T4N5/0rigami DE3。
2. 3TRX-T-T4N5 融合表達(dá)將pET32-T-T4N5/0rigami DE3菌株劃線接種于LA瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。從過(guò)夜培養(yǎng)的LA平板上挑取菌苔接種于含LB液體培養(yǎng)基試管中，30°C培養(yǎng)12小時(shí)，然后按
的比例轉(zhuǎn)接到含200mL LB培養(yǎng)液的IOOOmL三角瓶中，30°C培養(yǎng)過(guò)夜即成為上罐種子液。將上罐種子液按5%的比例接種于含YT培養(yǎng)液的30L發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)，整過(guò)發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通空氣量、通純氧量來(lái)保持溶氧在30%以上，用的氨水調(diào)節(jié)pH 并維持在7. 0。至菌液0D600 = 10 12時(shí)，加入終濃度為0. 3mMol/L IPTG，同時(shí)下調(diào)溫度為，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后停止發(fā)酵，收集菌液，SOOOrpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體放入-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 4 重組 GS-T4N5 的制備從_20°C冰箱中取出菌體，放入細(xì)菌裂解液(50mMol/LTris-HCl、2mMol/LEDTA、 PH10. 0)中溶解菌體，37°C下攪拌1小時(shí)后加入終濃度為5 μ g/ml的DNase I酶作用3小時(shí)，鏡檢完全破菌后12000rpm離心10分鐘，棄沉淀，收集上清。粗純化將收集的上清通過(guò)Ni螯合層析獲得融合蛋白TRX-thrombin-T4N5，平衡液條件為 20mMol/L Tris、200mMol/L NaCl、PH9. 50，洗脫液條件為 20mMol/L Tris、 200mMol/L咪唑、200mMol/L NaCl、PH9. 50 ；洗脫的目的蛋白在透析液 OOmMol/L Tris-HCl, PH9. 0)中透析過(guò)夜。融合蛋白(TRX-T-T4N5)凝血酶(thrombin)酶切取透析后的融合蛋白，調(diào)整蛋白濃度為細(xì)g/ml，加入2單位/ml人凝血酶(購(gòu)于中檢所)于4°C攪拌酶切12小時(shí)，酶切效率不低于90%。精純化酶切后的樣品經(jīng)反相(Waters公司C18柱)層析純化，流動(dòng)相A液為0. 1% 三氟乙酸和5 %乙腈，流動(dòng)相B液為0. 1 %三氟乙酸和95 %乙腈，流速5ml/min、0-100 % B線性洗脫，收集含有GS-T4N5第一個(gè)洗脫峰。該洗脫峰再進(jìn)行陽(yáng)離子交換(SP Sepharose FF) 層析，平衡液條件為20mMol/L NaAC PH3. 00，洗脫液條件為20mMol/L Na2HP04PH9. 50，獲得的重組GS-T4N5蛋白純度大于98. 0%。實(shí)例3重組T4N5體外DNA修復(fù)活性測(cè)定采用DNA缺刻法。取200ng的PBR322質(zhì)粒于EP管中，2M λ UV照射5分鐘后， 每管加入不同量(8ng、4ng、2ng、lng、0. 5ng、0. 25ng)的T4N5樣品。反應(yīng)體系為25mMol/ LNa2PO4UOOmMo 1/L NaClUmMol/L EDTAUmMo 1/L DTTU00ug/ml BSA，反應(yīng)總體積 20ul，37 度反應(yīng)30分鐘后進(jìn)行瓊脂糖電泳。電泳結(jié)束后凝膠成像定量分析I型DNA減少的總量，并計(jì)算出其抖陽(yáng)的酶比活性。同時(shí)，用T4N5活性標(biāo)準(zhǔn)品(NEB公司)作對(duì)照。TRX-T-T4N5和 TRX-EK-T4N5均表現(xiàn)出較強(qiáng)的DNA修復(fù)活性，說(shuō)明本工藝中可溶性表達(dá)的含T4N5融合蛋白是活性形式。經(jīng)重組制備的T4N5和N末端替代衍生物GS-T4N5具有相同的DNA修復(fù)活性， 達(dá)2. OX IO6以上，明顯高于T4N5活性標(biāo)準(zhǔn)品的比活性。表IDNA修復(fù)比活性結(jié)果(三次平均值)
權(quán)利要求
1.一種在大腸桿菌中可溶性融合表達(dá)和重組制備T4核酸內(nèi)切酶V(T4NO的方法，其特征在于融合表達(dá)方式為TRX-Linker-T4N5，融合蛋白為硫氧還原蛋白(TRX)，TRX位于氨基端，T4N5位于羧基端，中間由連接肽Linker相連。
2.權(quán)利要求1中所述T4N5氨基酸序列為SEQID NO :1。
3.權(quán)利要求1中所述的連接肽(Linker)中含有專一性的蛋白酶酶切位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求3中所述蛋白酶酶切位點(diǎn)為腸激酶酶切位點(diǎn)DDDDK，或凝血酶酶切位點(diǎn) LVPRGS,或煙草蝕紋病毒蛋白酶酶切位點(diǎn)ENLYFQG。
5.權(quán)利要求1、3中所述連接肽Linker中含有位于蛋白酶酶切位點(diǎn)前的組氨酸標(biāo)簽序列，該序列由4-10個(gè)組氨酸串聯(lián)。
6.權(quán)利要求2中所述序列SEQID NO 1的N端第一位氨基酸Met可由Gly取代，其專一性蛋白酶酶切位點(diǎn)優(yōu)選煙草蝕紋病毒蛋白酶酶切位點(diǎn)。
7.權(quán)利要求2中所述序列SEQID NO :1的N端第一位和第二位氨基酸Met Thr可由 Gly Ser取代，其專一性蛋白酶酶切位點(diǎn)優(yōu)選用凝血酶酶切位點(diǎn)。
8.權(quán)利要求1中所述的重組制備T4N5的方法包括(1)構(gòu)建含編碼TRX-Linker-T4N5的cDNA序列的重組質(zhì)粒；(2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得可溶性表達(dá)TRX-Linker-T4N5的融合蛋白的菌株，優(yōu)選大腸桿菌菌株Origami DE3 ；(3)表達(dá)菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)，可溶性表達(dá)TRX-Linker-T4N5；(4)表達(dá)菌體經(jīng)破菌、Ni親合層析、蛋白酶切、反相層析、離子層析等步驟，獲得高純度的重組jMNS蛋白。
9.權(quán)利要求8所述的重組制備的T4N5具有更高的DNA修復(fù)活性，可用于DNA修復(fù)的藥物、工具酶和護(hù)膚品的光修復(fù)成分。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種在大腸桿菌中利用融合可溶性表達(dá)重組制備T4核酸內(nèi)切酶V(T4N5)的方法，其中包含融合表達(dá)的重組質(zhì)粒和專一性蛋白酶酶切位點(diǎn)，以及重組制備中無(wú)需復(fù)性的純化工藝。經(jīng)本發(fā)明制備的重組T4核酸內(nèi)切酶V純度高，對(duì)因紫外照射造成損傷的DNA有強(qiáng)修復(fù)功能。
文檔編號(hào)A61K8/66GK102465146SQ201010552859
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者曹宇, 楊黎, 章偉韜, 范開(kāi), 陳勇, 陳海容 申請(qǐng)人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司