專利名稱：：修飾的腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)物疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及化學(xué)修飾的B類腦膜炎萘瑟球菌(Neisseriameningitidis)多糖。本發(fā)明還提供了疫苗，在該疫苗中各個(gè)修飾的多糖被偶聯(lián)于蛋白質(zhì)載體等。
背景技術(shù)：
：由B類腦膜炎萘瑟球菌和大腸桿菌K1造成的腦膜炎仍然是世界上主要的健康問題。B類腦膜炎有地方性和流行性兩種，它約占所有腦膜炎(雙)球菌腦膜炎記錄病例的一半，而K1陽性大腸桿菌是新生兒腦膜炎的主要病因。目前還沒有市售的、針對B類腦膜炎球菌和大腸桿菌K1所造成疾病的疫苗。這主要是因?yàn)锽類腦膜炎球菌多糖(groupBmeningococcalpolysaccharide，GBMP)在人中僅有弱免疫原性。天然GBMP的弱免疫原性以及會導(dǎo)致免疫耐受性，被假設(shè)為是因?yàn)樵谌撕蛣?dòng)物組織中存在共同的表位。有幾種最近報(bào)道的候選疫苗，這些疫苗以具有外膜蛋白的GBMP復(fù)合物為基礎(chǔ)，但是到目前為止還沒有證據(jù)表明它們在人中是有效的。最近，發(fā)展了一種新的疫苗概念，這種疫苗以人工化學(xué)修飾的(N-丙?；?B類多糖-蛋白質(zhì)(N-Pr-GBMP-蛋白質(zhì))偶聯(lián)物(或稱綴合物，conjugate)為基礎(chǔ)。該疫苗在小鼠中誘導(dǎo)高效價(jià)的IgG抗體，這些抗體不僅起保護(hù)作用，而且可與未修飾的GBMP(即N-乙?；?GBMP)交叉反應(yīng)。這一概念在1988年2月23日授予HaroldJ.Jennings等人的美國專利No.4,727,136中有描述并提出了權(quán)利要求。已有這樣的暗示，導(dǎo)致產(chǎn)生交叉反應(yīng)性抗體的疫苗(如在美國專利No.4,727,136中所描述的)只能在破壞免疫耐受性的情況下獲得成功。由于在天然的N-Ac-GBMP及人和動(dòng)物的組織兩者中都鑒別出一共同的表位(Jennings，Contrib.Microbiol.Immunol.，Basel，Karger，1989，Vol.10，151-165)，該表位由α-(2-8)-連接的唾液酸殘基鏈(最低要求為10個(gè)殘基)構(gòu)成，所以使這種假設(shè)得以成立。這些多唾液酰基鏈(polysialosylchain)的功能是作為發(fā)育抗原，而且最主要地是與胎兒階段的胚胎神經(jīng)細(xì)胞粘附相關(guān)(Finne等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1983，112，482)。在出生后的成熟過程中，該抗原是負(fù)調(diào)控的(friedlander等人，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)，1985，101，412)，但是在成熟的人中在得病肌肉的再生期間(Cashman等人，Ann.Neuron.，987，21，48)、在腫瘤細(xì)胞中(Roth等人，美國科學(xué)院院報(bào)，1988，85，299)以及在天然殺傷細(xì)胞(NK)和CD3+T細(xì)胞中(Husmann等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)，1989，19，1761)是表達(dá)的。盡管破壞對這些胎兒抗原的耐受性的后果還不清楚，但是需要開發(fā)出對人表位有更低免疫原性的疫苗。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是開發(fā)修飾的B類腦膜炎球菌多糖，它有免疫原性并可誘導(dǎo)出對宿主天然表位的交叉反應(yīng)性更低的抗體。本發(fā)明的另一目的是提供包含這些修飾多糖的多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。本發(fā)明的另一目的是提供具有免疫原性的疫苗，它與GBMP的交叉反應(yīng)性大大下降。發(fā)明概述本發(fā)明主要提供化學(xué)修飾的B類腦膜炎萘瑟球菌多糖。本發(fā)明還提供了疫苗，在該疫苗中各個(gè)修飾的多糖被偶聯(lián)于蛋白質(zhì)載體。具體地，本發(fā)明提供了不飽和的B類腦膜炎萘瑟球菌N-?；苌嗵?，共價(jià)連于蛋白質(zhì)的不飽和N-?；苌嗵桥悸?lián)物，含有腦膜炎萘瑟球菌不飽和N-?；苌嗵堑呐悸?lián)物分子的藥物組合物，以及這些組合物作為疫苗的用途。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種修飾的B類腦膜炎萘瑟球菌多糖，其唾液酸殘基的N-乙?；?C2)被不飽和的C3-4?；〈?。另一方面，提供了一種抗原偶聯(lián)物，它包含偶聯(lián)于免疫學(xué)上合適的蛋白質(zhì)的、不飽和C2-4N-?；苌嗵?，并且與天然多糖相比具有更高的免疫原性和對交叉反應(yīng)抗體的誘導(dǎo)性更低。在另一方面，提供了一種疫苗，它含有不飽和的N-?；苌嗵?蛋白質(zhì)偶聯(lián)物以及合適的載體或稀釋劑。本發(fā)明的疫苗還可含有治療有效量的適用于人體的佐劑，如磷酸鋁、氫氧化鋁或硬脂?；野彼帷Ｔ诹硪环矫?，提供了一種使哺乳動(dòng)物對腦膜炎萘瑟球菌和大腸桿菌K1感染產(chǎn)生免疫的方法，該方法包括給可能受到這種感染的哺乳動(dòng)物(包括人)腸胃外施用免疫有效量的本發(fā)明疫苗。疫苗的典型給藥量為約1-50微克/千克體重，例如5-25微克/千克體重。在另一方面，本發(fā)明提供了能夠防止B類腦膜炎萘瑟球菌和大腸桿菌K1造成的腦膜炎的血清和γ-球蛋白組份。該組份的產(chǎn)生是通過用本發(fā)明的疫苗免疫一哺乳動(dòng)物，然后最好將γ-球蛋白組份從免疫血清中分離出來。接著可將該組份施用于個(gè)體，以防止由上述生物體造成的感染或者治療正發(fā)生的感染。根據(jù)這一點(diǎn)，并考慮到其有利的免疫原性和對GBMP交叉反應(yīng)抗體的最低誘導(dǎo)性，就會理解本發(fā)明的免疫原性疫苗偶聯(lián)物是治療用抗血清的來源。本發(fā)明的偶聯(lián)物還可用于產(chǎn)生單克隆抗體，而且還可產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。我們發(fā)現(xiàn)，用上述授予Jennings等人的美國專利4,727,136中所描述的N-Pr-GBMP-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物所誘導(dǎo)出的絕大多數(shù)殺菌保護(hù)性抗體，與GBMP交叉反應(yīng)抗體并不相關(guān)。事實(shí)上，絕大部分保護(hù)活性屬于一個(gè)并不與GBMP交叉反應(yīng)的N-Pr-GBMP-特異性抗體群。考慮到這一點(diǎn)，人們認(rèn)為N-Pr-GBMP模擬了B類腦膜炎球菌表面的一個(gè)獨(dú)特的殺菌表位。本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)可以合成化學(xué)修飾的GBMP，這種化學(xué)修飾的GBMP模擬殺菌表位并且當(dāng)處于偶聯(lián)形式時(shí)，不僅表現(xiàn)出更高的免疫原性而且還基本上避免了誘導(dǎo)與GBMP交叉反應(yīng)的抗體的情況。在完成本發(fā)明的過程中，已合成了不同的化學(xué)修飾的GBMP，并將其各自偶聯(lián)于蛋白質(zhì)，然后將偶聯(lián)物注射入小鼠，將效果與N-Pr-GBMP蛋白質(zhì)偶聯(lián)物產(chǎn)生的效果相比較。出人意料的是，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)在N-?；写嬖诓伙柡玩I尤其會產(chǎn)生免疫原性偶聯(lián)物。通過研讀下面本發(fā)明具體實(shí)施例的詳細(xì)描述，可以更好地理解本發(fā)明的這些特征和其他特征。本發(fā)明的范圍只受所附權(quán)利要求書的限定。發(fā)明詳述本發(fā)明總體而言提供了新的B類腦膜炎萘瑟球菌不飽和N-?；苌嗵?，新的B類不飽和N-酰基衍生物的偶聯(lián)物，含有共價(jià)連于蛋白質(zhì)的B類腦膜炎萘瑟球菌不飽和N-酰基衍生多糖片段的偶聯(lián)物分子的藥物組合物，以及這些組合物作為疫苗的用途。本發(fā)明涉及式(I)的B類腦膜炎萘瑟球菌不飽和N-酰基衍生多糖其中，R1是含有至少一個(gè)雙鍵的C2-C4不飽和烷基。在本發(fā)明的一個(gè)例子中，式I的R1有3或4個(gè)碳原子，而且有兩個(gè)非相鄰雙鍵。在本發(fā)明的另一例子中，式I的R1是2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)碳原子，而且距?；荚幼钸h(yuǎn)的碳原子通過雙鍵而相連?？捎糜诒景l(fā)明式I的修飾的B類腦膜炎球菌多糖N-酰基衍生多糖的具體(但非限定性)例子包括下列N-戊烯?；?CH2＝CH-CH2-CH2-CONH-)；和N-巴豆?；?3-丁烯?；?(CH2＝CH-CH2-CONH-)B類腦膜炎球菌多糖是從腦膜炎萘瑟球菌中，用本領(lǐng)域中已知的方法分離出的。在一種這樣的方法中，B類腦膜炎球菌(981B株)是在發(fā)酵罐中于37℃生長，其中對每升蒸餾水用30克脫水ToddHewittBroth(DifcoLaboratoriesDetroit，Michigan)。在發(fā)酵生長之前，凍干的菌株先在燭式瓶(candlejar)中，于37℃，在5％(v/v)Sheeps′BloodAgar(DifcoLaboratoriesDetroit，Michigan)平板上生長。然后將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至錐形燒瓶中的1.0升ToddHewittBroth(如上)中，在37℃于190rpm下振蕩培養(yǎng)7小時(shí)。接著將接種物轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐。在發(fā)酵生長(16小時(shí))后，通過加入甲醛至終濃度為0.75％而殺死細(xì)菌。通過連續(xù)離心去除菌體，從上清液中分離出B類腦膜炎球菌多糖。然后基本上按Bundle等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，249，4797-4801(1974)所述的方法進(jìn)行純化，不同點(diǎn)在于將粗制多糖溶液與冷的(4℃)90％苯酚(而不是50-60℃的熱苯酚)進(jìn)行攪拌，從而將蛋白質(zhì)抽提出。后一步驟保證產(chǎn)生高分子量形式的GBMP。大腸桿菌(018K1H7)(NRCC4283)在發(fā)酵罐中，在含脫水BrainHeartInfusion(BHI；37克/升)(DifcoLaboratoriesDetroit，Michigan)的蒸餾水中于37℃生長。在發(fā)酵生長之前，凍干的菌株先在錐形燒瓶中的50毫升BHI溶液(同上)中，在37℃于200rpm下振蕩培養(yǎng)7小時(shí)。然后將這種生長物轉(zhuǎn)移至1.5升BHI(同上)中并在與上述相同的條件下生長7小時(shí)。接著將接種物轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐。在分離和純化大腸桿菌K1的莢膜多糖中所用的程序，與上述用于分離B類腦膜炎球菌多糖的程序是相同的。應(yīng)理解，上述的分離和純化程序并不是唯一可用的程序，可以使用其他出版的程序，如Watson等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)，81，331(1958)和上述美國專利4,727,136中所描述的程序。天然的多糖被N-脫乙酰基化，以便在分子的唾液酸殘基部分提供反應(yīng)性胺基。N-脫乙酰基化可用任何已知方法進(jìn)行，例如在高溫如約90-110℃和約pH13-14時(shí)，在堿性水性介質(zhì)中進(jìn)行。該堿性水性介質(zhì)合適地是堿金屬氫氧化物的水溶液，例如濃度約2M的氫氧化鈉。或者，可以使用肼的水溶液。N-脫乙?；某潭瓤稍诩s30-100％之間隨條件而有所變動(dòng)。較佳地是90-100％N-脫乙?；?。N-脫乙?；蟮漠a(chǎn)物可通過例如冷卻、中和、純化(如果需要)和凍干而回收。N-脫乙?；慕Y(jié)果是，通常產(chǎn)生平均分子量為約3,000-50,000道爾頓的多糖片段。在本發(fā)明中，可使用全長的多糖或多糖片段。N-脫乙?；亩嗵瞧位蛉L的多糖然后被N-?；?，以產(chǎn)生相應(yīng)的N-?；a(chǎn)物。N-?；蛇@樣進(jìn)行將N-脫乙酰基的多糖溶解在pH約7.5-9.0的水性緩沖介質(zhì)中，然后加入適當(dāng)?shù)牟伙柡王；?以及任選的醇，以提高溶解度)，冷卻至低于10℃直至反應(yīng)結(jié)束。如果需要，可以對反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行純化?？梢圆捎玫募兓椒ǖ姆窍拗菩岳影ㄍ肝觯缓笸ㄟ^凍干回收N-?；a(chǎn)物。反應(yīng)大致在約10-20小時(shí)內(nèi)完成。用分析技術(shù)(通常為1H-NMR)測得的N-?；某潭戎辽贋?0％，而且最好接近100％。N-?；磻?yīng)不會導(dǎo)致片段分子量的大幅下降。本發(fā)明的偶聯(lián)物分子具有式II結(jié)構(gòu)其中R2是不飽和的C2-4?；?。因此，該偶聯(lián)物可包含本發(fā)明的不飽和多糖，而且還可包含丙烯?；苌铩８鶕?jù)本發(fā)明，為了偶聯(lián)目的，優(yōu)選選擇平均分子量對應(yīng)于約10-200個(gè)唾液酸殘基的C2-4N-?；牧?。因此，優(yōu)選的偶聯(lián)物是N-丙烯?；?2-丙烯酰基)衍生物。這一般可使用Ultragel(商品名)AcA44柱(珠直徑為60-140微米)，并將PBS用作洗脫劑，通過凝膠過濾N-?；腉BMP而實(shí)現(xiàn)。或者，采用合適的篩分膜(sizingmembrane)。平均分子量為30,000-40,000道爾頓如10,000-15,000道爾頓的不飽和N-?；牧希粌?yōu)選用于本發(fā)明。這可通過收集平均分子量在該范圍內(nèi)的N-?；疓BMP材料的柱洗脫組份而獲得。平均分子量更高例如在30,000-40,000道爾頓范圍內(nèi)的N-酰基化材料，已表明也可用于本發(fā)明。在本發(fā)明的偶聯(lián)物分子中多糖對蛋白質(zhì)的摩爾比優(yōu)選為1摩爾蛋白質(zhì)對20摩爾多糖之間。更佳地該比例為1摩爾蛋白對約2-15摩爾多糖。最佳地，該比例為1摩爾蛋白質(zhì)對4-7摩爾多糖。通過調(diào)節(jié)偶聯(lián)反應(yīng)中原料組份的比例，可改變蛋白質(zhì)/多糖之比。為了提供包含偶聯(lián)于蛋白質(zhì)的不飽和N-?；苌嗵堑呐悸?lián)物分子，本發(fā)明還設(shè)計(jì)了多價(jià)的偶聯(lián)物及其疫苗，其中不同類型的多糖被偶聯(lián)于單個(gè)蛋白質(zhì)上。本發(fā)明的疫苗，是通過將不飽和的N-?；嗵桥悸?lián)于免疫學(xué)上合適的載體蛋白而制得的。較佳地，該載體蛋白本身是免疫原。這種合適的載體蛋白的非限制性例子是細(xì)菌蛋白；或包括破傷風(fēng)毒素、白喉毒素、交叉反應(yīng)物質(zhì)(CRM)尤其是CRM197(從SclavoLtd.，Siena，Italy獲得)、和細(xì)菌蛋白載體的多肽，如腦膜炎球菌外膜蛋白?？捎萌魏蔚呐悸?lián)方式將修飾過的多糖片段與載體蛋白相偶聯(lián)。一種優(yōu)選的方法是在美國專利4,356,170中所描述的方法，即將末端醛基(通過順式鄰位羥基的氧化)引入N-?；嗵侵校缓笸ㄟ^還原性胺化作用將醛基偶聯(lián)于蛋白質(zhì)的氨基。這樣，多糖和蛋白質(zhì)便通過-CH2-NH-蛋白質(zhì)鍵而連接在一起。但是，應(yīng)理解，本發(fā)明的偶聯(lián)物疫苗并不局限于那些通過還原性胺化反應(yīng)而產(chǎn)生的偶聯(lián)物。因此，還可通過用己二酰基二肼間隔體(如Schneerson，R.，等人，Preparation，CharacterizationandImmunogenicityofHaemophilusinfluenzaetypebPolysaccharide-ProteinConjuates，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》(JExp.Med.)，1952，361-476(1980)和授予LanceK.Gordon的美國專利4,664,059中所述的)，將N-酰基化多糖與載體蛋白偶聯(lián)在一起，從而產(chǎn)生疫苗?；蛘撸部墒褂肕erck開發(fā)的二元間隔體技術(shù)，如Marburg，S.等人，″BiomolecularChemistryofMacromoleculesSynthesisofBacterialPolysaccharideConjugateswithNeisseriameningitidisMembraneProtein″，J.Am.Chem.Soc.，108，5282-5287(1986)中所述的技術(shù)，或用還原末端法。根據(jù)本發(fā)明而制備的偶聯(lián)物分子通常包含一蛋白質(zhì)，在該蛋白質(zhì)上通過多糖片段骨架末端上的單一結(jié)合位點(diǎn)而結(jié)合有至少一個(gè)本發(fā)明的腦膜炎球菌多糖片段。因此，如果需要，本發(fā)明提供了產(chǎn)生腦膜炎球菌偶聯(lián)物分子的能力，其中多糖組份除了一個(gè)末端之外沒有被蛋白質(zhì)所掩蓋。通過支鏈的末端唾液酸將腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)于蛋白質(zhì)的其他方法可造成交聯(lián)，以及多糖被連于蛋白質(zhì)的多個(gè)位點(diǎn)。本發(fā)明還包括用這些混合方法產(chǎn)生的偶聯(lián)物分子。形成的、沒有顯著交聯(lián)的N-?；嗵堑鞍踪|(zhì)偶聯(lián)物在水溶液中是可溶的。這使本發(fā)明的這些偶聯(lián)物特別適合用作疫苗。形成的本發(fā)明的不飽和N-?；?多糖蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，已經(jīng)用小鼠進(jìn)行了體外測試，并已表明與N-丙酰基-多糖相比具有更佳的免疫原性。此外，觀察到交叉反應(yīng)抗體的形成顯著下降。另外，與其他被測試的偶聯(lián)物相比，不飽和的偶聯(lián)物顯示了出人意料的高殺菌效價(jià)。考慮到這一點(diǎn)，認(rèn)為本發(fā)明的疫苗可用于針對B類腦膜炎萘瑟球菌或大腸桿菌K1生物體造成的腦膜炎。特別感興趣的是這些疫苗可用于保護(hù)人類嬰幼兒，他們對細(xì)菌性腦膜炎最敏感。本發(fā)明的疫苗可含有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的、對疫苗合適的標(biāo)準(zhǔn)載體、緩沖劑或防腐劑。此外，在制劑中還可包含佐劑如明礬或硬脂酰基酪氨酸，以增強(qiáng)免疫原性應(yīng)答。本發(fā)明的疫苗，一般是通過將偶聯(lián)物分散于任何合適的藥學(xué)上可接受的載體如生理鹽水或其他可注射液體中而形成的。本發(fā)明疫苗的給藥可用任何熟知的方法進(jìn)行，包括(但并不限于)皮下、腹腔內(nèi)或肌內(nèi)給藥。疫苗的優(yōu)選給藥方式是非腸胃給藥。還可存在疫苗的常規(guī)添加劑，例如穩(wěn)定劑如乳糖或山梨糖醇以及佐劑如磷酸鋁、氫氧化物或硫酸鹽。本發(fā)明的疫苗的給藥量應(yīng)足以引發(fā)免疫原性應(yīng)答。一般，約1-50微克多糖的劑量可有效地產(chǎn)生這樣的應(yīng)答?？筛鶕?jù)接受疫苗的個(gè)體的大小、體重或年齡等，調(diào)整劑量。個(gè)體的抗體應(yīng)答可通過測定抗體效價(jià)或殺菌活性加以監(jiān)測，如果需要可進(jìn)行加強(qiáng)免疫以增強(qiáng)應(yīng)答。對于人類嬰幼兒的疫苗合適劑量一般為約5-25微克，或約1-10微克/千克體重。實(shí)施例此處的實(shí)施例部分用于闡述實(shí)施本發(fā)明的各個(gè)不同方面，而不用于以任何方式限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1合成N-丙烯?；鵊BMPN-丙烯?；鵊BMP的合成描述于RoyR.等人，GlycoconjugateJ.(1990)73-12。將N-脫乙?；腉BMP(150毫克)溶解在2.0毫升蒸餾水中。將溶液冷卻至0℃；然后用50微升(1eq)丙烯酰基氯(AldrichChemicalCo.)分批地處理，總計(jì)500微升丙烯酰基氯。通過自動(dòng)滴定設(shè)備，用4MNaOH將溶液的pH維持在8.5。在添加?；韧瓿?2小時(shí))后，將pH升至12，并在該pH下維持30分鐘。通過相對4℃蒸餾水的完全透析而純化材料，然后凍干形成163毫克。對材料的H-NMR揭示，N-酰基化程度為100％，并且具有合適的丙烯?；〈恼夏Ｊ?。實(shí)施例2N-丙烯酰基GBMP的活化將N-丙烯酰基GBMP(150毫克)溶解在蒸餾水(1.25毫升)中，然后加入3.75毫升0.2MNaIO4水溶液(約50eq)。該溶液在室溫下于黑暗中放置1小時(shí)，然后加入乙二醇(400微升，10eq)。在室溫下1小時(shí)后，溶液直接上樣于已經(jīng)在水中平衡過的SephadexG-10(1.6×100)柱(PharmaciaFineChemicals)上。將活化產(chǎn)物從柱上于空體積峰處洗脫出來，然后收集和凍干。氧化產(chǎn)物再在用磷酸鹽緩沖液(pH7.6)平衡過的BioGelA.5柱(1.6×100)(BioRad)上進(jìn)行分級。根據(jù)選定的洗脫物質(zhì)組份的HPLC(高效液相色譜)分析(Pharmacia-Superose，12柱)結(jié)果，將獲得分子量的合并物。將各組份的相對Kav值與預(yù)先制作的校正曲線進(jìn)行比較，從而選擇出氧化的丙烯?；鵊BMP的一個(gè)11KD洗脫組份。如上通過透析純化各組份。分級后材料的H-NMR波譜分析與氧化的N-丙烯?；鵊BMP是相符的。實(shí)施例3制備N-丙烯?；鵊BMP與破傷風(fēng)毒素的偶聯(lián)物將新鮮制備的破傷風(fēng)毒素單體(TT-m；3.5毫克)與10.5毫克氧化的丙烯?；鵊BMP的11KD洗脫組份在Pierce反應(yīng)管中合并。加入氰基氫硼化鈉(7.0毫克)，然后將混合物溶解在233微升的磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.5)。溶液在37℃總共溫育5天。定期地，通過分子排阻HPLC(Superose-12柱，Pharmacia)監(jiān)測偶聯(lián)情況，以觀察隨著偶聯(lián)的進(jìn)展向更高分子量變遷的情況。最終的偶聯(lián)物在已用PBS平衡過的BioGelA.5柱上通過分級而與原料分開，然后進(jìn)行透析和凍干處理。對總唾液酸(Svennerholm法)和蛋白質(zhì)(BCA法，Pierce)的比色分析表明，偶聯(lián)物含有12-30％唾液酸。實(shí)施例4對小鼠進(jìn)行免疫一般，用一定量的相當(dāng)2微克唾液酸的偶聯(lián)物(0.2毫升)，通過腹膜內(nèi)方式對10只雌性CF1小鼠(8-10周大小)進(jìn)行免疫，可以添加或不添加佐劑如明礬(Alhydrogel，SuperfosBiosector)或RIBI完全或部分佐劑系統(tǒng)(RIBIImmunochem)。在最初接種后，在第21和35天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，然后在第45天進(jìn)行放血。通過心臟穿刺術(shù)收集血液，并將血清分份儲存于-86℃。實(shí)施例5殺菌測定殺菌測定是在96孔的組織培養(yǎng)微量滴定板(Corning)上進(jìn)行的。所有的血清在使用前于56℃加熱滅活30分鐘。B類腦膜炎球菌(株80-165B2bp.l)在巧克力瓊脂平板(QueLab)上，于37℃在5％CO2中生長過夜，然后接種于第二個(gè)平板并溫育5小時(shí)。用Hank′s平衡鹽溶液(Hank′sbalancedsaltsolution，HBSS)作為稀釋劑，直接在平板上對抗血清進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，使終體積為50微升/孔。制備GBM在HBSS中的懸浮液，其O.D.(λ580)＝0.1吸光度。該懸浮液在HBSS中稀釋40,000倍，得到用于分析的最終的細(xì)菌工作稀釋液。將新融化的幼兔補(bǔ)體(Pel-FreezeBiologicals)加至每個(gè)孔中(20微升)，然后加入30微升細(xì)菌工作稀釋液。然后，平板在37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。每個(gè)孔的內(nèi)含物混合后，接種于巧克力瓊脂平板上(35微升)。然后將平板在37℃/5％CO2下溫育過夜，對菌落形成單位(CFU)數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。相對HBSS對照孔或無關(guān)抗血清的平均值，根據(jù)下式確定殺死百分比殺死％＝(CFU對照-CFU抗血清/CFU對照)×100實(shí)施例6被動(dòng)保護(hù)測定從用N-酰基GBMP-TT免疫而獲得的小鼠抗血清，一般在無菌鹽水或PBS(磷酸鹽緩沖液)中進(jìn)行稀釋。給幾組雌性CF1小鼠(每組5只)(8-10周大小)靜脈內(nèi)注射200微升稀釋的抗血清。在1小時(shí)后，每組小鼠通過腹膜內(nèi)注射B類腦膜炎萘瑟球菌(GMB80165B2bP.l)懸浮液(500微升；800-1200CFU/毫升)而進(jìn)行攻擊。在5小時(shí)后，從各小鼠中通過心臟穿刺術(shù)收獲血液，然后將10微升血液接種于巧克力瓊脂平板。平板在37℃和5％CO2下溫育，在15-20小時(shí)后測定菌落形成單位(CFU)的數(shù)目。被動(dòng)保護(hù)測定是以特異性抗體存在時(shí)細(xì)菌減少或消失為基礎(chǔ)的，它是相對于沒有特異性抗體的對照組進(jìn)行測量的。由小鼠抗-N-?；鵊BMP偶聯(lián)物血清所提供的保護(hù)程度，用相對于無關(guān)對照抗血清或PBS時(shí)每種抗血清的CFU下降的百分比來表示。實(shí)施例7針對腦膜炎萘瑟球菌B血清群(serogroup)的疫苗的合成及其生物活性合成針對腦膜炎萘瑟球菌B血清群的新的偶聯(lián)物疫苗，其設(shè)計(jì)以天然多糖的獨(dú)特修飾形式為基礎(chǔ)。天然多糖(N-AcGBMP)通過在氨基末端用N-丙烯?；?NH-CO-CH＝CH2)完全取代N-乙?；?，對天然多糖(N-AcGBMP)進(jìn)行衍生。物理方法，如1H和13C-NMR波譜分析可以確切地確定新物質(zhì)的種類和均質(zhì)程度，而分子排阻HPLC可顯示在解聚過程中多糖分子大小沒有改變。按與上述程序相似的方式，制備連于蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物。簡而言之，從制備N-丙烯?；鵊BM多糖開始，制備2批不同的N-丙烯?；鵊BMP-破傷風(fēng)毒素偶聯(lián)物。對兩種偶聯(lián)物的比色分析揭示，總唾液酸對偶聯(lián)物之比分別為13％和20％。偶聯(lián)物的1H-NMR揭示在蛋白質(zhì)上存在未改變的修飾多糖。在各自的動(dòng)物試驗(yàn)中，在一個(gè)例子中將N-丙烯酰基GBMP-TT偶聯(lián)物與鹽水、氫氧化鋁，或者與RIBI′s完全佐劑(MPL+TDM+CWS)一起注射入小鼠；而在另一例子中N-丙烯?；鵊BMP-TT偶聯(lián)物僅與RIBI佐劑一起注射。觀察表明小鼠可很好地耐對各種抗血清的血清學(xué)測試表明，兩種偶聯(lián)物都引發(fā)的特異性應(yīng)答都相當(dāng)于或高于用N-丙酰基GBMP-TT構(gòu)建物和RIBI′s佐劑系統(tǒng)時(shí)所見的應(yīng)答(見表1)。對N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清的交叉反應(yīng)性的初步研究表明，它與用N-丙酰基GBMP-TT抗血清時(shí)所見的交叉反應(yīng)程度相類似(見表2)。兩批N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清中的一批，與同一試驗(yàn)中施用的N-丙?；鵊BMP-TT構(gòu)建物相比，對天然GBMP的交叉反應(yīng)顯著下降。對兩批N-丙烯酰基GBMP-TT都測試了他們對活GBM的殺菌活性，結(jié)果表明相對于N-丙?；鵊BMP-TT抗血清而言有明顯的活性。這些結(jié)果總結(jié)于表1和3。在表1中的數(shù)據(jù)是重復(fù)進(jìn)行的殺菌測試的結(jié)果，它與用相同材料進(jìn)行的其他測試中的稀釋度是相同的。表1的數(shù)據(jù)與丙烯酰基特別具有有效殺菌活性是相符的。表3比較了兩批N-丙烯酰基GBMP-TT抗血清的殺菌活性，以及在相同的動(dòng)物試驗(yàn)中用N-丙?；鵊BMP-TT抗血清獲得的結(jié)果。測試使用15倍的細(xì)菌，因此僅檢測出具有強(qiáng)活性的抗血清。從N-丙烯?；鵊BMP-TT抗血清與N-丙?；鵊BMP-TT抗血清的比較中可看出，殺菌活性幾乎相同。用不同的稀釋度進(jìn)行被動(dòng)保護(hù)研究，所有的稀釋度都顯示出明顯的清除情況，這暗示存在對小鼠的保護(hù)作用(見表1)。在不同稀釋度下與N-丙酰基GBMP-TT抗血清的比較，給出了幾乎相同的結(jié)果。在被動(dòng)保護(hù)試驗(yàn)中，兩批N-丙烯?；?GBMP-TT抗血清的比較表明，兩批對小鼠的保護(hù)情況相同(在試驗(yàn)誤差內(nèi))(見表3)。表1試驗(yàn)RPV-1-63的總結(jié)，用于比較修飾的B類腦膜炎球菌多糖-破傷風(fēng)毒素偶聯(lián)物在不同佐劑中的性能</tables>aELISA效價(jià)被定義為O.D.×稀釋度，對曲線上的3點(diǎn)進(jìn)行平均。鹽水、明礬和RIBI是產(chǎn)生抗血清中所用的佐劑。b殺滅50％或90％GBM80-165所需的抗-修飾的GBMP-TT/RIBI血清的倒數(shù)稀釋度。數(shù)值被精確到+/-1稀釋度。c相對于HBSS對照而言，在抗-修飾的GBMP-TT/RIBI血清的不同稀釋度下GBM80165被清除的百分比。表2修飾的N-酰基GBMP-TT抗血清(RPV-1-63)對天然N-乙?；鵊BMP抗原的交叉反應(yīng)</tables>aELISA效價(jià)被定義為O.D.×稀釋度，對曲線上的3點(diǎn)進(jìn)行平均。鹽水、明礬和RIBI是產(chǎn)物抗血清中所用的佐劑。bN-?；硎咀鳛榘豢乖耐炊嗵?人血清白蛋白偶聯(lián)物。cN-乙?；硎咀鳛榘豢乖腘-乙?；鵊BMP-人血清白蛋白偶聯(lián)物。表3相對于N-丙?；鵊BMP-TT抗血清而言兩批N-丙烯?；鵊BMP-TT抗血清保護(hù)性能的總結(jié)a抗血清是用RIBI佐劑系統(tǒng)產(chǎn)生的。b殺滅50％GBM870165所需的抗血清倒數(shù)稀釋度。注意，相對于所述的程序使用15倍數(shù)量的GBM(2600cfu/100微升)。這導(dǎo)致僅可測出強(qiáng)殺菌抗血清的殺菌活性。c相對PBS對照而言，用1∶4稀釋的各種抗血清清除GBM80165的百分比。實(shí)施例8用N-酰基修飾的GBMP-TT偶聯(lián)物進(jìn)行的進(jìn)一步研究按基本與上述相同的方法，合成一系列的N-酰基修飾的GBM多糖(N-丙?；鵊BMP(NPr)、N-丁?；鵊BMP(NBu)、N-戊?；鵊BMP(NPe)和N-丙烯?；鵊BMP(NAcryl))，不同點(diǎn)在于控制pH以限制多糖的解聚。1H和13C-NMR波譜分析可完全確定修飾后多糖的種類，而且已確定每種多糖都100％得以衍生。根據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)柱上的SEC-H-PLC曲線，產(chǎn)生一系列的相同分子量(11KD)的氧化的多糖片段。所有的偶聯(lián)物都在完全相同的條件下合成。對偶聯(lián)物的比色分析得到如下的唾液酸摻入情況NPr-28％、NBu-30％、NPe-18％、NAcryl-19％。用在鹽水中吸附在氫氧化鋁上的，或者乳化在RIBI佐劑上的2微克唾液酸/偶聯(lián)物免疫小鼠。所有的偶聯(lián)物都能被小鼠很好地耐受，沒有觀察到不適的癥狀。不同抗血清對同源多糖抗原的ELISA效價(jià)總結(jié)于表1。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生最高效價(jià)的佐劑是RIBI系列(從N-丙?；罭-戊?；来卧黾?，證實(shí)了以前用其他疏水性佐劑系統(tǒng)得到的發(fā)現(xiàn)。在諸如明礬之類的佐劑系統(tǒng)中，并沒有相應(yīng)的效價(jià)增加趨勢。對免疫多糖的特異性還隨著?；?從N-丙?；罭-戊?；?長度的增加而提高，最明顯的是在RIBI系列中(見表2)。這個(gè)結(jié)果也與以前顯示相同趨勢的結(jié)果相符。盡管效價(jià)和特異性增加了，但是在殺菌測試和被動(dòng)產(chǎn)生測試中對天然殺菌的活性并沒有相應(yīng)增加。在50％和90％殺菌水平時(shí)，N-Pr抗血清顯示出比N-Bu和N-Pe抗血清高得多的殺菌效價(jià)(高14-25倍)。相應(yīng)地，對不同稀釋度的抗血清的被動(dòng)保護(hù)研究表明，與N-Pr抗血清不同(即使在1∶6稀釋度下也有明顯清除效果)，N-Bu和N-Pe只有在高濃度下才有明顯的清除效價(jià)的效果。權(quán)利要求1.一種修飾的B類腦膜炎球菌多糖，其特征在于，N-乙酰基被式(I)所示的N-?；苌锼〈渲?，R1是含有至少一個(gè)雙鍵的C3-C4不飽和烷基。2.如權(quán)利要求1所述的多糖，其特征在于，R1有4個(gè)碳原子并且有2個(gè)非相鄰的雙鍵。3.如權(quán)利要求1所述的多糖，其特征在于，R1有4個(gè)碳原子并且有1個(gè)雙鍵。4.如權(quán)利要求1所述的多糖，其特征在于，R1有3個(gè)碳原子。5.如權(quán)利要求2所述的多糖，其特征在于，R1是CH2＝CH-CH2-CH2。6.如權(quán)利要求3所述的多糖，其特征在于，R1是CH2＝CH2-CH2。7.如權(quán)利要求1所述的多糖，其特征在于，距?；荚幼钸h(yuǎn)的碳原子是通過雙鍵而連接的。8.如權(quán)利要求7所述的多糖，其特征在于，R1有4個(gè)碳原子。9.如權(quán)利要求7所述的多糖，其特征在于，R1有3個(gè)碳原子。10.一種偶聯(lián)物分子，其特征在于，它具有至少一個(gè)式II多糖片段其中R2是不飽和的、具有至少一個(gè)雙鍵的?；?，而且該片段共價(jià)地連于蛋白質(zhì)。11.如權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物分子，其特征在于，該蛋白質(zhì)來自細(xì)菌。12.如權(quán)利要求11所述的偶聯(lián)物分子，其特征在于，該細(xì)菌是是腦膜炎萘瑟球菌。13.如權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物分子，其特征在于，該蛋白質(zhì)來自細(xì)菌并選自下組破傷風(fēng)毒素、白喉毒素、CRM197和腦膜炎球菌外膜蛋白(OMP)。14.如權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物分子，其特征在于，該多糖片段是N-?；苌嗵?，蛋白質(zhì)是破傷風(fēng)毒素和DMP，以及多糖片段的分子量在約3-50千道爾頓之間。15.如權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物分子，其特征在于，該多糖片段是N-酰基衍生多糖，蛋白質(zhì)是破傷風(fēng)毒素，以及多糖片段的分子量為約10,000道爾頓。16.如權(quán)利要求19所述的偶聯(lián)物分子，其特征在于，多糖對蛋白質(zhì)的摩爾比為約20多糖和1蛋白質(zhì)之間。17.如權(quán)利要求20所述的偶聯(lián)物分子，其特征在于，多糖對蛋白質(zhì)的摩爾比為約4-7摩爾多糖對1摩爾蛋白質(zhì)。18.如權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物分子，其特征在于，它包含N-?；苌?。19.一種偶聯(lián)物分子的疫苗組合物，其特征在于，它包含共價(jià)地連于蛋白質(zhì)的B類腦膜炎球菌的不飽和的C3-5N-?；苌嗵恰?0.如權(quán)利要求19所述的疫苗組合物，其特征在于，該蛋白質(zhì)組份來自細(xì)菌并選自下組破傷風(fēng)毒素、白喉毒素、CRM197和腦膜炎球菌外膜蛋白。21.如權(quán)利要求19所述的疫苗組合物，其特征在于，該多糖片段是N-?；苌嗵?，以及多糖片段的分子量在約3-50千道爾頓之間。22.如權(quán)利要求19所述的疫苗組合物，其特征在于，蛋白質(zhì)組份來自腦膜炎萘瑟球菌。23.一種免疫血清，其特征在于，它含有用權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物免疫的哺乳動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體。24.如權(quán)利要求23所述的免疫血清，其特征在于，偶聯(lián)物的多糖是不飽和的C3-5N-?；苌嗵堑钠?。25.一種針對腦膜炎萘瑟球菌和大腸桿菌K1感染而免疫哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，給該哺乳動(dòng)物施用免疫有效量的權(quán)利要求19所述的疫苗。全文摘要本發(fā)明涉及化學(xué)修飾的B類腦膜炎萘瑟球菌(Neisseriameningitidis)多糖。本發(fā)明還提供了疫苗,在該疫苗中各個(gè)修飾的多糖被偶聯(lián)于蛋白質(zhì)載體等。更具體地,本發(fā)明還提供了新的B類腦膜炎球菌不飽和的N－?；苌嗵?、新的B類腦膜炎球菌不飽和的N－?；苌嗵桥悸?lián)物、含有共價(jià)連于蛋白質(zhì)的B類腦膜炎球菌不飽和N－?；苌嗵瞧蔚呐悸?lián)物分子的藥物組合物,以及這些組合物作為疫苗的用途。文檔編號A61P31/04GK1187136SQ96194582公開日1998年7月8日申請日期1996年6月7日優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日發(fā)明者H·J·詹寧斯,R·蓬尼,M·呂西耶,F·米雄申請人:加拿大國家研究院