專利名稱：附子或川烏總生物堿提取物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種附子或川烏總生物堿提取物的制備方法，特別是對由各種方法得到的附子或川烏總生物堿提取物粗品制備其純化提取物產品的方法。
背景技術：
附子、川烏為常用中藥，分別為毛茛科植物烏頭如turn carmichaeli Debx.的子根和母根，其主要有效成分為多種生物堿成分，包括雙酯型生物堿(烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等)、單酯型生物堿(苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等)和醇胺型生物堿(烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿)等。目前對附子或川烏中生物堿成分已有報道和/使用的分離純化方法，均為將其水煎液或其水溶液經大孔吸附樹脂柱吸附后，先用水洗脫除雜，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗 脫液，得到經分離純化后的附子或川烏的總生物堿成分。如趙鐳等報道，將附子提取物通過DlOl大孔吸附樹脂純化，水、體積分數為10%、80%的乙醇溶液梯度洗脫，收集體積分數為10%的乙醇洗脫部分濃縮干燥，即得附子總生物堿(附子總生物堿的提取純化工藝，沈陽藥科大學學報，2007，24(7) :433)。萬里翔等報道，將附子提取物上DlOl大孔吸附樹脂柱，以蒸餾水除雜，再用95%乙醇洗脫，濃縮蒸干洗脫液，即得附子總生物堿(烏頭總堿的純化工藝及中烏頭堿的純化研究，安徽農業(yè)科學，2008，36(12): 5044)。吳平報道了一種附子生物堿的提取分離純化方法，將生附子用酸水提取，提取液經大孔樹脂柱吸附，先用水洗去雜質，再用60%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，經進一步處理得到附子生物堿提取物(成都中醫(yī)藥大學碩士學位論文，2007年)。申請人:經研究發(fā)現，對附子或川烏的水煎液，或其乙醇等其它溶劑提取物的水溶液，采用大孔吸附樹脂柱分離純化時，經水洗脫除雜后，再用3(Γ95(ν)%的含水乙醇洗脫(解吸附)，均不能充分洗脫回收相應的生物堿成分，導致生物堿的損失嚴重，損失率可達3(Γ50%，浪費了藥材資源，也影響了附子或川烏藥效作用的充分發(fā)揮。

發(fā)明內容
鑒于此，本發(fā)明提供了一種附子或川烏總生物堿提取物的制備方法，特別是對由各種方法得到的附子或川烏總生物堿提取物粗品制備其純化提取物產品的方法。本發(fā)明附子或川烏總生物堿提取物的制備方法，是將含有附子或川烏提取物的水溶液，用大孔吸附樹脂吸附后，先用水或PH 8^10的堿性水溶液洗滌除雜質后，至少用PH < 5和乙醇體積含量為5(Γ90%的酸性乙醇-水溶液洗脫，收集洗脫液，除去溶劑，即得到附子或川烏總生物堿提取物。其中，所說的大孔吸附樹脂，可以按照目前常規(guī)的方式操作，如選擇常用的HPD100、HPD300、D101、AB-8等各種型號的大孔樹脂，其中優(yōu)選HPD100或DlOl等型號的大孔吸附樹脂。上述所說的含有附子或川烏提取物的水溶液，可以為附子或川烏的水提取液，或是其它各種來源的含有附子或川烏提取物成分的水溶液，特別是由不同的有機溶劑對附子或J11烏提取并除去溶劑后的提取物配制的水溶液。實驗顯示，用大孔樹脂進行吸附處理的所說含有附子或川烏提取物的水溶液，優(yōu)選為使溶液中所說的提取物含量為不超過相當于I克生藥/毫升的量。上述制備方法中，洗滌除雜質時的以采用堿性水溶液為佳，除優(yōu)選為工業(yè)生產中最為常用和易得的氫氧化鈉或碳酸鈉的水溶液外，也可以使用藥物中允許使用的其它堿性成分的水溶液?；谕瑯永碛?，上述制 備方法中，所說的酸性乙醇溶液，除優(yōu)選以工業(yè)生產中最為常用和易得的鹽酸進行酸化的乙醇-水溶液外，也可以使用藥物中允許使用的其它酸性成分進行酸化。上述制備方法中，另一種優(yōu)選的方式是，可采用先用酸性乙醇-水溶液洗脫，最后再用中性乙醇-水溶液洗脫，即先采用酸性(特別是酸性較強的)乙醇-水溶液洗脫，使大孔吸附樹脂柱呈酸性后，最后再改用中性乙醇洗脫。所收集的洗脫液，除上述可直接除去乙醇等溶劑后，得到所說的提取物(或含有附子或川烏總生物堿相應酸鹽)外，還可以采用的其它方式包括，將所說收集的洗脫液先用醫(yī)藥中允許使用的堿性成分(可優(yōu)選氫氧化鈉或碳酸鈉、碳酸氫鈉等)調節(jié)至PH值5 7后，再進行除去溶劑的操作；或者是將所說收集的洗脫液用堿型陰離子交換樹脂，如選擇目前已有廣泛報道和/使用的717、D201、D202、711、D301、D311、D318等型號的堿型陰離子交換樹脂處理后，再進行除去溶劑的操作。實驗結果表明，本發(fā)明上述制備方法與目前傳統方法比較，特別是采用堿性水溶液洗脫除雜時，既能充分除去雜質，又不會明顯損失或破壞所需要的生物堿成分，而且用酸性乙醇-水溶液對吸附樹脂進行洗脫，能使相應的生物堿成分被充分洗脫，回收率高，有效避免了傳統方法的生物堿損失嚴重問題，大大節(jié)省了藥材資源，提高了藥材的利用率，使附子或川烏的藥效作用得以更充分的利用和發(fā)揮。以下通過實施例的具體實施方式
再對本發(fā)明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。在不脫離本發(fā)明上述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應包括在本發(fā)明的范圍內。
具體實施例方式實施例I
取生附子10kg，加水10倍，浸泡4小時，煎煮2小時，濾過，水煎液備用；藥渣再加水8倍，煎煮I小時，濾過，合并水煎液，按常規(guī)方法上HPD100型大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫除雜后，再用PH 2 3的70(v)% (以下同)鹽酸乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，用氫氧化鈉溶液調節(jié)PH值至6 7，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，即得附子總生物堿提取物。實施例2
取生附子10kg，加水12倍，浸泡2小時，煎煮3小時，濾過，水煎液備用；藥渣再加水10倍，煎煮2小時，濾過，合并水煎液，上HPD100型大孔吸附樹脂柱，先用pH值擴10的氫氧化鈉溶液洗脫除雜，再用PH 2^3的70%鹽酸乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，上717堿型陰離子交換樹脂柱，收集乙醇流出液，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，即得附子總生物堿提取物。實施例3
取制附片10kg，加水10倍，煎煮2次，每次2小時，濾過，合并水煎液，上DlOl型大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫除雜，再用pH 4^5的90%鹽酸乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，即得附子總生物堿提取物。實施例4
取黑附片10kg，加水12倍，煎煮2次，每次3小時，濾過，合并水煎液，上HPD300型大孔吸附樹脂柱，先用PH值8、的氫氧化鈉溶液洗脫除雜后，再用pH 2^3的60%鹽酸乙醇-水溶液洗脫，至流出液呈酸性時，改用中性60%乙醇-水洗脫，收集酸乙醇和乙醇洗脫液，加氫氧化鈉溶液調節(jié)PH值至5 7，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，即得附子總生物堿提取物。
實施例5
取白附片10kg，加70 (V) %乙醇10倍，回流提取2次，每次2小時，濾過，合并乙醇提取液，減壓回收除盡乙醇，濃縮物用水溶解，配制成含量不超過相當于I克/毫升生藥的水溶液，濾過，上DlOl型大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫除雜，再用pH 4飛的80%鹽酸乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，即得附子總生物堿提取物。實施例6
取制川烏10kg，加水12倍，煎煮2次，每次2小時，濾過，合并水煎液，上HPD100型大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫除雜，再用PH 2^3的50%鹽酸乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，加氫氧化鈉溶液調節(jié)PH值至5飛，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，即得川烏總生物堿提取物。實施例7
取生川烏10kg，加水8 10倍，煎煮2次，每次3小時，濾過，合并水煎液，上HPD300型大孔吸附樹脂柱，先用PH值8 10的氫氧化鈉溶液洗脫除雜后，再用pH Γ2的70%鹽酸乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，上D201堿型陰離子交換樹脂柱，收集乙醇流出液，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，即得川烏總生物堿提取物。實施例8
取生川烏10kg，加80(v)%乙醇8倍，回流提取3次，每次2小時，濾過，合并乙醇提取液，減壓回收除盡乙醇，濃縮物用水溶解，配制成pH 3 4、含量不超過相當于I克/毫升生藥的水溶液，濾過，上AB-8型大孔吸附樹脂柱，先用pH值8 10的氫氧化鈉溶液洗脫除雜后，再用PH O. 5的60%鹽酸乙醇-水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，上D301堿型陰離子交換樹脂柱，收集乙醇流出液，減壓回收乙醇，濃縮、干燥，即得川烏總生物堿提取物。以下通過有效成分的含量和藥效作用為評價指標，進一步說明本發(fā)明附子或川烏總生物堿提取物的制備方法所具有的有益效果。I、有效成分的含量測定
取生附子3kg，加水10倍，浸泡4小時，煎煮2小時，濾過，水煎液備用；藥渣再加水8倍，煎煮I小時，濾過，合并水煎液，分成3等份，按常規(guī)方法分別上3根完全相同的柱床體積為I. 5L的HPD100型大孔吸附樹脂柱(A、B、C)
A柱采用常規(guī)方式，先用2倍柱床體積的水洗脫除雜，再用70%乙醇-水溶液洗脫，收集3倍柱床體積的乙醇洗脫液，備用(A液)；B柱采用上述實施例I的方式，先用2倍柱床體積的水洗脫除雜，再用pH 2^3的70%鹽酸乙醇-水溶液洗脫，收集3倍柱床體積的乙醇洗脫液，用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6 7，備用(B液)；
C柱采用上述實施例2的方式，先用2倍柱床體積的pH值 Γ Ο的氫氧化鈉溶液洗脫除雜，再用PH 2^3的70%鹽酸乙醇溶液洗脫，收集3倍柱床體積的乙醇洗脫液，上717堿型陰離子交換樹脂柱，收集乙醇流出液，備用(C液)。
按中國藥典2010年版一部177頁附子項下的HPLC色譜方法，分別測定上述A液、B液、C液中生物堿成分的含量(以生藥計)，結果見表I。另取黑附片3kg，加水12倍，煎煮2次，每次3小時，濾過，合并濾液，分成3等份，按常規(guī)方法分別上3根完全相同的柱床體積為I. 5L的HPD100型大孔吸附樹脂柱(D、E、F):
D柱同A柱方式，先用2倍柱床體積的水洗脫除雜，再用70%乙醇-水溶液洗脫，收集3倍柱床體積的乙醇洗脫液,備用(D液)；
E柱同B柱方式，先用2倍柱床體積的水洗脫除雜，再用pH 2^3的70%鹽酸乙醇-水溶液洗脫，收集3倍柱床體積的乙醇洗脫液，用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6 7，備用(E液)；F柱同C柱方式，先用2倍柱床體積的pH值 Γ Ο的氫氧化鈉溶液洗脫除雜，再用pH2^3的70%鹽酸乙醇溶液洗脫，收集3倍柱床體積的乙醇洗脫液，上717堿型陰離子交換樹脂柱，收集乙醇流出液，備用(F液)。分別測定上述D液、E液、F液中生物堿成分的含量(以生藥計)，結果見表I。表I A F洗脫液中生物堿成分的含量測定結果(mg · g—1，以生藥計)
生物堿I苯甲酰烏頭原堿I苯甲酰次烏頭原堿I苯甲酰新烏頭原堿I烏頭堿I次烏頭堿I新烏頭堿
A 液 0.121_O. 392_O. 853_—_—_—_
B 液_0.16707434I. 579——
C 液_0.16207436I. 571一 .一—
D 液_0.0610Λ22O. 1810.015 ~0.94 0.031
E 液_0.08307T36O. 3480.021 .0.103 0.059
F 液 |0·081|θ. 138|θ. 345|θ. 020 |θ. 104 |θ. 058
注“一”為未檢出。由表I可見，酸乙醇洗脫(解吸)的效果顯著優(yōu)于中性乙醇洗脫，堿水洗脫除雜對生物堿成分無明顯影響。2、抗寒冷、耐缺氧實驗
將上述D液、E液、F液減壓回收乙醇，濃縮至清膏，備用。參照文獻(李立紀等，中藥藥理與臨床，2005，21 (6) 31-33)方法進行藥效實驗。2. I抗寒冷實驗
小鼠80只雌雄各半，隨機分成5組，連續(xù)給藥5天，未次給藥后I小時放入冰箱冷凍室中，-10°C半小時，觀察其死亡只數，結果見表2，表明本發(fā)明制備方法得到的附子總生物堿提取物(E、F提取物)具有更好的抗寒冷作用。表2 附子提取物對小鼠耐寒冷的影響
組另j I劑量(g生藥/Kg) I試驗鼠數(只)I死亡鼠數(只)I存活率(%)
對照一_20_13_35_
P 提取涵~ 2020一 1050~
E 提取涵"2020— 575~
F提取物+20|20\&丨702.2耐缺氧實驗
小鼠50只，雌雄各半，隨機分成5組，連續(xù)給藥5天，未次給藥后I小時，斷頭觀測其張口呼吸的時間，結果見表3，表明本發(fā)明制備方法得到的附子總生物堿提取物具有更好的耐
缺氧作用。表3 附子提取物對小鼠斷頭張口呼吸時間的影響(X土s)
權利要求
1.附子或川烏總生物堿提取物的制備方法，其特征是將含有附子或川烏提取物的水溶液，用大孔吸附樹脂吸附后，先用水或PH 8^10的堿性水溶液洗滌除雜質后，至少用pH ( 5和乙醇體積含量為5(Γ90%的酸性乙醇-水溶液洗脫，收集洗脫液，除去溶劑，即得到附子或川烏總生物堿提取物。
2.如權利要求I所述的制備方法，其特征是所說的含有附子或川烏提取物的水溶液為附子或)11烏的水提取液，或是附子或)I丨烏提取物的水溶液。
3.如權利要求I所述的制備方法，其特征是所說含有附子或川烏提取物的水溶液中所說的提取物的含量為不超過相當于I克生藥/毫升。
4.如權利要求I所述的制備方法，其特征是所說洗滌除雜質的堿性水溶液為氫氧化鈉或碳酸鈉的水溶液。
5.如權利要求I所述的制備方法，其特征是所說的酸性乙醇溶液為用鹽酸酸化的乙醇-水溶液。
6.如權利要求I所述的制備方法，其特征是所說的用酸性乙醇-水溶液洗脫時，采用先用酸性乙醇-水溶液洗脫,最后用中性乙醇-水溶液洗脫。
7.如權利要求I所述的制備方法，其特征是所說收集的洗脫液先調節(jié)至pH值5 7后，再進行除去溶劑的操作。
8.如權利要求I所述的制備方法，其特征是所說收集的洗脫液用堿型陰離子交換樹脂處理后，再進行除去溶劑的操作。
9.如權利要求I至7之一所述的制備方法，其特征是所說的大孔吸附樹脂為HPD100或DlOl型大孔吸附樹脂。
全文摘要
附子或川烏總生物堿提取物的制備方法。將含有附子或川烏提取物的水溶液，用大孔吸附樹脂吸附后，用水或pH8~10的堿性水溶液洗滌除雜質后，至少用pH≤5和乙醇體積含量為50~90%的酸性乙醇-水溶液洗脫，收集洗脫液，除去溶劑，即得到附子或川烏總生物堿提取物。由所說提取物的粗品采用該方法制備純化的提取物，既能達到除雜完全，又不損失和破壞所需的生物堿成分，而且對相應生物堿成分洗脫充分，回收率高，有效解決了傳統方法生物堿損失嚴重的問題。
文檔編號A61K36/714GK102895338SQ201210455679
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權日2012年11月14日
發(fā)明者陳燕, 唐小龍, 黃志芳, 劉玉紅, 劉云華, 易進海 申請人:四川省中醫(yī)藥科學院