專利名稱：含有氨基異喹啉基團(tuán)的凝血酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有氨基異喹啉基團(tuán)的凝血酶抑制劑、含有這種抑制劑的藥物組合物、以及所述抑制劑用于生產(chǎn)治療和預(yù)防凝血酶有關(guān)的疾病的藥物的用途。
文獻(xiàn)中公開了大量肽樣凝血酶抑制劑。這些凝血酶抑制劑中大多數(shù)在其所謂的P1-位含有堿基，例如堿性氨基酸精氨酸和賴氨酸，但是也有芐脒等。認(rèn)為這種堿性部分對(duì)抗凝血酶活性是必不可少的。另一方面，這些化合物的堿度可以賦予化合物當(dāng)通過(guò)口服途徑釋放時(shí)在小腸內(nèi)的吸收。在WO 98/47876中公開了一類凝血酶抑制劑，它具有氨基異喹啉部分作為堿性基團(tuán)，這樣顯示了提高的經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)性能?，F(xiàn)已證實(shí)在后面一類化合物中一類新選擇的化合物具有更高的藥理性能。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)式(I)的化合物 其中R1是環(huán)戊基、環(huán)己基或支鏈(3-4C)烷基；R2是環(huán)己基或苯基；R3是H或甲基；和A是未經(jīng)取代的飽和的4、5或6-元環(huán)；或其可藥用鹽，是具有顯著增加的血漿半衰期的有效凝血酶抑制劑。需要抗血栓形成性藥物的大多數(shù)臨床狀況一般需要延長(zhǎng)的半衰期(參見(jiàn)Sixma，J.J.等，Thromb.Res.67；305-311(特別是307)，1992)。因此本發(fā)明的化合物在本領(lǐng)域是一個(gè)重要的改進(jìn)。
本發(fā)明的化合物可用于治療和預(yù)防凝血酶介導(dǎo)的和凝血酶有關(guān)的疾病。這包括大量血栓形成性和其中凝血級(jí)聯(lián)被激活的前血栓形成狀態(tài)，包括，但不限于，深靜脈血栓形成、肺栓塞、血栓靜脈炎、血栓形成或栓塞引起的動(dòng)脈閉塞、血管形成術(shù)或血栓溶解期間或之后的動(dòng)脈再閉塞，動(dòng)脈損傷或侵入性心臟手術(shù)之后的再狹窄、手術(shù)后的靜脈血栓形成或栓塞、急性或慢性動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、心肌梗塞、癌和轉(zhuǎn)移、以及神經(jīng)變性疾病。本發(fā)明的化合物還可用作體外血液循環(huán)中，必要的話在透析和手術(shù)中的抗凝劑。本發(fā)明的化合物還可用作體外抗凝劑。
本發(fā)明優(yōu)選的凝血酶抑制劑是A為一5-元環(huán)的化合物。優(yōu)選R2是環(huán)己基。其它優(yōu)選的化合物是R3是H的那些。更優(yōu)選R1是環(huán)己基的化合物。最優(yōu)選的本發(fā)明凝血酶抑制劑是R1是環(huán)己基，R2是環(huán)己基，R3是H且A是5-元環(huán)的化合物。
術(shù)語(yǔ)支鏈(3-4C)烷基意思是具有3個(gè)或4個(gè)碳原子的支鏈烷基，例如異丙基。
本發(fā)明還包括所述凝血酶抑制劑的制備方法，包括將適當(dāng)保護(hù)的氨基酸與氨基異喹啉衍生物偶聯(lián)，然后除去這些保護(hù)基團(tuán)。
式(I)的化合物可以常用于這些化合物的方式制備。它們可以通過(guò)連接有式(II)的化合物的肽與用作偶聯(lián)劑的式(III)的化合物例如N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCCI)和1-羥基苯并三唑(HOBT)或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)制備，其中R1、R2、R3和A具有前面定義的意義。式(II)的化合物的N-端可以任選載有一保護(hù)基團(tuán)如叔丁氧基羰基(Boc)。式(III)的化合物的芳基胺基團(tuán)可以任選載有一保護(hù)基團(tuán)，例如可以在偶聯(lián)反應(yīng)之后除去的苯甲?；?。 式(II)的化合物可以由式(IV)的化合物，其中Pg1是羧酸酯保護(hù)基團(tuán)如苯甲酯，用例如環(huán)己酮或丙酮的適宜酮和例如三乙酰氧基硼氫化鈉的還原劑在酸性條件下處理式(IV)的化合物，然后除去所述羧酸酯保護(hù)基團(tuán)制備。 R3＝H的式(III)的化合物(1-氨基-6-(氨基甲基)異喹啉)描述在WO98/47876中。R3＝Me的式(III)的化合物(1-氨基-6-(氨基甲基)-3-甲基異喹啉)可以由1-氨基-6-甲氧基-3-甲基異喹啉使用WO 98/47876中所述用于將1-氨基-6-甲氧基異喹啉轉(zhuǎn)化成1-氨基-7-(氨基甲基)異喹啉的步驟制備。1-氨基-6-甲氧基-3-甲基異喹啉可以由3-甲氧基苯基丙酮使用W.Zielinski和M.Mazik在Heterocycles 38，375(1994)中所述的方法制備。
或者，式(I)的化合物可以由式(V)的化合物，通過(guò)例如環(huán)己酮或丙酮的適宜酮和例如三乙酰氧基硼氫化鈉的還原劑在酸性條件下處理式(V)的化合物制備。在該反應(yīng)中式(V)的化合物的芳基胺基團(tuán)可以任選通過(guò)一基團(tuán)如在該還原胺化之后可以除去的苯甲?；右员Ｗo(hù)。 式(V)的化合物可以通過(guò)連接有在N-端用一保護(hù)基團(tuán)如Boc基團(tuán)保護(hù)的二肽的肽和式(III)的化合物使用前面所述的偶聯(lián)劑制備。
α-氨基官能團(tuán)的保護(hù)通常通過(guò)尿烷官能團(tuán)如酸-不穩(wěn)定的叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲氧基羰基(Cbz)基團(tuán)和經(jīng)取代的類似物、堿-不穩(wěn)定的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基團(tuán)或鄰苯二甲?；?Phth)基團(tuán)發(fā)生。其它適宜的氨基保護(hù)基團(tuán)包括Nps、Bpoc、Msc等?？梢圆煌绞竭M(jìn)行保護(hù)基團(tuán)的除去，這取決于這些保護(hù)基團(tuán)的性質(zhì)。通常在酸性條件下在有清除劑的情況下進(jìn)行去保護(hù)。Cbz基團(tuán)也可以通過(guò)催化氫化除去。對(duì)氨基保護(hù)基團(tuán)及其除去方法的概述給在The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，第3卷，E.Gross和J.Meienhofer編輯(Academic Press，New York，1981)。
羧基的保護(hù)可以通過(guò)形成酯，例如堿-不穩(wěn)定的酯如甲酯或乙酯、酸不穩(wěn)定的酯如叔丁酯、或氫化-不穩(wěn)定的酯如苯甲酯進(jìn)行。
本發(fā)明的化合物，可以是自由堿形式，可以可藥用鹽的形式與反應(yīng)混合物分離。這些可藥用鹽也可以通過(guò)用有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸如鹽酸、溴化氫、碘化氫、硫酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、馬來(lái)酸、丙二酸、甲磺酸、富馬酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸和抗壞血酸處理式(I)的自由堿獲得。
本發(fā)明的化合物具有一個(gè)或多個(gè)手性碳原子，并且因此可以純對(duì)映異構(gòu)體、純非對(duì)映異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體的混合物、或者含有非對(duì)映異構(gòu)體的混合物獲得。所述純對(duì)映異構(gòu)體的獲得方法在本領(lǐng)域?yàn)楣?，例如將由光學(xué)活性酸及其外消旋混合物獲得的鹽結(jié)晶，或者使用手性柱色譜。對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體可以使用順相柱或逆相柱。
本發(fā)明的化合物可以經(jīng)腸或者非腸道給藥，并且就人而言優(yōu)選每日劑量是0.001-100mg/kg體重，優(yōu)選0.01-10mg/kg體重。與藥用適宜的輔料混合，例如標(biāo)準(zhǔn)參考，Gennaro等，Remington’sPharmaceutical Sciences，(第18版，Mack Publishing Company，1990，尤其參見(jiàn)第8部分Pharmaceutical Preparations and TheirManufacture)中所述的，可以將這些化合物壓制成固體劑量單元，例如丸劑、片劑，或者加工成膠囊或栓劑。借助藥用適宜的液體，還可以將這些化合物以溶液、懸液、乳液形式施加，例如用作注射劑，或者用作噴劑，例如用作噴鼻劑使用。
為了制備劑量單元，例如片劑，包括使用傳統(tǒng)添加劑如填料、著色劑、聚合粘合劑等。一般說(shuō)來(lái)不與所述活性化合物的功能沖突的任何可藥用添加劑都可以使用。可以組合物給藥的適宜載體包括以適宜量使用的乳糖、淀粉、纖維素衍生物等，或其混合物。
本發(fā)明化合物的消除半衰期和百分比生物利用度可以按照以下試驗(yàn)在狗中適宜地測(cè)定。
在靜脈給藥或口服給藥之后通過(guò)測(cè)定血漿中的抗-IIa活性可以測(cè)定直接凝血酶抑制劑在雌性Beagle狗中的停留時(shí)間和百分比生物利用度。鑒于本發(fā)明蛋白酶抑制劑的選擇性，凝血酶的抑制與測(cè)定的蛋白酶抑制劑的濃度線性相關(guān)。靜脈或口服給藥絲氨酸蛋白酶抑制劑之后，在白天的不同時(shí)間點(diǎn)從頸靜脈收集血液。將這些血液離心之后，在微量滴定平皿顯色試驗(yàn)中使用待測(cè)化合物本身的校準(zhǔn)曲線測(cè)定該血漿樣品的血漿抗-IIa活性。獲得的數(shù)據(jù)由血漿～時(shí)間曲線例如借助計(jì)算機(jī)化迭代程序，根據(jù)Simplex方法進(jìn)行分析。隨后，使用不依賴于濃度的相對(duì)誤差模型計(jì)算消除半衰期，并用梯形規(guī)則測(cè)定曲線下的面積(AUC)。假定線性動(dòng)力學(xué)，通過(guò)口服給藥之后獲得的AUC除以靜脈注射給藥該劑量之后的平均所需標(biāo)準(zhǔn)化AUC(X100％)計(jì)算百分比生物利用度。
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例在BRUKER DRX 400分光光度計(jì)上以400MHz的1H頻率進(jìn)行1H NMR測(cè)定。用PE-sciex API-165記錄質(zhì)譜(MS)。
實(shí)施例1N-環(huán)己基-3-環(huán)己基-D-丙氨酰基-N-[(1-氨基-6-異喹啉基)甲基]-L-脯氨酰胺鹽酸鹽(N-環(huán)己基-D-Cha-Pro-6Aiq.HCl)將0.91g的3-環(huán)己基-N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-D-丙氨?；?L-脯氨酸苯基甲酯(Boc-D-Cha-Pro-OBz1)在2.5mL的二氯甲烷和2.5mL的三氟乙酸中的溶液于室溫下攪拌2小時(shí)之后，將反應(yīng)混合物于真空下濃縮獲得0.94g油。將該油溶于10mL含1％(v/v)乙酸的N，N-二甲基甲酰胺中并加入0.26mL環(huán)己酮和0.64g三乙酰氧基硼氫化鈉。室溫下攪拌16小時(shí)之后向該反應(yīng)混合物中加入5mL水并用二氯甲烷萃取。有機(jī)萃取物在硫酸鎂上干燥并濃縮得到0.90g油(TLC；硅膠，二氯甲烷/甲醇＝95/5(v/v)Rf＝0.8)。將該油溶于50mL乙酸乙酯中，使用乙酸將溶液的pH調(diào)整至5，加入0.10g Pd/C(10％)，并將該懸液于大氣壓、室溫下氫化1小時(shí)。過(guò)濾除去該P(yáng)d催化劑并在減壓下蒸發(fā)除去溶劑。將殘余物溶于甲苯中并在減壓下將甲苯蒸發(fā)得到0.56g的N-環(huán)己基-D-Cha-Pro-OH。將該酸(0.35g)溶于10mL的N，N-二甲基甲酰胺中并加入0.19mg的1-氨基-6-氨基甲基異喹啉(WO9847876)和0.4g的2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)。使用N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)將反應(yīng)混合物的pH調(diào)整至8。室溫下攪拌24小時(shí)之后加入另外的0.1g TBTU，并在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌另外18小時(shí)。之后將反應(yīng)混合物真空濃縮。殘余物溶于50mL的二氯甲烷中并用含水碳酸氫鈉洗滌兩次，在硫酸鎂上干燥并濃縮。將殘余物溶于水中并使用20％A/80％B至20％A/30％B/50％C的梯度洗脫系統(tǒng)在60分鐘內(nèi)以40ml/min的流速直接裝入在預(yù)備的HPLC DeltaPak RP-C18上(A0.5M磷酸鹽緩沖液pH2.1，B水，C乙腈/水＝6/4(v/v))。產(chǎn)量0.25g的標(biāo)題化合物。
1H-NMR 400MHz(CD3OD)δ0.84-2.41(27H，m)，2.91-3.01(1H，m)，3.57-3.65(1H，m)，3.81-3.88(1H，m)，4.30(1H，t，J＝7Hz)，4.49-4.77(3H，m)，7.26(1H，d，J＝7Hz)，7.57(1H，d，J＝7Hz)，7.73(1H，dd，J＝2Hz和J＝9Hz)，7.92(1H，d，J＝2Hz)，8.38(1H，d，J＝9Hz)。
實(shí)施例2N-環(huán)己基-3-環(huán)己基-D-丙氨?；?N-[(1-氨基-3-甲基-6-異喹啉基)甲基-L-脯氨酰胺鹽酸鹽(N-環(huán)己基-D-Cha-Pro-6(3Me)Aiq.HCl)2a.1-氨基-6-甲氧基-3-甲基-異喹啉將2.12g 3-甲氧基苯基丙酮和1.26mL磷酰氯的45mL無(wú)水甲苯溶液在回流下加熱。30分鐘之后將該混合物冷卻至0℃并滴加0.57g氰酰胺的23mL無(wú)水醚溶液。將反應(yīng)混合物加熱至室溫并在該溫度下攪拌1小時(shí)。然后將該攪拌混合物冷卻至0℃并滴加1.5mL四氯化鈦。將該反應(yīng)混合物在回流下加熱2.5小時(shí)，冷卻，加入34mL水，將混合物過(guò)濾并用乙酸乙酯將殘余物洗滌。使用2N氫氧化鈉水溶液使濾液呈堿性并用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)萃取物用生理鹽水洗滌，在硫酸鎂上干燥并濃縮。殘余物通過(guò)二氧化硅色譜法(二氯甲烷/甲醇＝95/5)提純，得到0.42g標(biāo)題化合物。1H-NMR 400MHz(CDCl3)δ2.45(3H，s)，3.91(3H，s)，5.0(2H，br.s)，6.81(1H，s)，6.90(1H，d，J＝3Hz)，7.02(1H，dd，J＝3Hz和J＝9Hz)，7.65(1H，d，J＝9Hz)。2b.1-氨基-6-羥基-3-甲基-異喹啉0℃下將三溴化硼(4mL)的6mL二氯甲烷滴加到1-氨基-6-甲氧基-3-甲基異喹啉(2g)的10mL二氯甲烷的攪拌溶液中。室溫下攪拌16小時(shí)之后將反應(yīng)混合物倒在冰上，除去有機(jī)層并通過(guò)加入濃氨水將含水層的pH調(diào)整至pH9。過(guò)濾收集沉淀物并在真空下干燥得到1.6g標(biāo)題化合物。ESI-MS175(ME+)。2c.三氟-甲磺酸1-氨基-3-甲基異喹啉-6-基酯將1.4g1-氨基-6-羥基-3-甲基-異喹啉和4.3g N-苯基二(三氟甲磺酰亞胺)的19.5mL二氯甲烷和19.5mL二噁烷的混合物在冰浴中冷卻并滴加2.8mL N，N-二異丙基乙基胺。將所得混合物于70℃下加熱24小時(shí)，之后在真空下除去揮發(fā)物。將剩余殘余物溶于乙酸乙酯中，用連續(xù)部分的2N氫氧化鈉水溶液、水和生理鹽水洗滌并干燥(硫酸鈉)。過(guò)濾并濃縮獲得一無(wú)色油，將其在甲苯中研磨得到1.3g固體。甲苯溶液通過(guò)二氧化硅色譜法(甲苯/乙醇＝95/5)提純得到另外0.6g標(biāo)題化合物。總產(chǎn)量是1.9g。ESI-MS307(MH+)。2d.1-氨基-6-氰基-3-甲基異喹啉在190℃下將乙酸鈀(0.28g)加入到三氟-甲磺酸1-氨基-3-甲基異喹啉-6-基酯(1.9g)、氰化鋅(0.74g)和三苯基膦(0.33g)的24mLN-甲基-吡咯烷酮的熱混合物中(放熱！)。在190℃下連續(xù)攪拌2小時(shí)。冷卻至室溫之后，加入乙酸乙酯并將該有機(jī)混合物用2N氨水、水和生理鹽水洗滌并干燥(硫酸鎂)。過(guò)濾和濃縮得到淡棕色油，通過(guò)二氧化硅色譜法將其提純(二氯甲烷/甲醇＝98/2)，得到0.68g標(biāo)題化合物。ESI-MS184(MH+)。
2e.1-氨基-6-(氨基甲基)-3-甲基異喹啉在室溫、氮?dú)猸h(huán)境下向1-氨基-6-氰基-3-甲基異喹啉(0.68g)的15mL四氫呋喃的攪拌溶液中加入8.4mL的2M硼烷-二甲硫絡(luò)合物的四氫呋喃溶液，之后在60℃下加熱50分鐘。將該反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻并慢慢加入7.5mL甲醇。15分鐘之后加入18.8mL的1M氯化氫的醚溶液。將該反應(yīng)混合物加熱至室溫并攪拌另外16小時(shí)。將固體分離得到0.34g的1-氨基-6-(氨基甲基)-3-甲基異喹啉鹽酸鹽。濾液用柱色譜法提純(硅膠；甲醇/氨水＝98/2)，得到另外0.15g的1-氨基-6-(氨基甲基)-3-甲基異喹啉。ESI-MS188(MH+)。
2f.N-環(huán)己基-3-環(huán)己基-D-丙氨?；?N-[(1-氨基-3-甲基-6-異喹啉基)甲基]-L-脯氨酰胺鹽酸鹽(N-環(huán)己基-D-Cha-Pro-6(3Me)Aiq.HCl)室溫下在1小時(shí)內(nèi)向0.17g1-氨基-6-(氨基甲基)-3-甲基異喹啉鹽酸鹽、0.30g N-環(huán)己基-D-Cha-Pro-OH、0.5mL乙腈和0.37mLN，N-二異丙基乙胺的3mL N，N-二甲基甲酰胺的攪拌混合物中加入0.35g六氟磷酸溴三吡咯烷酮鏻(PyBroP)的1.3mL N，N-二甲基甲酰胺溶液。室溫下攪拌24小時(shí)之后將該反應(yīng)混合物于真空下濃縮。將殘余物溶于乙酸乙酯并用碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌，在硫酸鎂上干燥并濃縮。殘余物通過(guò)硅色譜法提純(二氯甲烷/甲醇＝9/1)并從叔丁醇/鹽酸冷凍干燥得到0.13g標(biāo)題化合物。1H-NMR 400MHz(CD3OD)δ0.85-2.40(27H，m)，2.50(0.3H，s)，2.51(2.7H，s)，2.92-3.00(1H，m)，3.54-3.68(1H，m)，3.81-3.88(1H，m)，4.30(1H，t，J＝7Hz)，4.46-4.74(3H，m)，7.02(1H，s)，7.64(1H，dd，J＝2Hz和J＝9Hz)，7.80(1H，d，J＝2Hz)，8.32(1H，d，J＝9Hz)。
實(shí)施例3.
N-環(huán)己基-D-苯基丙氨酰基-N-[(1-氨基-6-異喹啉基)甲基]-L-脯氨酰胺鹽酸鹽(N-環(huán)己基-D-Phe-Pro-6Aiq.HCl)用0.85g N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-D-苯基丙氨?；?L-脯氨酸苯基甲基酯(Boc-D-Phe-Pro-OBzl)開始，使用實(shí)施例1中對(duì)N-環(huán)己基-D-Cha-Pro-OH所述的步驟得到0.82g N-環(huán)己基-D-苯基丙氨?；?L-脯氨酸(N-環(huán)己基-D-Phe-Pro-OH)。將N-環(huán)己基-D-Phe-Pro-OH(0.82 g)溶于10 mL N，N-二甲基甲酰胺并加入0.33 mg1-氨基-6-氨基甲基異喹啉和1.1 g六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓(HATU)，并使用N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)將其pH調(diào)整至8。室溫下攪拌16小時(shí)之后將該反應(yīng)混合物于真空下濃縮。將殘余物溶于50 mL二氯甲烷并用水和鹽水洗滌兩次，在硫酸鎂上干燥并濃縮。將殘余物通過(guò)硅色譜法(二氯甲烷/甲醇(含2％氨水)＝9/1)提純并從叔丁醇/鹽酸冷凍干燥，得到0.19 g標(biāo)題化合物。1H-NMR 400MHz(CD3OD)δ0.87-2.13(14H，m)，2.38-2.45(1H，m)，2.94-3.03(1H，m)，3.06-3.13(1H，m)，3.25-3.38(2H，m)，4.33-4.73(4H，m)，7.25-7.40(6H，m)，7.58(1H，d，J＝7Hz)，7.71(1H，dd，J＝2Hz和J＝9Hz)，7.92(1H，d，J＝2Hz)，8.35(1H，d，J＝9Hz)。
實(shí)施例4.
N-環(huán)戊基-3-環(huán)己基-D-丙氨?；?N-[(1-氨基-6-異喹啉基)甲基]-L-脯氨酰胺鹽酸鹽(N-環(huán)戊基-D-Cha-Pro-6Aia.HCl)使用實(shí)施例1中所述的步驟用0.30 g Boc-D-Cha-Pro-OBzl為原料使用環(huán)戊酮代替環(huán)己酮得到粗N-環(huán)戊基-D-Cha-Pro-6Aiq，使用柱色譜法(硅膠；二氯甲烷/甲醇＝10/1至5/1梯度)提純。從叔丁醇/鹽酸冷凍干燥得到0.16g的標(biāo)題化合物。1H-NMR 400MHz(CD3OD)δ0.85-2.41(25H，m)，3.43-3.52(1H，m)，3.59-3.65(1H，m)，3.80-3.86(1H，m)，4.20(1H，t，J＝7Hz)，4.51-4.73(3H，m)，7.25(1H，d，J＝7Hz)，7.57(1H，d，J＝7Hz)，7.73(1H，dd，J＝2Hz和J＝9Hz)，7.90(1H，d，J＝2Hz)，8.38(1H，d，J＝9Hz)。
實(shí)施例5.
N-(1-甲基乙基)-3-環(huán)己基-D-丙氨?；?N-[(1-氨基-6-異喹啉基)甲基]-L-脯氨酰胺鹽酸鹽(N-(1-甲基乙基)-D-Cha-Pro-6Aiq.HCl)使用實(shí)施例1中所述的步驟用0.92g Boc-D-Cha-Pro-OBzl為原料使用丙酮代替環(huán)己酮得到0.04g N-(1-甲基乙基)-D-Cha-Pro-6Aiq.HCl。1H-NMR 400MHz(CD3OD)δ0.85-2.41(23H，m)，3.27-3.35(1H，m)，3.59-3.65(1H，m)，3.82-3.89(1H，m)，4.27(1H，t，J＝7Hz)，4.51-4.74(3H，m)，7.26(1H，d，J＝7Hz)，7.57(1H，d，J＝7Hz)，7.72(1H，dd，J＝2Hz和J＝9Hz)，7.91(1H，d，J＝2Hz)，8.38(1H，d，J＝9Hz)。
抗凝血酶試驗(yàn)本發(fā)明化合物的抗凝血酶活性是通過(guò)分光光度測(cè)定由凝血酶產(chǎn)生的顯色底物s-2238的水解速度來(lái)評(píng)價(jià)的。將緩沖體系中抗凝血酶活性的該試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)試驗(yàn)化合物的IC50-值。
試驗(yàn)介質(zhì)氨丁三醇-NaCl-聚乙二醇6000(TNP)緩沖液參照化合物I2581(Kabi)載體TNP緩沖液?？梢杂枚讈嗧?、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇幫助增溶，它們?cè)谧罱K反應(yīng)混合物中濃度高達(dá)2.5％時(shí)沒(méi)有副作用。
方法試劑*1.氨丁三醇-NaCl(TN)緩沖液[緩沖液的組成氨丁三醇(Tris)6.057g(50mmol)、NaCl 5.844g(100mmol)，水至1L。37℃下用HCl(10mmol.l-1)]將溶液的pH調(diào)整至7.4；2.TNP緩沖液(將聚乙二醇6000溶于TN緩沖液中得到3g.l-1的濃度)；3.S-2238溶液[將一小瓶S-2238(25mg；Kabi Diagnostica，Sweden)溶于20ml TN緩沖液得到1.25mg.ml-1(2mmol.l-1的濃度)]；4.凝血酶溶液[將人凝血酶(16 000nKat.小瓶-1；Centraal Laboratorium voorBloedtransfusie，Amsterdam，The Netherlands)溶于TNP緩沖液中得到835nKat.ml-1原液。就在使用前將該溶液用TNP緩沖液稀釋得到3.34nKat.ml-1的濃度。]*-所用的所有組分都是分析級(jí)-就水溶液而言使用超純水(Milli-Q質(zhì)量)。
試驗(yàn)和參照化合物溶液的制備將試驗(yàn)和參照化合物溶于Milli-Q水中得到10-2mol.l-1的原始濃度。每一濃度逐步用載體稀釋得到10-3、10-4和10-5mol.l-1的濃度。將這些稀釋液，包括原液，用于本試驗(yàn)(反應(yīng)混合物的最終濃度分別為3.10-3；10-3；3.10-4；10-4；3.10-5；10-5；3.10-6和10-6mol.l-1)。
步驟室溫下將0.075ml和0.025ml試驗(yàn)化合物或參照化合物溶液或載體交替地吸移到微量滴定平皿的孔中，并且這些溶液分別用0.115ml和0.0165ml TNP緩沖液稀釋。將等量的0.030ml S-2238溶液加入每一孔中并將平皿預(yù)熱，在恒溫箱(Amersham)中于37℃下?lián)u動(dòng)預(yù)培養(yǎng)10分鐘。在預(yù)培養(yǎng)之后向每一孔中加入0.030ml凝血酶溶液開始S-2238的水解。在37℃下將平皿培養(yǎng)(搖動(dòng)，持續(xù)30秒)。開始培養(yǎng)1分鐘之后，使用動(dòng)力微量滴定平皿讀數(shù)器(Twinreader plus，F(xiàn)low Laboratories)每2分鐘測(cè)定每一樣品在405nm下的吸光度，持續(xù)90分鐘。
使用LOTUS-MEASURE將所有數(shù)據(jù)收集在IBM個(gè)人計(jì)算機(jī)中。就每一化合物濃度(以mol.l-1反應(yīng)混合物表示)和空白，將其吸光度相對(duì)反應(yīng)時(shí)間(以分鐘計(jì))繪圖。
反應(yīng)的評(píng)價(jià)對(duì)每一最終濃度由試驗(yàn)曲線計(jì)算其最大吸光度。使用如Hafner等的分對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化分析(Arzneim.-Forsch./Drug Res.1977；27(II)1871-3)計(jì)算其IC50-值(最終濃度，以μmol.l-1表示，造成空白的最大吸光度的50％抑制)。
抗凝血酶活性
權(quán)利要求
1.具有式(I)的化合物 其中R1是環(huán)戊基、環(huán)己基或支鏈(3-4C)烷基；R2是環(huán)己基或苯基；R3是H或甲基；和A是未經(jīng)取代的飽和4、5或6-元環(huán)；或其可藥用鹽。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中A是5-元環(huán)。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R2是環(huán)己基。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R3是H。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中R1是環(huán)己基。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中R1是環(huán)己基，R2是環(huán)己基，R3是H且A是5-元環(huán)。
7.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1-6中任一的化合物和藥用適宜的輔料。
8.權(quán)利要求1-6中任一的化合物，用于治療。
9.權(quán)利要求1-6中任一的化合物用于生產(chǎn)用于治療或預(yù)防凝血酶有關(guān)的疾病的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有式(I)的化合物，其中R
文檔編號(hào)A61K38/00GK1441784SQ01812607
公開日2003年9月10日 申請(qǐng)日期2001年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月12日
發(fā)明者J·B·M·萊溫凱爾, C·M·蒂默斯, P·G·M·康蒂 申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾公司