專利名稱：假絲酵母對(duì)三七的生物轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母菌對(duì)中藥三七之主要成分三七皂苷的生物轉(zhuǎn)化方法，具體地說，本發(fā)明涉及利用假絲酵母，特別是利用朗比可假絲酵母對(duì)三七皂苷的生物學(xué)轉(zhuǎn)化方法。經(jīng)過酵母菌的轉(zhuǎn)化后，三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3、Rh2等稀有人參皂苷的含量得以顯著增加。經(jīng)過朗比可假絲酵母轉(zhuǎn)化的三七皂苷可作為原料，用于醫(yī)藥、保健品或者化妝品的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)為五加科植物，以其干燥的根入藥。三七又稱為山膝、田三七、血參、人參三七。三七用于治療疾病已有悠久的歷史，是我國傳統(tǒng)的中藥。三七中皂苷成分是三七主要的生理活性成分。迄今為止，已從三七的不同部位分離得到60余種單體皂苷成分，這些單體皂苷成分大多數(shù)為達(dá)瑪烷型的20 (S)-原人參二醇型[20 (S) -protopanaxadiol]和 20- (S)原人參三醇型[20 (S)-peotopanaxatriol]。三七根中主要有效成分是達(dá)瑪烷型人參皂苷RbpRgpRcURe和三七特有三七皂苷R1,以及少量的稀有人參皂苷Rg2、Rhlt)其中人參皂苷Rb1和Rg1在天然植物中含量較高，而稀有人參皂苷Rg3、Rh2等含量甚微。現(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，三七總阜苷(Panaxnotoginoside, PNS)在耐缺氧、抗衰老、提高機(jī)體免疫力等方面的藥理作用顯著優(yōu)于人參總皂苷，且PNS和部分單體皂苷在血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、物質(zhì)代謝以及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好活性。三七皂苷可通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長或轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化使其逆轉(zhuǎn)、增強(qiáng)和刺激機(jī)體免疫功能等多種方式起到抗腫瘤的作用。三七皂苷包括人參皂苷Rbp Rg1等多種活性單體，具有營養(yǎng)局部皮膚、血管和毛囊組織等功能。有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1具有明顯的抗氧化、抗衰老功能。已有報(bào)道，三七皂苷能促進(jìn)皮膚膠原蛋白合成，具有明顯的抗皮膚衰老作用(王麗紅，吳鐵，吳志華，等.人參皂苷抗皮膚衰老作用實(shí)驗(yàn)研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，19 (I):25-27.)。某些在三七中含量極低的三七皂苷被稱為次級(jí)人參皂苷或稀有人參皂苷。天然的皂苷并不一定是生理活性最高的分子結(jié)構(gòu)，藥理學(xué)研究表明，稀有人參皂苷(如Rh、Rh2, Rg3等)藥效尤為珍貴(李學(xué)哲，樸惠順.人參皂苷Rh2含量測定方法及藥理作用研究現(xiàn)狀.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào),2009,32(2):153-156.；ffang CZ, Xie JT, Fishbein A, etal.Antiproliferative effects of different plant parts of Panax notoginseng onSW480human colorectal cancer cells.Phytother Res，2009，23 (I) 6-13)。這些成分在某些難治性疾病如腫瘤治療方面顯示獨(dú)特的療效。對(duì)皂苷活性的研究還發(fā)現(xiàn)，人參皂苷的抗腫瘤活性與皂苷糖鏈結(jié)構(gòu)的關(guān)系為:苷元>單糖苷>二糖苷>三糖苷>四糖苷(Don DQ，Jin L，Chen YJ.Advances and prospects of the study on chemical constituents andpharmacological activities of panax ginseng.J Shenyang Pharm Univ，1999，16 (2):151-156;竇德強(qiáng)，靳玲，陳英杰.人參的化學(xué)成分及藥理活性的研究進(jìn)展與展望.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，16 (2):151-156)。稀有人參皂苷1^3是從紅參(栽培人參經(jīng)曬干或烘干再蒸制而成)中微量提取的，其提取率僅為0.003%，人參皂苷Rg3可直接作用于癌細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡，抑制腫瘤的生長或誘導(dǎo)其分化使其逆轉(zhuǎn)。(余新建，20 (R)-人參皂苷Rg3抗腫瘤活性研究近況，世界中西醫(yī)結(jié)合雜志2007年增刊，2007，235-236)。以人參皂苷Rg3為主要成分的抗癌新藥參一膠囊已獲國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的中藥一類新藥證書。人參皂苷Rh 2屬微量成分，僅占人參總皂苷含量的萬分之二。人參皂苷Rh 2是一種抗腫瘤天然植物成分，也可由人參皂苷Rg3降解得到。對(duì)小鼠的肺癌細(xì)胞、B16黑色素瘤細(xì)胞、大鼠Morris肝癌細(xì)胞的增殖具有明顯的特異性抑瘤作用，是配合放療、化療增效減毒的首選藥物(陳業(yè)高，黃榮，桂世鴻，等，三七葉苷制備抗癌活性成分20 (R)-人參皂苷-Rh2和人參皂苷Rg 3，化學(xué)研究與應(yīng)用，2004，16 (I):69-70 ;蔣磊，趙壽經(jīng)，梁彥龍，李軍華，HPLC法測定酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷Rh 2的含量，特產(chǎn)研究，2004，I，41-44)。由于次級(jí)人參皂苷含量極低，故很難通過傳統(tǒng)的提取方法得到。但如果對(duì)天然皂苷的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向的改變，就會(huì)得到生理活性更高、應(yīng)用價(jià)值更大稀有皂苷。通常是先從三七提取含量豐富的人參皂苷，然后再將提取得到的人參皂苷降解，由此獲得稀有的次級(jí)人參皂苷。人參皂苷的降解就是將人參皂苷分子上的部分或全部糖基水解，得到含糖基較少的次級(jí)人參皂苷或皂苷元。常規(guī)使用的人參皂苷降解方法包括酸降解法、堿降解法和酶降解法等。本發(fā)明提供了一種用于將三七中人參皂苷轉(zhuǎn)化為次級(jí)人參皂苷或者稀有人參皂苷的微生物學(xué)轉(zhuǎn)化技術(shù)，利用本發(fā)明的方法可以有效地改變皂苷的糖鏈結(jié)構(gòu)，獲得較大量的稀有人參皂苷，因此本發(fā)明的方法具有重要科研意義和產(chǎn)業(yè)上的巨大價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及利用酵母菌對(duì)`中藥三七之主要成分人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化，特別涉及利用朗比可假絲酵母對(duì)三七中人參皂苷的生物學(xué)轉(zhuǎn)化方法。經(jīng)過酵母菌的轉(zhuǎn)化后，三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3等稀有人參皂苷的含量得以顯著增加。三七皂苷各種單體的分離純化和藥理活性的研究發(fā)現(xiàn)，許多稀有皂苷、特別是許多天然來源有限的人參皂苷，例如人參皂苷Rg3等稀有人參皂苷生理活性更高、應(yīng)用價(jià)值更大，具有很好的開發(fā)前景。對(duì)多種稀有皂苷獲得方法的比較研究可以發(fā)現(xiàn)，微生物轉(zhuǎn)化方法獲得的稀有皂苷具有很多特有的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的目的是利用酵母菌對(duì)中藥三七中的人參皂苷的生物學(xué)轉(zhuǎn)化，以獲得具有更高活性的稀有皂苷。其中所說的酵母菌是假絲酵母，特別是朗比可假絲酵母(AS2.1763，Candida lambica,購自中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC,中國北京)。一般說來，制備酵母菌轉(zhuǎn)化三七中人參皂苷的轉(zhuǎn)化物，通常采用粉碎技術(shù)將三七粉碎，過100目網(wǎng)篩，可使三七的轉(zhuǎn)化濃度為轉(zhuǎn)化總體積的2.5% 7.5% (重量/體積)?？梢栽谝呀?jīng)粉碎的三七粉0100目)中加入適量飲用水，浸泡I 3小時(shí)后，然后于大約115 121°C滅菌40分鐘，即得到繼后用于酵母菌轉(zhuǎn)化三七的底物。當(dāng)按上述方法制備的用于酵母菌轉(zhuǎn)化的三七底物滅菌后，溫度降至30°C左右時(shí)，接種預(yù)培養(yǎng)的朗比可假絲酵母菌液(占轉(zhuǎn)化總體積的20% 50%，體積/體積)，于大約25°C 35°C培養(yǎng)2 6天。三七加入朗比可假絲酵母轉(zhuǎn)化的溫度一般是25°C 35°C，搖床培養(yǎng)或者發(fā)酵罐
好氧培養(yǎng)。為了篩選出朗比可假絲酵母對(duì)三七中人參皂苷的最佳轉(zhuǎn)化條件，我們利用正交試驗(yàn)(三因素三水平)方法，采用薄層色譜法(中國藥典2010版一部附錄VIB)以稀有人參皂苷Rg3峰面積為指標(biāo)，結(jié)果顯示，三七濃度為轉(zhuǎn)化總體積的5% (重量/體積)接種量占轉(zhuǎn)化總體積的50% (體積/體積)、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間為96小時(shí)條件下，假絲酵母轉(zhuǎn)化三七皂苷的稀有人參皂苷Rg3含量最高。朗比可假絲 酵母對(duì)三七中人參皂苷的轉(zhuǎn)化正交試驗(yàn)的薄層色譜圖參見附圖1。利用分光光度法(保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范:保健食品中總皂苷的測定)檢測了朗比可假絲酵母轉(zhuǎn)化前后三七總皂苷的變化，其含量提高了 66.10%。假絲酵母轉(zhuǎn)化前后三七總皂苷的變化薄層色譜圖參見附圖2。我們的實(shí)驗(yàn)研究表明，經(jīng)過利用本發(fā)明的方法生物轉(zhuǎn)化的三七，明顯地增加了三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3等稀有人參皂苷的含量。經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化的三七可作為原料，用于醫(yī)藥、保健品或者化妝品的生產(chǎn)。某些在三七中含量極低的人參皂苷即次級(jí)人參皂苷或稀有人參皂苷，具有很強(qiáng)的藥理活性。例如稀有人參皂苷Rg3可直接作用于癌細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡，抑制腫瘤的生長或誘導(dǎo)其分化使其逆轉(zhuǎn)。人參皂苷Rg3還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)作用(余新建，20 (R)-人參皂苷Rg3抗腫瘤活性研究近況，世界中西醫(yī)結(jié)合雜志2007年增刊，2007，235-236)。本發(fā)明的意義在于為中藥三七的轉(zhuǎn)化提供了一種新的、簡便易行的微生物學(xué)方法，和用于轉(zhuǎn)化的無害微生物。從而，為中藥三七在更廣泛的領(lǐng)域內(nèi)更有效地利用提供了前提條件。


附圖1是實(shí)施例1的色譜圖。顯示中藥三七在使用朗比可假絲酵母生物轉(zhuǎn)化正交試驗(yàn)的結(jié)果。從圖中可以看出，三七經(jīng)過朗比可假絲酵母的轉(zhuǎn)化后，稀有皂苷斑點(diǎn)明顯增力口。其中上面的圖是日光下的觀察結(jié)果；下面的圖是365nm熒光下觀察結(jié)果。圖中O為發(fā)酵(轉(zhuǎn)化)前的樣品；1 9為發(fā)酵(轉(zhuǎn)化)后的樣品；S為RbpRejgpRg^Rh2對(duì)照樣品。展開劑為氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15: 40: 22: 10)。附圖2是實(shí)施例2的色譜圖。顯示中藥三七在使用朗比可假絲酵母生物轉(zhuǎn)化(加朗比可假絲酵母發(fā)酵)前和后，三七皂苷薄層色譜圖的變化。色譜圖顯示，三七中的稀有皂苷斑點(diǎn)明顯增加。其中左邊的圖是日光下的觀察結(jié)果；右邊的圖是365nm熒光下觀察結(jié)果。圖中O為發(fā)酵(轉(zhuǎn)化)前的樣品；1為發(fā)酵(轉(zhuǎn)化)后的樣品JSRbpRhRgpRg^Rhji照樣品。展開劑為氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15: 40: 22: 10)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:三七轉(zhuǎn)化濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間、接種量轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響利用正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)了三個(gè)因素包括發(fā)酵轉(zhuǎn)化時(shí)間、三七的轉(zhuǎn)化濃度和朗比可假絲酵母的接種量，每個(gè)因素取三個(gè)水平(具體參見表I)。取干燥的三七，粉碎后，過100目篩，根據(jù)正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)組合的9個(gè)樣品，稱量如表I所示不同重量的三七粉。各樣品加適量飲用水浸泡3小時(shí)后，115°C、40分鐘滅菌。得到不同濃度的三七轉(zhuǎn)化底物，當(dāng)溫度降至30°C左右時(shí)，按照表I中的接種量，接入預(yù)培養(yǎng)的朗比可假絲酵母菌液，30°C搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速IOrpm。不同轉(zhuǎn)化時(shí)間、不同的三七轉(zhuǎn)化濃度和不同朗比可假絲酵母接種量的各實(shí)驗(yàn)樣品稀有人參皂苷Rg3峰面積的數(shù)值參見表2。表I轉(zhuǎn)化因素水平表
權(quán)利要求
1.利用假絲酵母對(duì)三七皂苷的進(jìn)行生物學(xué)轉(zhuǎn)化，以獲得具有更高含量次級(jí)或稀有人參皂苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法包括首先將三七粉碎，過100目網(wǎng)篩后，在已經(jīng)粉碎的三七粉中加入適量的飲用水，浸泡I 3小時(shí)后，然后于大約115°C 121°C滅菌40分鐘，即得到用于假絲酵母菌轉(zhuǎn)化三七的底物，當(dāng)三七底物的溫度降至30°C左右時(shí)，接種預(yù)培養(yǎng)的假絲酵母菌轉(zhuǎn)化三七中人參皂苷，于25V 35°C下培養(yǎng)2 6天，以完成三七人參皂苷的生物學(xué)轉(zhuǎn)化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說的假絲酵母是朗比可假絲酵母菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說的發(fā)酵培養(yǎng)是搖床培養(yǎng)或者發(fā)酵罐好氧培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所說的被轉(zhuǎn)化的三七中稀有人參皂苷可用于生產(chǎn)醫(yī)藥、保健品和化妝品的 原料。
全文摘要
本發(fā)明涉及酵母菌對(duì)中藥三七之主要成分三七皂苷的生物轉(zhuǎn)化方法，具體地說，本發(fā)明涉及利用假絲酵母，特別是利用朗比可假絲酵母對(duì)三七皂苷的生物學(xué)轉(zhuǎn)化方法。經(jīng)過酵母菌的轉(zhuǎn)化后，三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3、Rh2等稀有人參皂苷的含量得以顯著增加。經(jīng)過朗比可假絲酵母轉(zhuǎn)化的三七皂苷可作為原料，用于醫(yī)藥、保健品或者化妝品的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P25/00GK103099832SQ20111035293
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者馮淑琴, 馮淑霞, 馮淑青 申請(qǐng)人:馮淑琴, 馮淑霞, 馮淑青