專利名稱：豬流行性腹瀉S₁蛋白融合基因及重組巨大芽孢桿菌和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的重組菌株，尤其涉及豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因以及含有該融合基因的表達載體，本發(fā)明進一步涉及含有該表達載體的重組巨大芽孢桿菌菌株以及它們在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的應用，屬于豬流行性腹瀉的防治領域。
背景技術：
豬流行性腹瀉(PEDV)是由冠狀病毒引起豬的一種急性高度接觸性傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征，該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，危害嚴重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。病毒主要通過腸道感染豬，具有明顯的腸道組織嗜性的特點，在抗PEDV感染免疫過程中除體液免疫和細胞免疫外，局部腸粘膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮著不可替代的作用。PEDV具有典型的冠狀病毒結構，由4種主要結構蛋白組成，分別為磷酸化的核衣殼蛋白(N)、膜蛋白(M)、糖基化的纖突蛋白(S)和小囊膜蛋白(E)其中S糖蛋白攜帶主要的B淋巴細胞抗原決定簇能夠誘導產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護作用的重要結構蛋白，因此，S蛋白對病毒感染、發(fā)揮其致病性和決定宿主細胞親嗜性方面起關鍵作用。PEDV感染具有明顯的嗜腸性，分泌型IgA抗體是保護豬體不受PEDV感染和免于發(fā)病的關鍵因素，口服免疫后，在腸液和血清中均可檢出SlgA抗體，而非口服途徑接種則檢測不到slgA。仔豬可通過初乳獲得母源slgA，產(chǎn)生對流行性腹瀉的被動免疫保護。常規(guī)的滅活疫苗和弱毒疫苗在防治這兩種疾病中起到了積極作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些問題，如滅活疫苗免疫原性差，不能有效誘導slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接種后的動物機體排散病毒、病毒毒力可能返強等，另外必須通過注射途徑免疫。針對豬流行性腹瀉的特點，采用口服免疫是較為理想的預防途徑，但是如何避免胃腸道對抗原的破壞并有效誘導免疫應答成為關鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種豬流行性腹瀉S1蛋白抗原融合基因及其編碼的蛋白；本發(fā)明的目的之二是提供含有上述豬流行性腹瀉S1蛋白抗原融合基因的表達載體；本發(fā)明的目的之三提供含有上述表達載體的重組宿主菌株。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種由PEDV糖蛋白S的S1抗原位點與化膿鏈球菌細胞壁錨定序列(CWAm6)連接得到的融合基因，其多核苷酸序列為SEQ ID No. 1 所示。本發(fā)明根據(jù)Genbank登錄的PEDV全基因序列AF353511，找出編碼S糖蛋白的 22-505aa段序列，通過柔性的Linker ((GGGGS) 3)將PEDV的S1抗原位點基因和細胞壁錨定序列(CWAm6)連接起來，將該序列命名為MLSJSEQ ID No. 1)?？紤]到巨大芽孢桿菌密碼子的偏嗜情況，本發(fā)明為了提高異源基因在宿主菌中的表達，并保證翻譯后的氨基酸不變的情況下，對稀有密碼子蘇氨酸(ACG)、組氨酸(CAC)、精氨酸(CGG、CGA)、丙氨酸(GCG)和亮氨酸(CTC、CTG)等進行改變。此外，在MLS1的上游和下游分別引入Bgl II酶切位點和SphI 酶切位點。本發(fā)明的另一方面是提供由SEQ ID No. 1所示融合基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示。。本發(fā)明的又一方面是提供含有所述豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因的表達載體；例如，將本發(fā)明SEQ ID No. 1所示的抗原融合基因與表達載體PHIS1525進行可操作性的連接，得到可以在巨大芽孢桿菌的外表面或其細胞壁表達融合基因的分泌表達載體。針對PEDV經(jīng)黏膜感染和SlgA在抵抗疾病中具有重要作用的特點，本發(fā)明構建了表達PEDV S1蛋白的重組巨大芽孢桿菌表達系統(tǒng)，作為一種口服疫苗，通過刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的特異性slgA，達到阻止病原感染的目的。由此，本發(fā)明的再一方面是提供一株表達豬流行性腹瀉Sl蛋白融合基因的重組巨大芽孢桿菌菌株，能夠用其制備成防治豬流行性腹瀉的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本發(fā)明將SEQ ID No. 1所示的融合基因與分泌表達載體pHIS1525進行雙酶切、連接并經(jīng)原生質(zhì)體轉化轉入宿主菌巨大芽孢桿菌WH320細胞，獲得含有重組質(zhì)粒的重組巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌株(WHSZO-pHISlSZS-MLSi)；其微生物保藏號是CCTCC No :M2011445 ；分類命名是Bacillus megaterium WH320-PHIS1525-MLS!；保藏時間是2011 年12月5日；保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址是中國武漢武漢大學。進一步的，本發(fā)明將重組巨大芽孢桿菌菌株(WH320-PHIS1525-MIA)用加入終濃度為0. 2%木糖進行誘導，使融合基因在菌體表面進行表達；免疫印跡實驗表明，所表達的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發(fā)生反應，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，能夠用于制備成防治豬流行性腹瀉的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。間接免疫熒光檢測也證實表達蛋白存在于菌體上，誘導表達后的活菌體免疫熒光試驗表明，所表達的蛋白初步定位于菌體的表面，存在菌體表面的目的蛋白，為抗原物質(zhì)有效刺激免疫系統(tǒng)，提高抗體水平奠定了重要的物質(zhì)基礎。本發(fā)明在實驗設計上以阻斷腸道傳染病疾病病原感染的第一道防線為目的，使用安全無毒的巨大芽孢桿菌表達系統(tǒng)，巨大芽孢桿菌不產(chǎn)細胞內(nèi)毒素，不產(chǎn)胞外堿性蛋白酶， 有利于所表達蛋白的穩(wěn)定積累，質(zhì)粒穩(wěn)定，可以穩(wěn)定高效地表達蛋白，比較適合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。同時芽孢桿菌在腸道定植后，能消耗大量的游離氧，造成厭氧環(huán)境，可減少需氧菌對腸道的定植。也有利于乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的生長，致使體內(nèi)的有益菌增加而致病菌減少，保持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡。本發(fā)明所涉及到的術語定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。術語“重組宿主菌株”或“宿主細胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產(chǎn)生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。
術語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定， 否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代 (Batzer et al. ,Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991) ；Ohtsuka et al. ,J. Biol. Chem. 260 2605-2608(1985) ；Rossolini et al.，Mol Cell. Probes8 :91-98(1994))。術語“表達”為外源基因在宿主中的轉錄或/和翻譯。術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。艮口， 針對多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述術語適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價肽鍵連接。


圖 IPCR 產(chǎn)物電泳結果；1-3、MLS1PCR 產(chǎn)物；M、DL2000。圖2表達質(zhì)粒pHIS1525的酶切檢測；1_2、質(zhì)粒pHIS1525酶切產(chǎn)物；M、DL2000。圖3PCR產(chǎn)物電泳結果；1-3 =Bgl II和SphI雙酶切，得到的片段分別約為7500bp、 1920bp ；Ml :DL2000 ；M2 :DL15000。圖4表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-blot分析；M 蛋白質(zhì)分子量標準； 1 重組巨大芽孢桿菌WH320-pHIS1525誘導后的蛋白質(zhì)；2_4、重組巨大芽孢桿菌 WH320-PHIS1525-MLS!誘導后的蛋白質(zhì)；5 重組巨大芽孢桿菌WH320-pHIS1525_MLS誘導后的蛋白質(zhì)的免疫印跡。圖5表達產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測(X40) ；A :WH320-pHIS1525-MLS重組菌的IFA 試驗結果，菌體細胞散發(fā)了強烈的黃綠色熒光；B :WH320-pHIS1525重組菌的IFA試驗結果， 沒有熒光，菌體呈紅色。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例IMLS1基因巨大芽孢桿菌分泌表達載體的構建及鑒定1抗原表位序列MLS1的設計與合成 根據(jù)Genbank登錄的PEDV全基因序列AF353511，找出編碼S糖蛋白的22_505aa段序列，通過柔性的Linker ((GGGGS) 3)將PEDV的S1抗原位點基因和細胞壁錨定序列(CWAm6)連接起來，該序列命名為MLS1 (SEQ ID No. 1)。對稀有密碼子蘇氨酸(ACG)、組氨酸(CAC)、 精氨酸(CGG、CGA)、丙氨酸(GCG)和亮氨酸(CTC、CTG)等進行改變，但不改變其所編碼的氨基酸。在MLS1的上游和下游分別引入BglII酶切位點和SphI酶切位點。將設計好的MLS1 序列進行人工合成，構建了重組質(zhì)粒PMD18-MIA。pMD18-T Simple Vector 購自 TaKaRa (大連)公司，PMD18-MLS!的具體構建過程如下PCR擴增目的基因，在PCR反應管中按照表1所示加入試劑和溶液。表IMLS1的PCR反應體系
用量(yL) 合成基因模板Γο
dNTPs (2. 5mmol/L)2.0
引物Pl1.0引物 P21.0
IOXExTaq buffer5. 0
ExTaq DNA聚合酶1. 0
二餾水38. 0
總體積50.0Pl :5’ -GA AGA TCT ATGGATGTCACTAGGTGCCAGT 3’P2 :5， -ACAT GCA TGC GTTTTCTTCTTTGCGTTTTACA 3，混勻并離心后放置于PCR儀中，94°C預變性5min后，進行如下循環(huán)94°C，30s ； M°C，30s ;72°C，30s。30個循環(huán)后72°C延伸lOmin。PCR擴增完成后，取5 μ L產(chǎn)物用1 % 瓊脂糖凝膠電泳觀察。并參照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收酶切產(chǎn)物，參照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收PCR反應產(chǎn)物，操作步驟如下將100 μ L PCR產(chǎn)物于1 %的瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外線燈下切下含有目的DNA 的瓊脂糖凝膠，加入3個凝膠體積的DE-A (為DNA凝膠回收試劑盒中的試劑)溶液，混合均勻后于75°C加熱融化。加0.5個DE-A體積的DE-B (為DNA凝膠回收試劑盒中的試劑)溶液，混合均勻。取以上混合液，轉移至DNA制備管中離心棄濾液。將制備管置回離心管，加
0.5mlWl (為DNA凝膠回收試劑盒中的試劑)溶液，12000rpm離心30s，棄濾液。將制備管置回離心管，加0. 7ml W2(為DNA凝膠回收試劑盒中的試劑)溶液，12000rpm離心30s，棄濾液，重復此步驟一次。將制備管置回離心管中，12000rpm離心lmin。將制備管置于潔凈的
1.5ml離心管中，在制備膜正中央加適量(20 μ L)水或洗脫液室溫靜置lmin，12000rpm離心 lmin洗脫DNA。取回收產(chǎn)物1 μ L 1 %瓊脂糖凝膠中進行電泳，檢測回收結果。并于_20°C 保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物與克隆載體的連接及轉化按pMD18-T Simple Vector 說明書將回收的 PCR 產(chǎn)物與 pMD18_T Simple Vector
6連接。連接體系見表2:表2連接反應體系
權利要求
1.豬流行性腹瀉S1蛋白抗原融合基因，其特征在于其多核苷酸序列為SEQID No. 1 所示。
2.由權利要求1所述融合基因編碼的蛋白，其特征在于其氨基酸序列為SEQID No. 2 所示。
3.含有權利要求1所述融合基因的重組表達載體。
4.含有權利要求3所述重組表達載體的重組宿主株。
5.按照權利要求4所述的重組宿主株，其特征在于所述的重組宿主株是重組巨大芽孢桿菌(feci/^As megaterium)菌株，其微生物保藏號是CCTCC No:M2011445。
6.權利要求1所述的豬流行性腹瀉Sl蛋白抗原融合基因在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的用途。
7.權利要求2所述的蛋白在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的用途。
8.權利要求3所述的表達載體在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的用途。
9.權利要求4或5所述的重組宿主株在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的用途。
10.按照權利要求6-9所述的用途，其特征在于所述的疫苗是粘膜免疫活菌疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因及重組巨大芽孢桿菌和應用。本發(fā)明將豬流行性腹瀉病毒S糖蛋白的S1抗原位點和細胞壁錨定序列連接得到SEQIDNo.1所示的抗原融合基因。本發(fā)明進一步的構建了含有該抗原融合基因的分泌表達載體，將其轉化到巨大芽孢桿菌中在其細胞壁或其表面表達重組蛋白。免疫印跡試驗表明，所表達的重組蛋白能夠與PEDV免疫血清發(fā)生反應，表明本發(fā)明所制備的重組蛋白與PEDV天然抗原一樣具有相同的抗原性。誘導表達后的活菌體免疫熒光試驗表明，所表達的重組蛋白定位于菌體的表面。實驗結果表明，本發(fā)明所制備的重組蛋白能夠用于制備成防治豬流行性腹瀉的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
文檔編號A61K39/215GK102399806SQ20111042470
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權日2011年12月16日
發(fā)明者張金林, 胡曉芬, 馬立保 申請人:武漢華揚動物藥業(yè)有限責任公司