專利名稱：用于進行抗葡萄球菌接種的免疫原性組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及葡萄球菌免疫原性組合物和疫苗，它們的制備以及這些組合物在醫(yī)學中的用途。更特別地，它涉及疫苗組合物，包含用于治療或預防葡萄球菌感染的抗原的組合。也提供了所述疫苗在醫(yī)學中的使用和它們的制備方法。
背景技術：
近年來，隨著血管內設備的使用增加，在社區(qū)獲得的和在醫(yī)院獲得的感染數(shù)量都已經(jīng)增加了。在醫(yī)院獲得的(醫(yī)源性)感染是發(fā)病和死亡的主要原因，更特別是在美國，它每年影響了超過200萬患者。根據(jù)各種研究，美國患者的大約6%在他們呆在醫(yī)院期間將獲得感染。估計1992年在美國的經(jīng)濟負擔超過45億美元(Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol. Rev. 6 ;428)。大多數(shù)頻發(fā)感染是尿道感染(UTI-感染的33% )，接下來是肺炎(15. 5%)，外科手術部位感染(14.8%)以及原發(fā)血流感染(13%) (Emori和Gaynes，1993，Clin. Microbiol. Rev. 6 ；428)。金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性的葡萄球菌(大多數(shù)是表皮葡萄球菌)、腸球菌種、大腸桿菌以及綠膿桿菌是主要的醫(yī)源性病原體。盡管那些病原體差不多引起同樣數(shù)量的感染，但是它們可引起的失調的嚴重性再加上抗生素抗性的分離菌的頻率，對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的這個排位進行平衡，它們成為了最重要的醫(yī)源性病原體。金黃色葡萄球菌是有著顯著發(fā)病率和死亡率的醫(yī)源性感染的最通常原因(Romero-Vivas et al 1995，Infect. Dis. 21 ; 1417)。它是骨髓炎、心內膜炎、膿毒性關節(jié)炎、肺炎、膿腫以及中毒性休克綜合征的一些病例的原因。表皮葡萄球菌是正常的皮膚共生生物，也是引起植入的醫(yī)療設備的感染以及在外科手術部位的感染的重要機會致病菌。被金黃色葡萄球菌感染的醫(yī)療設備包括心臟起搏器、腦脊液分流器、連續(xù)流動的腹膜透析導管、整形外科設備以及人工心臟瓣膜。用抗生素治療金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染，青霉素是首選藥物，而萬古霉素用于甲氧苯青霉素抗性的分離菌。自1980年代以來，對抗生素呈現(xiàn)廣譜抗性的葡萄球菌菌株的百分比已經(jīng)變得日益普遍(Panlilo et al 1992, Infect. Control. Hosp.Epidemiol. 13 ;582)，造成了對有效的抗菌治療的威脅。此外，近來出現(xiàn)的萬古霉素抗性的 金黃色葡萄球菌已經(jīng)引起了恐懼，害怕甲氧苯青霉素抗性的金黃色葡萄球菌菌株將會產(chǎn)生并擴散，對此還沒有可用的有效治療。已經(jīng)研究了在被動免疫療法中使用抗葡萄球菌抗原的抗體這一備選方法。包括給予多克隆抗血清的療法正在研發(fā)之中(wo 00/15238, WO 00/12132)，以及用抗脂磷壁酸的單克隆抗體進行治療(W0 98/57994)。備選方法將是使用主動疫苗接種來產(chǎn)生對葡萄球菌的免疫應答。已經(jīng)確定了用作疫苗組分而包含的幾種候選物。這些候選物包括纖連蛋白結合蛋白(US5840846)、MHC II類似物(US5648240)、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、GehD(US 2002/0169288)、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、SdrF、SdrG 和 SdrH(WC) 00/12689)、突變體 SEA 和 SEB 外毒素(WO00/02523)以及52kDa玻連蛋白結合蛋白(W0 01/60852)。金黃色葡萄球菌基因組已經(jīng)被測序，并已經(jīng)確定了許多編碼序列(EP786519，WO02/094868)。對于表皮葡萄球菌同樣如此(W0 01/34809)。作為該方法的改進，其他人已經(jīng)確定了被來自患有葡萄球菌感染的患者的超免疫血清所識別的蛋白質(WO 01/98499，WO02/059148)。靶向金黃色葡萄球菌或靶向它所產(chǎn)生的外蛋白的疫苗的首次產(chǎn)生已經(jīng)獲得了有限成功(Lee 1996 Trends Microbiol. 4 ； 162) 0仍然存在研發(fā)針對葡萄球菌感染的有效疫、苗的需求。因此，本發(fā)明提供了包含至少兩種不同的蛋白或其免疫原性片段的免疫原性組合物，所述蛋白或其免疫原性片段選自以下至少兩組蛋白或免疫原性片段組a)至少一種葡萄球菌胞外成分結合蛋白或其免疫原性片段，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB (FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG> SdrH、酷酶 GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-l、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和 MAP ；組b)至少一種葡萄球菌轉運蛋白或其免疫原性片段，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC和Ni ABC轉運蛋白；組c)至少一種葡萄球菌毒力調節(jié)劑、毒素或其免疫原性片段，其選自a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體、RNA III活化蛋白(RAP)。


圖I-優(yōu)選蛋白質的多肽序列。表I提供了有關每個SEQ ID代表哪個蛋白質的信
肩、O圖2-編碼優(yōu)選蛋白質的核苷酸序列。表I提供了有關每個SEQ ID編碼哪個蛋白質的信息。圖3-天然條件下a毒素的純化。圖A顯示了 a毒素純化期間所制備樣品的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。第I道-分子量標志，第2道-含有過量表達a毒素的可溶性級分，第3道-從Ni-NTA柱流過，第4道-用10%緩沖液B洗脫的級分，第5道-用20%緩沖液B洗脫的級分，第6道-用30%緩沖液B洗脫的級分，第7道-用50%緩沖液B洗脫的級分，第8道-用75%緩沖液B洗脫的級分，第9道和第10道-用100%緩沖液B洗脫的級分，第11道-誘導前在T = 0時的細菌，第12道-誘導后在T = 4時的細菌，第13道-細胞溶胞產(chǎn)物，第14道-可溶性級分，第15道-不溶性級分。圖B顯示了 10、5、2和I ill純化a毒素的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。圖4-變性條件下的SdrC的純化。圖A顯示了 a毒素純化期間所制備樣品的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。泳道M-分子量標志，泳道Start-由含有過量表達SdrC的不溶性級分所形成的上清液，泳道FTl-從Ni-NTA柱流過，泳道C-用漂洗緩沖液C洗脫的級分，泳道D-用緩沖液D洗脫的級分，道E-用緩沖液E洗脫的級分。圖B顯示了 1、2、5和10 ill純化SdrC的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。圖5-在包被了純化蛋白質的平板中抗葡萄球菌蛋白質抗血清的ELISA結果。合并小鼠pre_使用提取自接種前小鼠的合并的血清的結果。合并小鼠PostIII-使用免疫后提取的合并的小鼠血清的結果。合并兔Pre-使用提取自接種前兔的合并的血清的結果。合并兔Post III-使用免疫后提取的合并的兔血清的結果。Blc-陰性對照。圖6-在包被了殺死的葡萄球菌的平板上產(chǎn)生的抗葡萄球菌蛋白質的小鼠抗血清 的ELISA結果。圖A使用由金黃色葡萄球菌血清型5殺死的完整細胞所包被的平板。圖B使用由金黃色葡萄球菌血清型8殺死的完整細胞所包被的平板。圖C使用由表皮葡萄球菌殺死的完整細胞所包被的平板。用方塊符號標記的線顯示使用來自小鼠的抗血清的ELISA結果，該小鼠用所標明的葡萄球菌蛋白質免疫三次。用菱形符號標記的線顯示免疫前小鼠血清的ELISA結果。圖7-在包被了殺死的葡萄球菌的平板上產(chǎn)生的抗葡萄球菌蛋白質的兔抗血清的ELISA結果。圖A使用由金黃色葡萄球菌血清型5殺死的完整細胞所包被的平板。圖B使用由金黃色葡萄球菌血清型8殺死的完整細胞所包被的平板。圖C使用由表皮葡萄球菌殺死的完整細胞所包被的平板。用方塊符號標記的線顯示使用來自兔的抗血清的ELISA結果，該小鼠用所標明的葡萄球菌蛋白質免疫三次。用菱形符號標記的線顯示免疫前兔血清的ELISA結果。
具體實施例方式本發(fā)明公開了葡萄球菌抗原的特定組合，當其組合時，引起有效治療或預防葡萄球菌感染的免疫原性組合物的產(chǎn)生。本發(fā)明的免疫原性組合物合適地摻入了參與不同葡萄球菌感染的抗原。所述免疫原性組合物以針對葡萄球菌功能的不同方面的免疫應答為目標，因此能夠誘導特別優(yōu)選的免疫應答。葡萄球菌感染的發(fā)展經(jīng)過幾個不同階段。例如，葡萄球菌的生存周期包括共棲增殖、通過接觸相鄰組織或血流而開始感染、在血液中的厭氧增殖、金黃色葡萄球菌毒力決定子與宿主防御機制之間的相互作用以及誘導并發(fā)癥包括心內膜炎、轉移性膿腫形成和敗血病綜合征。細菌表面上的不同分子將參與感染周期的不同步驟。通過以針對參與葡萄球菌感染不同步驟的有效量的特定抗原的組合的免疫應答為目標，能夠產(chǎn)生功效增強的葡萄球菌免疫原性組合物或疫苗。特別地，來自不同類型的某些抗原的組合，其中一些參與對宿主細胞的粘附，其中一些參與鐵捕獲或其它轉運蛋白功能，其中一些是毒素或毒力調節(jié)劑和免疫優(yōu)勢抗原，能夠引起防止多階段感染的免疫應答?？梢酝ㄟ^如實施例中描述的動物模型分析法測定和/或使用如實施例中描述的調理吞噬作用分析法測定免疫應答的有效性。本發(fā)明的一個額外優(yōu)點是免疫原性組合物中來自不同蛋白家族的本發(fā)明的抗原組合將能夠產(chǎn)生抗更廣泛菌株的保護作用。本發(fā)明涉及包含多種蛋白的免疫原性組合物，所述蛋白選自至少兩類不同的蛋白，具有具有葡萄球菌的不同功能。這樣的蛋白質種類的例子是胞外結合蛋白質，轉運蛋白諸如Fe捕獲蛋白，毒素或毒力調節(jié)劑以及其它免疫優(yōu)勢蛋白質。本發(fā)明的疫苗組合能夠有效抗同源葡萄球菌菌株(得到抗原的菌株)，并且優(yōu)選也抗異源葡萄球菌菌株。本發(fā)明的免疫原性組合物包含等于或多于2、3、4、5或6種的選自2或3個以下組的多種蛋白質組a)至少一種葡萄球菌胞外成分結合蛋白或其免疫原性片段，其選自層粘連蛋白受體、Si tC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB (FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG> SdrH、酷酶 GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-l、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和 MAP ； 組b)至少一種葡萄球菌轉運蛋白或其免疫原性片段，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC和Ni ABC轉運蛋白；組c)至少一種葡萄球菌毒力調節(jié)劑、毒素或其免疫原性片段，其選自a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體、RNA III活化蛋白(RAP)。例如，第一種蛋白質選自組a)、b)或C)，第二種蛋白質選自一個組，該組選自組a)、b)和C)，其不包括第二種蛋白質。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種選自組a)的蛋白質以及選自組b)和/或組c)的額外蛋白質。在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種選自組b)的抗原以及選自組c)和/或組a)的額外蛋白質。在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種選自組c)的抗原以及選自組a)和/或組b)的額外蛋白質。本發(fā)明的免疫原性組合物合適地含有來自金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的蛋白。蛋白質本發(fā)明的免疫原性組合物包含分離的蛋白質，其包含與圖I的任意序列具有至少85%同一性、優(yōu)選至少90%同一性、更優(yōu)選至少95%同一性、最優(yōu)選至少97-99%或完全同
一性的氨基酸序列。本文在明確提及蛋白質時，優(yōu)選指天然或重組的、全長蛋白質或者任選地已經(jīng)去除了任何信號序列的成熟蛋白質。蛋白質可直接從葡萄球菌菌株中分離或者通過重組DNA技術生產(chǎn)?？蓪⒌鞍踪|的免疫原性片段加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中。這些片段是包含從蛋白質的氨基酸序列連續(xù)選取的至少10個氨基酸、優(yōu)選20個氨基酸、更優(yōu)選30個氨基酸、更優(yōu)選40個氨基酸或50個氨基酸、最優(yōu)選100個氨基酸的片段。此外，這樣的免疫原性片段是與針對葡萄球菌蛋白質而產(chǎn)生的抗體有免疫反應的，或者是與通過用葡萄球菌感染而產(chǎn)生的抗體有免疫反應的。免疫原性片段也包括以有效劑量給予時，(單獨或者作為結合到載體上的半抗原)，引起針對葡萄球菌感染的保護性免疫應答的片段，更優(yōu)選地是對金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染有保護性的。這樣的免疫原性片段可包括例如缺少N末端前導序列、和/或跨膜結構域和/或C末端錨定結構域的蛋白質。在優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性片段包含蛋白質基本上所有的胞外結構域，所述蛋白質在片段序列的整個長度上具有與選自圖I的序列至少85%同一性、優(yōu)選至少90%同一性、更優(yōu)選至少95%同一性、最優(yōu)選至少97-99%同一性。本發(fā)明的免疫原性組合物還可以含有葡萄球菌蛋白質的融合蛋白質或者葡萄球菌蛋白質的免疫原性片段。這樣的融合蛋白質可以重組制備，可包含至少2、3、4、5或6種葡萄球菌蛋白質的一個部分。作為選擇,融合蛋白質可包含至少2、3、4或5種葡萄球菌蛋白質的多個部分。這些融合蛋白質可以將不同的葡萄球菌蛋白質或其片段組合到同一蛋白 質中。作為選擇，本發(fā)明也包括葡萄球菌蛋白質或其片段的單獨的融合蛋白質，作為與異源序列諸如T細胞表位或純化標志的提供者的融合蛋白質，例如P -半乳糖苷酶，谷胱苷肽-S-轉移酶，綠色熒光蛋白(GFP)，表位標志諸如FLAG、myc標志、聚組氨酸，或者病毒表面蛋白質諸如流感病毒血凝素，或者細菌蛋白質諸如破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197。表I下表列出了分別在圖I和圖2中發(fā)現(xiàn)的蛋白質序列和DNA序列的SEQ ID號。SA表示來自金黃色葡萄球菌的序列，SE表示來自表皮葡萄球菌的序列。
___蛋白質序列__DNA序列
免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白__
SASEQ ID I__SEQ ID 34
SE__SEQ ID 2__SEQ ID 35
層粘連蛋白受體___
SASEQ ID 3__SEQ ID 36
SE__SEQ ID 4__SEQ ID 37
分泌抗原A
SA ISEQ ID 5__SEQ ID 38
SA 2SEQ ID 6__SEQ ID 39
SE__SEQ ID 7__SEQ ID 40
SitC__
SASEQ ID 8__SEQ ID 41
SE_ SEQ ID 9SEQ ID 42 —IsaA / PisA (IssA )__
SASEQ ID 10__SEQ ID 43
SE__SEQ ID 11__SEQ ID 44
EbhA / B__
SA EbhASEQ ID 12__SEQ ID 45
SA EbhBSEQ ID 13__SEQ ID 46
SE EbhASEQ ID 14__SEQ ID 47
SE EbhB__SEQ ID 15__SEQ ID 48 累積-結合蛋白Aap__
SASEQ ID 16__SEQ ID 49
SE__SEQ ID 17__SEQ ID 50
RNA III激活蛋白RAP__
SASEQ ID 18SEQ ID 51
SE__SEQ ID 19__SEQ ID 52
FIG / SdrG__
SASEQ ID 20__SEQ ID 53
SE__SEQ ID 21__SEQ ID 54
烊性蛋白結合蛋白Ebps
SASEQ ID 22__SEQ ID 55
SE__SEQ ID 23__SEQ ID 56
胞外蛋白質 EFB SA__SEQ ID 24__SEQ ID 57
A 毒素 SA__SEQ ID 25__SEQ ID 58
SBI SA__SEQ ID 26__SEQ ID 59
IsdA SA__SEQ ID 27__SEQ ID 60
IsdB SA__SEQ ID 28__SEQ ID 61
SdrC SA__SEQ ID 29__SEQ ID 62
ClfA SA__SEQ ID 30__SEQ ID 63
FnbA SA__SEQ ID 31__SEQ ID 64
ClfB SA__SEQ ID 32__SEQ ID 65
凝固酶 SA__SEQ ID 33__SEQ ID 66
FnbB SA__SEQ ID 67__SEQ ID 71
MAP SA__SEQ ID 68__SEQ ID 72
SdrC SA__SEQ ID 69SEQ ID 73
SdrG SASEQ ID 70SEQ ID 74胞外成分結合蛋白胞外成分結合蛋白是結合宿主胞外成分的蛋白質。該術語包括但不限于粘附素。
胞外成分結合蛋白的例子包括層粘連蛋白受體(Naidu et al J. Med. Microbiol.1992,36 ;177)，Si tC/MntC/ 唾液結合蛋白(US5801234，Wiltshire 和 Foster Infec.Immun. 2001,69 ；5198), EbhA(Williams et al Infect. Tmmun. 2002, 70 ；6805), EbhB,彈性蛋白結合蛋白(EbpS)(Park et al 1999，J. Biol. Chem. 274 ;2845)，EFB (FIB)(Wastfelt 和 Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33 ；2347), SBI (Zhang et al FEMS Tmmun.Med. Microbiol. 2000, 28 ；211),自溶素(Rupp et al 2001, J. Infect. Dis. 183 ；1038),ClfA(US6008341，McDevitt et al Mol. Microbiol.1994,11 ；237), SdrC, SdrG(McCreaet al Microbiology 2000,146 ; 1535), SdrH(McCrea et al Microbiology 2000,146 ；1535)，脂肪酶 GehD (US2002/0169288)，SasA，F(xiàn)nbA(Flock et al Mol Microbiol. 1994,12 ；599, US6054572)，F(xiàn)nbB (WO 97/14799，Booth et al 2001 Infec. Immun. 69 ;345)，膠原蛋白結合蛋白 Cna(Visai et al 2000, J. Biol. Chem. 275 ；39837), ClfB (WO 99/27109)，F(xiàn)bpA (Phonimdaeng et al 1988 J.Gen Microbiol. 134 ;75) , Npase(Flock 2001J. Bacteriol. 183 ；3999), IsaA/PisA(Lonenz et al FEMS Tmmuno. Med. Microbiol. 2000,29 ; 145), SsaA (Lang et al FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29 ；213), EPB(Hussain和 Hermann,丹麥 14_17th 關于葡萄球菌的研討會,2000), SSP-1 (Veenstra et al 1996, J. Bacteriol. 178 ；537), SSP-2 (Veenstra et al 1996，J. Bacteriol. 178 ;537)，17kDa肝素結合蛋白 HBP (Fallgren et al 2001，J. Med. Microbiol. 50 ;547)，玻連蛋白結合蛋白(Liet al 2001，Curr. Microbiol. 42 ;361)，纖維蛋白原結合蛋白，凝固酶，F(xiàn)ig(W0 97/48727)以及 MAP (US5648240)。SitC/MntC/唾液結合蛋白這是ABC轉運蛋白，它是肺炎葡萄球菌粘附素PsaA的同源物。它是高度免疫原性的 32kDa脂蛋白，分布在整個細菌細胞壁(Cockayne et al Infect. Immun. 199866 ;3767)。它在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中表達為32kDa脂蛋白，40kDa同源物存在于人葡萄球菌中。在表皮葡萄球菌中，它是鐵調節(jié)操縱子的成分。它顯示了與包括副血鏈球菌的FimA在內的粘附素有相當高的同源性，以及與具有證實的或推定的金屬離子轉運功能的ABC轉運蛋白家族的脂蛋白具有相當高的同源性。因此SitC被包括為胞外結合蛋白和金屬離子轉運蛋白。披露于US5，801, 234的唾液結合蛋白也是SitC的形式，可被包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中。ClfA 和 ClfB這兩種蛋白質都具有纖維蛋白原結合活性，在存在血漿時引起金黃色葡萄球菌形成聚集。它們含有細胞壁相關蛋白質所共有的LPXTG基序。ClfA 描述于 US6008341，ClfB 描述于 WO 99/27109。凝固酶(FbpA)這是一種纖維蛋白原結合蛋白質，在存在血漿時引起金黃色葡萄球菌形成聚集。它描述于涉及到凝固酶的參考文獻中Phonimdaeng et al (J. Gen. Microbio. 1988,134 75-83), Phonimdaeng et al. (Mol Microbiol 1990 ；4 :393-404), Cheung et al. (InfectImmun 1995 ；63 :1914-1920)以及 Shopsin et al. (J.CLin. Microbiol. 2000 ；38 3453-3456)。
包含在本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段包括已經(jīng)去除信號肽(C末端27個氨基酸)的成熟蛋白質。凝固酶具有三個明顯的結構域。氨基酸59-297是卷曲螺旋區(qū)，氨基酸326-505是富含脯氨酸和甘氨酸的區(qū)域，從氨基酸506到645的C末端結構域具有P折疊構象。這些結構域的每一個都是本發(fā)明的優(yōu)選片段。SdrG-Fbe-EfB/FIGFbe是在表皮葡萄球菌的許多分離株中發(fā)現(xiàn)的纖維蛋白原結合蛋白，具有119kDa的推斷分子量(Nilsson et al 1998. Infect. Immun. 66 ；2666)。它的序列與金黃色葡萄球菌的聚集因子(ClfA)的序列相關。抗Fbe的抗體可阻斷表皮葡萄球菌結合到纖維蛋白原包被的平板和導管上(Pei 和 Flock 2001，J. Infect. Dis. 184 ;52)。該蛋白在 WO 00/12689 中也描述為SdrG。SdrG在凝固酶陰性的葡萄球菌中被發(fā)現(xiàn)，是含有LPXTG序列的細胞壁相關蛋白質。SdrG含有信號肽(氨基酸1_51)，含有纖維蛋白原結合位點和膠原蛋白結合位點的區(qū)域(氨基酸51-825)，兩個CnaB結構域(氨基酸627-698和738-809)，SD重復區(qū)(氨基酸825-1000)以及錨定結構域(氨基酸1009-1056)。Fbe具有推定的信號序列，在氨基酸51和52之間帶有裂解位點。因此Fbe的優(yōu)選片段含有Fbe的成熟形式，從氨基酸52延續(xù)到C末端(氨基酸1092)。Fbe從氨基酸52到氨基酸825的結構域負責纖維蛋白原結合。因此Fbe的優(yōu)選片段包含或由氨酸52-825組成。Fbe的氨基酸373和516之間的區(qū)域顯示了 Fbe和ClfA之間的最大保守性。因此優(yōu)選片段將含有Fbe的氨基酸373-516。Fbe的氨基酸825-1041含有高度重復區(qū)，由串聯(lián)重復的天冬氨酸和絲氨酸殘基組成。SdrG的優(yōu)選片段包括已經(jīng)去除了信號肽和/或SD重復序列以及錨定結構域的多肽。這些多肽包括或者由SEQ ID NO :70的氨基酸50-825、氨基酸50-633、氨基酸50-597 (W0 03/76470 的 SEQ ID NO 2)、氨基酸 273-597 (W0 03/76470 的 SEQ ID NO 4)、氨基酸 273-577 (W0 03/76470 的 SEQ ID NO 6)、氨基酸 1-549、氨基酸 219-549、氨基酸 225-549、氨基酸219-528、氨基酸225-528所組成的多肽。優(yōu)選地，將與SEQ ID NO :70、20或21的序列具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%同源性的SdrG多肽加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中。本發(fā)明的組合物任選包含上述SdrG多肽的片段。優(yōu)選片段已經(jīng)去除了信號肽和/或SD重復序列和/或錨定結構域。例如對應于SEQ ID 76 的氨基酸 1-713、1-549、225-549、225-529、24-717、1-707、1-690、1-680、1-670、1-660、1-650、1-640、1-630、1-620、1-610、1-600、34-707、44-697、36-689 的序列或者與 SEQID 70 或 20 或 21 具有 85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或 100% 同一性的序列。去除了信號肽的優(yōu)選片段在片段的N末端具有甲硫氨酸殘基以確保正確翻譯。更優(yōu)選的片段具有下面的序列MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDDNNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDELLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKS⑶TMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNWISGN ⑶ EGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNNDVNINFGNIDSPYIIKVISKYDPNKDDYTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKI⑶YVWEDVDKDGIQNTNDNEKPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDMTIDSGFYQTPKYSLGNYVffYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDS⑶DDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDEEbhA 和 EbhB
EbhA和EbhB是在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者中都表達的蛋白質(Clarke and Foster Infect. Immun. 2002,70 ；6680,Williams et al Infect. Immun. 2002,
20;6805)，它們結合到纖連蛋白。由于纖連蛋白是胞外基質的重要成分，EbhA和EbhB在將葡萄球菌粘附到胞外基質方面具有重要功能。Ebh蛋白質較大，具有I. I兆道爾頓的分子量。由于生產(chǎn)和配制的容易性，使用Ebh蛋白質的片段而不是完整序列是有利的。蛋白質的中部區(qū)域含有不完全重復序列，其含有纖連蛋白結合位點。下述含有一個或多個重復結構域的片段是用來加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段。Ebh蛋白質含有127個氨基酸長度的不完全重復單元，其特征在于含有共有序列L.G. {10} A. {13} Q. {26} L. . . M. . L. {33} A優(yōu)選地 {19} L. G. {10} A. {13} Q. {26} L. . . M. . L. {33} A. {12}更優(yōu)選地.....I/V. . A. . . I/V. . AK. ALN/DG. NL. . AK. . A. {6} L. . LN. AQK. . L. . QI/V. . A..
V. . V. {6}A. . LN/D. AM. . L. . . I/V. D/E. . . TK. S. NY/F. N/DAD. . K. . AY/F. . AV. . A. . I/V. N/D.......其中”代表任意氨基酸，{10}”代表任意10個氨基酸，I/V表示氨基酸的備選。參考Kuroda et al (2001) Lancet 357 ; 1225-1240 中披露的序列以及表 2，很容易推知Ebh蛋白質中的重復序列。包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段包括含有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過10個的127個氨基酸的重復單元的蛋白質。這樣的片段可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多的127個氨基酸的重復區(qū)的重復序列所組成，或者可以由在片段的任一末端或兩個末端帶有額外氨基酸殘基的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多的重復序列所組成。另一種優(yōu)選的片段是跨越三個重復序列(氨基酸 3202-3595)的大約 44kDa 的 H2 多妝，如 Clarke et al Infection and Immunity 70,6680-6687,2002中所描述的。這樣的片段將優(yōu)選能夠結合纖連蛋白和/或引起針對整個Ebh蛋白質有活性的抗體。Ebh蛋白質能夠結合纖連蛋白。這些多肽序列的優(yōu)選片段保持了結合到纖連蛋白的能力。可通過由 Clarke et al (Infection and Immunity 70 ;6680_6687 2002)所描述的ELISA來評估對纖連蛋白的結合。還有另一種優(yōu)選的片段是那些包含B細胞或T輔助細胞表位的片段，例如表3和4中描述的那些片段/肽。表2. Ebh全長序列中的重復序列。Ebh 全長序列披露于 Kuroda et al (2001) Lancet 357 ;1225_1240。下表顯示了127個氨基酸的重復序列在全長序列中開始和結束位置的氨基酸殘基。
權利要求
1.包含至少兩種不同的蛋白或其免疫原性片段的免疫原性組合物，所述蛋白或其免疫原性片段選自以下至少兩組蛋白或免疫原性片段 組a)至少一種葡萄球菌胞外成分結合蛋白或其免疫原性片段，其選自SdrG、層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-l、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和 MAP ； 組b)至少一種葡萄球菌轉運蛋白或其免疫原性片段，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC和Ni ABC轉運蛋白； 組c)至少一種葡萄球菌毒力調節(jié)劑、毒素或其免疫原性片段，其選自a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體、RNA III活化蛋白(RAP)。
2.權利要求I的免疫原性組合物，其中至少一種蛋白或免疫原性片段選自組a)。
3.權利要求I或2的免疫原性組合物，其中至少一種蛋白或免疫原性片段選自組b)。
4.權利要求1-3的免疫原性組合物，其中至少一種蛋白或免疫原性片段選自組c)。
5.權利要求1-4的免疫原性組合物，其中至少一種蛋白或免疫原性片段選自組a)、組b)和組c)。
6 權利要求1-5的免疫原性組合物，包含至少一種來自金黃色葡萄球菌的蛋白或免疫原性片段。
7.權利要求1-6的免疫原性組合物，包含至少一種來自表皮葡萄球菌的蛋白或免疫原性片段。
8.權利要求1-7的免疫原性組合物，進一步包含PIA多糖或寡糖。
9.權利要求1-8的免疫原性組合物，進一步包含來自金黃色葡萄球菌的V型和/或VIII型莢膜多糖或寡糖。
10.權利要求1-9的免疫原性組合物，進一步包含來自表皮葡萄球菌的I型和/或II型和/或III型莢膜多糖或寡糖。
11.權利要求1-10的免疫原性組合物，進一步包含來自革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸。
12.權利要求11的免疫原性組合物，其中脂磷壁酸提取自葡萄球菌。
13.權利要求8-12的免疫原性組合物，其中葡萄球菌莢膜多糖綴合到蛋白質載體上。
14.權利要求11-13的免疫原性組合物，其中脂磷壁酸綴合到蛋白質載體上。
15.權利要求13-14的免疫原性組合物，其中蛋白載體選自破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197、流感嗜血桿菌蛋白D、肺炎球菌溶血素和a類毒素。
16.權利要求1-15的免疫原性組合物，其能夠產(chǎn)生針對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者的有效免疫應答。
17.包含權利要求1-16的免疫原性組合物和藥學可接受賦形劑的疫苗。
18.制備疫苗的方法，包括混合抗原以制備權利要求1-16的免疫原性組合物的步驟以及加入藥學可接受賦形劑的步驟。
19.預防或治療葡萄球菌感染的方法,包括給予有此需要的患者權利要求17的疫苗的步驟。
20.權利要求1-16的免疫原性組合物在制備用于治療或預防葡萄球菌感染的疫苗中的用途。
21.制備用于預防或治療葡萄球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用權利要求17的疫苗免疫受體，并且從受體分離免疫球蛋白的步驟。
22.包含與權利要求1-16的任一項的免疫原性組合物的至少兩種組分具有反應性的兩種或更多種單克隆抗體或其片段的藥物組合物，其中所述至少兩種組分選自組a)、b)和c)的至少兩個組。
23.包含權利要求22的免疫球蛋白和藥學可接受賦形劑的藥物組合物。
24.治療或預防葡萄球菌感染的方法，包括給予患者有效量的權利要求22或23的藥物組合物的步驟。
25.權利要求22或23的藥物組合物在制備用于治療或預防葡萄球菌感染的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于進行抗葡萄球菌接種的免疫原性組合物。具體地，涉及包含葡萄球菌抗原的混合物的免疫原性組合物，該混合物組合了具有不同功能的抗原，例如，包括葡萄球菌胞外成分結合蛋白和葡萄球菌轉運蛋白或葡萄球菌胞外成分結合蛋白和葡萄球菌毒力調節(jié)劑或毒素或葡萄球菌轉運蛋白和葡萄球菌毒力調節(jié)劑或毒素的組合。也描述了疫苗、治療方法、用途和制備葡萄球菌疫苗的方法。
文檔編號A61K39/085GK102657855SQ20121015426
公開日2012年9月12日 申請日期2005年9月20日 優(yōu)先權日2004年9月22日
發(fā)明者C·A·尼特, C·卡斯塔多, J·普爾曼, N·P·F·勒克雷尼耶 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司