專(zhuān)利名稱(chēng)：具有神經(jīng)保護(hù)作用的肽及其制備方法、藥物組合物和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的肽、其制備方法、含有這種肽的藥物組合物及所述肽的制藥用途。
背景技術(shù)：
MLK3(混合性譜系激酶，Mixed lineage kinase 3)是MAPKKK(促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶)家族的MLKs亞家族成員，它通過(guò)磷酸化作用激活MAPK (促分裂原活化蛋白激酶)通路的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是JNK3 (c-Jun N末端激酶家族成員)上游重要激酶(Gallo KA 等人，Nature reviews, 2002 年 9 月，3 (9):663-72 ;Ip YT 等人,Curr Opin CellBiol, 1998,10:205-219)。MLK3 由 SH3 (Src homology 3)結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域、Cd4c2/Rac相互作用的結(jié)構(gòu)域組成，可以通過(guò)277位蘇氨酸和281位絲氨酸發(fā)生自身磷酸化，又可通過(guò)其自身SH3結(jié)構(gòu)域的連接發(fā)揮自身抑制功能，MLK3的自身磷酸化和它的激活有著密切的關(guān)系(Hua Z 等人，J Biol Chem，2001，276:45598-45603)。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷MLK3-MKK7-JNKS信號(hào)通路對(duì)腦缺血、β -淀粉樣肽(Α β )誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷有顯著的保護(hù)作用(Pan J等人，Neuroscience2005 ;131(1):147-59)。以上結(jié)果提示，MLK3信號(hào)通路參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，它和許多促凋亡和抗凋亡因子相互作用并最終決定細(xì)胞的生與死，這種平衡的失常將會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。因此，MLK3是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病新的治療靶點(diǎn)。目前受體酪氨酸激酶TrkA(酪氨酸激酶)抑制劑K252a雖然可抑制MLK3，以抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育(Kaneko M等人，J Med Chem, 1997,40:1863-1869)，但K252a并不是特異性的MLK3抑制劑。CEP1347和CEPl 1004雖然是MLK3抑制劑，但它抑制病理狀態(tài)下過(guò)度活化的MLK3的同時(shí)也抑制了 MLK3的生理功能，在II期臨床實(shí)驗(yàn)中失敗(Parkinson Study Group PRECEPT Investigators.Neurology 2007 ；69:1480-1490)。研究表明,PSD-95(突觸后致密物質(zhì) 95,postsynaptic density-95)與 MLK3 的特異結(jié)合可促進(jìn)MLK3的活化。PSD-95是組成興奮性突觸的突觸后致密物質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，它屬于膜相關(guān)的鳥(niǎo)苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinases,MAGUK)蛋白家族中的一員，又被稱(chēng)為腳手架蛋白，在興奮性突觸的PSD中募集信號(hào)蛋白(Kennedy MB, TrendsNeurosci,1997,20:264-268 ；Sheng M.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,2001, 98:7058-7061 ；Sheng M等人，Science，2002，298:776-780 ;Sheng M.J Cell Sci，2001，114 (Pt 7):1251)。PSD-95由N-端3個(gè)PDZ (PSD-95/Dlg/Z0-l)結(jié)構(gòu)域，I個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域和C-端無(wú)活性的鳥(niǎo)苷酸激酶(GK)結(jié)構(gòu)域組成(Anderson JM.1996 Curr Biol,6:382-384 ；Gonzalez-MariscalL 等人，Semin Cell Dev Biol, 2000，11:315-324)。PSD-95 通過(guò)其 SH3 結(jié)構(gòu)域與 MLK3 的 C末端富含脯氨酸(proline-rich region domain, PRD)的結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成PSD-95-MLK3復(fù)合體(ffhitmarsh AJ 等人，Davis RJ.Science, 1998, 281:1671-1674 ；Savinainen A 等人，JBiol Chem, 2001, 276:11382-11386)。本發(fā)明人的研究表明MLK3在生理狀態(tài)下活性較低，與PSD-95不結(jié)合，但病理狀態(tài)下MLK3與PSD-95結(jié)合增加，并且被激活，從而導(dǎo)致下游信號(hào)通路激活而引起細(xì)胞凋亡，因此阻斷MLK3與PSD-95在病理狀態(tài)下的結(jié)合從而阻斷下游信號(hào)通路的激活對(duì)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)靶向于PSD-95-MLK3復(fù)合體的肽對(duì)病理狀態(tài)下過(guò)度激活的MLK3有抑制作用，從而可用作神經(jīng)保護(hù)藥物。因此，開(kāi)發(fā)這種MLK3特異性肽抑制劑對(duì)研究和開(kāi)發(fā)神經(jīng)元保護(hù)藥物，預(yù)防和/或治療腦卒中、神經(jīng)退行性疾病、癲癇以及疾病的免疫炎性反應(yīng)等的治療藥物具有重要意義。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的為針對(duì)現(xiàn)有MLK3抑制劑的不足，提供新型肽，所述肽可以與MLK3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PSD95的SH3結(jié)構(gòu)域，從而抑制病理狀態(tài)下MLK3-JNK3信號(hào)通路的過(guò)
度激活。本發(fā)明的另一個(gè)目的為提供可以表達(dá)所述肽的核苷酸；此外，本發(fā)明的再一個(gè)目的為提供包含所述肽的藥物組合物；本發(fā)明的目的還在于提供所述肽的制藥用途。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一方面，本發(fā)明提供一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的肽，所述肽的氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1 所示:SEQ.1D.N0.1:Pro Glu Pro Glu Glu Pro Arg Arg Ser Gly Arg Lys Lys ArgArgGln Arg Arg Arg在下文其它部分，S EQ.1D.N0.1所示肽又被簡(jiǎn)稱(chēng)為P2。P2中未加下劃線(xiàn)的部分可以競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合PSD95，干擾MLK3與PSD-95的結(jié)合，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中MLK3的活化及其下游的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用；帶下劃線(xiàn)部分的序列為穿膜肽序列，其幫助小肽進(jìn)入細(xì)胞。穿膜肽序列是一種帶正電荷的短肽，具有穿膜活性，能將外源性的生物學(xué)分子如多肽、寡核苷酸、DNA、蛋白、質(zhì)粒甚至顆粒型物質(zhì)攜帶入多種哺乳動(dòng)物活細(xì)胞，并且對(duì)細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生毒副作用，這種設(shè)計(jì)已被公認(rèn)(Vives E等人，J Biol Chem, 1997, 272:16010-16017)。P2中的穿膜序列可以是其他任何能幫助該肽進(jìn)入細(xì)胞的序列，因此將其修改為本領(lǐng)域現(xiàn)有或未來(lái)開(kāi)發(fā)的穿膜序列而得到的肽都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。下表I列舉了一些常用的穿膜序列，除此之外新型穿膜肽或穿膜序列仍在不斷被報(bào)道，本發(fā)明不能--列舉。表I現(xiàn)有常用穿膜序列
權(quán)利要求
1.一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的肽，所述肽的氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
2.編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述肽的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述肽和根據(jù)權(quán)利要求2所述核苷酸的制備方法，所述制備方法為生物合成或化學(xué)合成方法。
4.一種構(gòu)建體,所述構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列。
5.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽或根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列或者根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建體； 優(yōu)選地，所述藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述載體選自稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑、調(diào)味劑、香味劑等的一種或多種； 優(yōu)選地，所述藥物組合物為片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液或注射液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽或根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列或者根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建體在制備用于預(yù)防和/或治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫炎性疾病的藥物和/或神經(jīng)元保護(hù)藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自神經(jīng)退行性疾病、癲癇以及腦卒中中的一種或幾種； 優(yōu)選地，所述神經(jīng)退行性疾病例如包括老年癡呆和帕金森病。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述藥物選自片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液和注射液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種肽、編碼所述肽的核苷酸序列、包含所述肽的藥物組合物以及所述肽的制藥用途。本發(fā)明提供的肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。所述肽可以干擾MLK3與PSD-95的結(jié)合，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中MLK3的活化及其下游的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，具有良好的藥物應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P25/08GK103159832SQ20111040402
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者侯筱宇, 李婷, 徐珍, 張曉紅, 徐巖, 胡斌 申請(qǐng)人:徐州醫(yī)學(xué)院