專利名稱：斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及斑點叉尾鮰疾病預防用疫苗，具體涉及腸套疊滅活疫苗的制備方法與免疫方法。
背景技術：
斑點叉尾鮰{Ictaclurus punctatus)隸屬It形目，鮰科魚類,又稱溝餘、河餘。其原產地為美國密西西比河，是一種大型淡水性魚類，最大個體可達35kg以上。該魚具有食性雜、抗病力強、適應性廣、生長快、肉質細嫩、營養(yǎng)豐富、經濟價值高等特點。斑點叉尾鮰含肉率為56. 14%，其中粗脂肪占2. 99%，粗蛋白占16. 31%，其肌肉干物質中氨基酸含量為 79. 17%，其中鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨基酸、甘氨酸、丙氨酸)占總氨基酸的6. 36%，具有滋補和催乳功能，深受消費者歡迎。斑點叉尾鮰于八十年代引入我國，在湖北、湖南、四川、重慶、貴州等30多個省市形成了較大規(guī)模的養(yǎng)殖。近年來，隨著網箱養(yǎng)殖的規(guī)模擴大和養(yǎng)殖密度加大，一些地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境惡化，斑點叉尾鮰病害日趨嚴重，暴發(fā)性死亡時有發(fā)生，給養(yǎng)殖戶造成了重大的經濟損失。斑點叉尾鮰腸套疊是近年來發(fā)現的發(fā)病頻率較高的急性傳染性疾病。這種傳染性疾病具有發(fā)病突然，來勢兇猛，傳染快，呈流行性等特點。目前這種疾病在我國相當嚴重。多年來，這種疾病的防治主要依賴抗菌藥物，但隨著社會的發(fā)展，這將受到越來越嚴厲的限制，因此疫苗的開發(fā)與使用已成為必然趨勢。實際上，在過去的10-20年間，接種疫苗預防養(yǎng)殖魚類傳染性疾病已經取得巨大成功。如A. salmonicida、Virbrio sp. , Yersinia sp.等多種疫苗已商業(yè)化。而且不久的將來，巴斯德菌病(Pasteurellosis)和鏈球菌病(Streptococcosis)也有望通過免疫預防得到控制。Ahydrophila感染的免疫預防雖也取得不同程度的成功，在基因工程改良的弱毒疫苗、亞單位疫苗等方面有所突破，但試驗中的疫苗，以單價苗居多，多聯疫苗少見。鑒于斑點叉尾鮰腸套疊可能因多種細菌感染所致，所以研制斑點叉尾鮰腸套疊二聯或多聯滅活疫苗非常必要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供預防斑點叉尾鮰腸套疊的暴發(fā)和傳播的疫苗，提供一種斑點叉尾鮰腸套疊的二聯滅活疫苗的制備方法。利用從病魚體內分離的毒力強的嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌制成的滅活疫苗，對斑點叉尾腸套疊起到有效的保護作用，能有效緩解斑點叉尾鮰的抗藥性和提高斑點叉尾鮰的產量。嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌。該菌是弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，極端單鞭毛，沒有芽胞和莢膜，剛從病灶上分離的病原菌常兩個相連。在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)形成的菌落園形、邊緣光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略帶淡桃紅色有光澤，發(fā)育良好。嗜水氣單胞菌可以產生毒性很強的外毒素，如溶血素、組織毒素、壞死毒素、腸毒素和蛋白酶等。在具有典型出血性腸套疊癥狀的斑點叉尾鮰腸道中可以分離得到致病性強的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和嗜水氣單胞菌，用于制備滅活疫苗。該菌的分離、鑒定等方法前人已有研究。斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗的免疫方法，主要是采用下述方法
A、疫苗的抗原為嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌兩種病原細菌，將滅活完全的菌體按等比例混合制成斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗；
B、用二聯疫苗對斑點叉尾鮰魚體浸泡接種或注射接種免疫。其菌種包括從發(fā)病斑點叉尾鮰體內分離出來的嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。 斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗的制備方法，按以下步驟進行
(1)將嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌分別接種到無菌TSA上，30±0.5°C培養(yǎng)24小
時；
(2)分別將步驟(I)培養(yǎng)好的菌體，接種到無菌TSB中，在震蕩搖床中進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30±0. 5°C，搖床速度280 300r/min，培養(yǎng)時間為24小時；
(3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的菌體分別在常溫下3500r/min離心30鐘，棄上清液，用無菌的O. 85%的生理鹽水稀釋菌體到IO8或109CFU/ml ；
(4)取出步驟(3)中稀釋得到菌液，加入福爾馬林溶液滅活，使福爾馬林的最終濃度為O. 3% (V/V)，32±0. 5°C下滅活 72 小時；
(5)根據斑點叉尾鮰的發(fā)病規(guī)律及程度，將以上兩種滅活菌液以等比例混合制成斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗，置4°C冰箱內儲藏。斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗的制備方法，也可按以下步驟進行
(1)在具有典型出血性腸套疊斑點叉尾鮰病魚體內分離出嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，將兩菌分別接種到TSA中，30 ± O. 5°C培養(yǎng)24小時；
(2)分別將步驟(I)培養(yǎng)好的菌體接種到已經高壓滅菌TSB中，在震蕩搖床中進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30±0. 5°C，搖床速度280 300r/min，培養(yǎng)時間為24小時；
(3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的菌體分別在常溫下3500r/min離心30鐘，棄上清液。用高壓滅菌的O. 85%的生理鹽水稀釋菌體到IO8或109CFU/ml ；
(4)取出步驟(3)中稀釋得到菌液，加入福爾馬林溶液滅活，使福爾馬林的最終濃度為O. 3% (V/V)，在 32±0· 5°C下滅活 72 小時；
(5)根據斑點叉尾鮰的發(fā)病規(guī)律及程度，將以上兩種滅活疫苗以等比例混合制成斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗，置4°C冰箱內儲藏。斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗的免疫方法，可采用浸泡接種或注射接種
A、浸泡接種，取二聯疫苗于容器中，加入蜂膠佐劑，再加入無菌水，使疫苗稀釋200倍，佐劑的最終濃度為O. lmg/ml，攪勻后將魚投入容器內浸泡接種疫苗15 30分鐘；
B、注射接種，將二聯疫苗用O.85%的無菌生理鹽水稀釋5倍，加入蜂膠佐劑，使其最終濃度為O. 01mg/ml，溶解搖勻后，用注射器向魚體腹腔注射，用量為8 10厘米的魚種O. I O. 3ml/ 尾。為了得到良好的預防效果，該疫苗具有嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的滅活菌體，其滅活菌體的濃度為IO7 10lclCFU/ml或IO9 10lclCFU/ml。固體培養(yǎng)基配比蛋白胨IOg,牛肉膏3g, NaCl 5g,蒸懼水1000ml,瓊脂條20g,pH 7· 2 7· 4 ;121°C 滅菌 30min。
肉湯培養(yǎng)基配比蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，pH 7. 2
7.4 ;121°C 滅菌 30min。胰酪胨大豆瓊脂(TSA)配比胰蛋白膝17g，大豆蛋白胨3g，磷酸二氫鉀2. 5g，葡萄糖2. 5g,氯化鈉5g,瓊脂20g,加蒸懼水至1000ml,調pH值至7. 3,121°C滅菌30min。胰酪胨大豆肉湯(TSB)配比胰蛋白膝17g，大豆蛋白胨3g，磷酸二氫鉀2.5g，葡萄糖2. 5g,氯化鈉5g,加蒸懼水至1000ml,調pH值至7. 3,121°C滅菌30min。蜂膠佐劑稱取14g蜂膠，剪碎并硯成粉末，放入棕色廣口瓶中，溶于4倍量95%乙醇中；置25°C水浴24h，其間不斷攪拌；取出后5000r/ min離心lOmin，吸上清液即為蜂膠乙醇浸液；過濾去雜質，用PBS緩沖液(pH7. 2,0. lmol/ L)將所配制的蜂膠稀釋為30mg/ml，4°C避光保存待用。
具體實施例方式實施例I :菌種的分離
(O從具有典型出血性腸套疊癥狀的斑點叉尾鮰中分離出致病菌嗜水氣單胞菌a、采取發(fā)病或瀕死斑點叉尾鮰的肝、脾、腎，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24h，挑取單個菌落獲純培養(yǎng)物后，轉接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上保存，供鑒定用。普通營養(yǎng)瓊脂平板上典型菌落為圓形，無色或淺黃色，半透明，表面光滑，濕潤，邊緣整齊，無水溶性色素。b、取上述斜面上純培養(yǎng)菌，制成涂片標本，經革蘭氏染色鏡檢細菌形態(tài)。普通光學顯微鏡鏡檢結果為革蘭氏陰性短小桿菌，菌體兩端鈍圓或平直，多數單個排列，少數2個排列，無莢膜，無芽孢。再分別接種于血瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)24h，可見血營養(yǎng)瓊脂平板上細菌生長旺盛，典型菌落中I. 5 2. 0mm，菌落圓形、濕潤、光滑、無色、透明，呈露水珠樣，邊緣整齊，菌落周圍有透明溶血環(huán)，呈明顯的β溶血。C、選取分離菌株接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)18 24h，用法國梅里埃產API細菌鑒定條進行生化鑒定(見表I)。表I分離嗜水氣單胞菌菌株生化試驗鑒定結果
項目I結果I項目I結果I項目I結果
甲基紅 +_VP反應_+_檸檬酸鹽_+_
硫化氫試驗 +_水解脲素-_精氨酸雙水解酶 +_
明膠水解 +_海藻糖_+_賴氨酸脫羧酶 +_
乳糖_+_麥芽糖_+_P-甘露醇_+_
P-山梨醇 -_水楊苷_+_酒石酸_-_
氧化酶 ^ 梓檬酸-甘油+
運動性—+ ~爾廢鹽還原 ^~ D-木糖^~
π引哚試驗 I+ Id-葡萄糖產氣 I+ Id-葡萄糖產酸 I+ —
注“+”表示為陽性表示為陰性。d、先進行16SrRNA基因序列測定,然后通過經比對，同源性為99%。e、根據細菌形態(tài)、培養(yǎng)及理化特性測定的結果，并結合16SrRNA基因序列測定的結果，判定供試菌種為嗜水氣單胞菌。(2)從具有典型出血性腸套疊癥狀的斑點叉尾鮰中分離出致病菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌
a、無菌采取發(fā)病或瀕死斑點叉尾鮰的腸、肝、脾、腎，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24h，挑取單個菌落獲純培養(yǎng)物后，轉接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上保存，供鑒定用。普通營養(yǎng)瓊脂平板上典型脂菌落呈灰白色，圓形，表面光滑，邊緣整齊的半透明菌落。b、取上述斜面上純培養(yǎng)菌，制成涂片標本，經革蘭氏染色鏡檢細菌形態(tài)。普通光學顯微鏡鏡檢結果為革蘭氏陰性，菌體直或稍彎，單個或成對存在，為無莢膜，無芽孢，極生多鞭毛的G_桿菌。再分別接種于血瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)24h，出現明顯的溶血環(huán)，且溶血環(huán) 呈草綠色。C、選取分離菌株接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)18 24h，用法國梅里埃產API細菌鑒定條進行生化鑒定(見表2)。表2分離嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌株生化試驗鑒定結果
權利要求
1.斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于 A、疫苗的抗原為嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌兩種病原細菌，將滅活完全的菌體按等比例混合制成斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗； B、用二聯疫苗對斑點叉尾鮰魚體浸泡接種或注射接種免疫。
2.根據權利要求I所述的斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于所述菌種包括從發(fā)病斑點叉尾鮰體內分離出來的嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。
3.根據權利要求I所述的斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于其制備方法按以下步驟進行 (1)將嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌分別接種到TSA，30±0.5°C培養(yǎng)24小時； (2)分別將步驟(I)培養(yǎng)好的菌體，接種到無菌TSB中，在震蕩搖床中進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30±0. 5°C，搖床速度28(T300r/min，培養(yǎng)時間為24小時； (3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的菌體分別在常溫下3500r/min離心30鐘，棄上清液，用無菌的O. 85%的生理鹽水稀釋菌體到IO8或109CFU/ml ； (4)取出步驟(3)中稀釋得到菌液，加入福爾馬林溶液滅活，使福爾馬林的最終濃度為O. 3% (V/V), 32±0· 5°C下滅活 72 小時； (5)根據斑點叉尾鮰的發(fā)病規(guī)律及程度，將以上兩種滅活菌液以等比例混合制成斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗，置4°C冰箱內儲藏。
4.根據權利要求I所述的斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于按以下步驟進行 (1)在具有典型出血性腸套疊斑點叉尾鮰病魚體內分離出嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，將兩菌分別接種到無菌TSA上，30±0. 5°C培養(yǎng)24小時； (2)分別將步驟(I)培養(yǎng)好的菌體，接種到無菌TSB中，在震蕩搖床中進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30±0. 5°C，搖床速度280 300r/min，培養(yǎng)時間為24小時； (3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的菌體分別在常溫下3500r/min離心30鐘，棄上清液，用經無菌的O. 85%的生理鹽水稀釋菌體到IO8或109CFU/ml ； (4)取出步驟(3)中稀釋得到菌液，加入福爾馬林溶液滅活，使福爾馬林的最終濃度為O. 3% (V/V), 32±0· 5°C下滅活 72 小時； (5)根據斑點叉尾鮰的發(fā)病規(guī)律及程度，將以上兩種滅活菌液以等比例混合制成斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗，置4°C冰箱內儲藏。
5.根據權利要求I所述的斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗，其特征在于所述的浸泡接種或注射接種為 A、浸泡接種，取二聯疫苗于容器中，加入蜂膠佐劑，再加入無菌水，使疫苗稀釋200倍，佐劑的最終濃度為O. lmg/ml，攪勻后將魚投入容器內浸泡接種疫苗15 30分鐘； B、注射接種，將二聯疫苗用O.85%的無菌生理鹽水稀釋5倍，加入蜂膠佐劑，使其最終濃度為O. 01mg/ml，溶解搖勻后，用注射器向魚體腹腔注射，用量為8 10厘米的魚種O. I O. 3ml/ 尾。
6.斑點叉尾鮰腸套疊的免疫方法，其特征在于將滅活完全的嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌兩種病原細菌菌體按等比例混合制成斑點叉尾鮰腸套疊二聯滅活疫苗的應用。
全文摘要
本發(fā)明從具有典型出血性腸套疊癥狀的斑點叉尾鮰上分離純化得到致病菌嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。兩株病原菌通過菌體活化，液體擴大培養(yǎng)，然后進行滅活處理，等比例混合得到二聯滅活疫苗。該發(fā)明制備的二聯滅活疫苗制備工藝簡單，成本低，能工廠化生產，且其免疫保護率能達到70%。該疫苗可通過浸泡或者腹腔注射接種斑點叉尾鮰，能有效預防斑點叉尾鮰腸套疊的暴發(fā)，且不污染水域環(huán)境，可在斑點叉尾鮰養(yǎng)殖中使用。
文檔編號A61K39/116GK102641498SQ201210143659
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月10日 優(yōu)先權日2012年5月10日
發(fā)明者何艷林, 劉小燕, 戴振炎, 李權生, 王榮華 申請人:安化縣移民開發(fā)局, 湖南農業(yè)大學