專利名稱：胃泌素釋放肽導(dǎo)向融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
目前治療癌癥有許多手段，其中包括手術(shù)、放療和化療等，手術(shù)是非常有效的一種手段，但受到病種和病程的限制，很多情況下都無法應(yīng)用，放化療是治療癌癥最常見的手段，但其副作用很大，效果不盡如人意，所以人們?cè)噲D找出一種副作用小并且高效的生物治療方法來替代放化療法。本發(fā)明涉及到一種融合蛋白，以胃泌素釋放肽為融合蛋白導(dǎo)向部分，能夠特異性地與過量表達(dá)胃泌素釋放肽受體的腫瘤細(xì)胞相結(jié)合，以假單胞桿菌外毒素A的缺失體 PE40,并且其C末端5個(gè)氨基酸突變?yōu)長ys-Asp-Glu-Leu，即為PE40KDEL作為融合蛋白效應(yīng)部分，特異性地殺死腫瘤細(xì)胞。
二.
背景技術(shù)：
1.本項(xiàng)目融合蛋白的導(dǎo)向部分胃泌素釋放肽(GRP)胃泌素釋放肽(gastrin releasing peptide, GRP)是蛙皮素樣肽的同系物.，是一種胃腸道激素的有效的促分泌素或調(diào)節(jié)肽，是正常人腦、胃的神經(jīng)纖維以及胎兒肺的神經(jīng)內(nèi)分泌組織中存在的激素，許多小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和腫瘤組織中也分泌GRP，且富含GRP 受體(GRPR)。(胃泌素釋放肽前體融合蛋白的制備及其在腫瘤研究中的應(yīng)用。中國藥物與臨床，2007 年 11 期，828-831)目前的研究表明，胃泌素釋放肽受體在許多人類腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生高表達(dá)，如肺癌、 消化道癌和婦科癌中，胃泌素釋放肽受體屬于G蛋白藕聯(lián)受體，其在腫瘤組織中過量表達(dá)， 對(duì)腫瘤組織具有重要的生長效應(yīng)，并且其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤等方面發(fā)揮了重要作用。(胃泌素釋放肽受體在婦科腫瘤中的研究進(jìn)展。國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2010， V29(l) :828-831)2.本項(xiàng)目融合蛋白的毒素部分PE40KDEL假單胞桿菌外毒素A (PEA)是一種多肽毒素，它通過和靶細(xì)胞表面的PEA受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，催化延長因子2 (EF-2)的ADP核糖基化，阻止蛋白質(zhì)合成，而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。PEA 分子由3個(gè)部分組成，包括受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位(跨膜)結(jié)構(gòu)域和活性結(jié)構(gòu)域。為了消除PEA與細(xì)胞的非特異性結(jié)合，我們將PEA分子的受體結(jié)構(gòu)域去除，即去除PEA分子N末端 1-252位氨基酸后，得到了 PE40分子，然后我們將PE40分子的C末端5個(gè)氨基酸進(jìn)行突變， 突變?yōu)長ys-Asp-Glu-Leu，得到了活性更高的毒素部分，PE40KDEL。3.導(dǎo)向部分與毒素部分的連接通過5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)將兩部分通過肽鍵連接起來，順序?yàn)閷?dǎo)向部分(GRP)-5肽-毒素部分(PE40KDEL)，融合蛋白序列見SEQ ID NOl。4.本發(fā)明融合蛋白的特點(diǎn)基于前面所述，胃泌素釋放肽受體在許多人類腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生高表達(dá)，如肺癌、 消化道癌和婦科癌中，其在腫瘤組織中過量表達(dá)，對(duì)腫瘤組織具有重要的生長效應(yīng)，并且其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤等方面發(fā)揮了重要作用。所以目前有很多報(bào)道是針對(duì)胃泌素受體進(jìn)行腫瘤治療的，包括使用GRP的類似物與紫杉醇藕聯(lián)，GRP與單鏈抗體相連，(胃泌素釋放肽受體在腫瘤治療中的研究進(jìn)展。世界華人消化雜志，2009年，V17(l) :63-67) GRP與光標(biāo)記或者金屬螯合劑藕聯(lián)(改進(jìn)的胃泌素釋放肽化合物。中國專利，申請(qǐng)?zhí)?200710188657. 5)。這些技術(shù)在針對(duì)腫瘤治療存在了一定的局限性，比如，GRP與紫杉醇等化療藥相藕聯(lián)，由于其藕聯(lián)方式的問題，化療藥容易脫落，造成藥物失效，并且化療藥由于不具有選擇性，在整體藥物到達(dá)腫瘤部位之前容易侵害正常細(xì)胞；其次，GRP與單鏈抗體相連，由于單鏈抗體的作用沒有全抗體的作用強(qiáng)，所以其僅僅起到抑制腫瘤細(xì)胞的作用，而由于腫瘤細(xì)胞增殖的快速性，無法起到有效控制腫瘤的目的；GRP與光標(biāo)記或者金屬螯合劑藕聯(lián)，目前主要是作為診斷來使用，作為治療手段無法高效地殺死腫瘤細(xì)胞。通過本發(fā)明有效地解決了上述各種方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明是使用GRP作為導(dǎo)向， PE40KDEL作為毒素部分，能夠高效地殺死腫瘤細(xì)胞。由于二者是通過5肽肽鍵進(jìn)行相連，所以不會(huì)有藥物脫落的問題；并且毒素部分只有在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，才能夠發(fā)揮殺死細(xì)胞的作用，而正常細(xì)胞表面沒有GRP受體或含量極低，所以其對(duì)于正常細(xì)胞的毒性非常小，而是特異性殺死腫瘤細(xì)胞，并且由于PE40KDEL殺死腫瘤細(xì)胞的高效率，作為治療手段能夠控制腫瘤的發(fā)展。本專利發(fā)明了一類新型導(dǎo)向藥物，是選擇GRP以及細(xì)胞毒素的小功能片段組成的融合蛋白導(dǎo)向藥物，其具有分子量小，用量少和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本專利中的藥物導(dǎo)向部分包括GRP，針對(duì)效應(yīng)部分我們將PEA分子的受體結(jié)構(gòu)域去除，即去除PEA分子N末端1-252位氨基酸后，得到了 PE40分子，然后我們將PE40分子的C末端5個(gè)氨基酸進(jìn)行突變，突變?yōu)長ys-Asp-Glu-Leu，得到了活性更高的毒素部分， PE40KDEL。通過5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)將兩部分通過肽鍵連接起來，順序?yàn)閷?dǎo)向部分(GRP)-5肽-毒素部分(PE40-KDEL)，融合蛋白氨基酸序列見SEQ ID NOl。作為本發(fā)明中的融合蛋白，是一類自然界沒有的人工蛋白，其特征為GRP和 PE40KDEL組成的融合蛋白，可以使用一種具有序列表中SEQ ID NOl的序列，也可以使用對(duì)序列表SEQID NOl中融合蛋白的氨基酸序列加以修飾，如插入，缺失，突變某個(gè)或某些氨基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。換句話說，也可以使用采用其氨基酸序列大體上與序列表SEQ ID NOl中融合蛋白氨基酸序列相同的蛋白，即使用氨基酸序列具有大于等于90%序列同一性的變體或其功能性片段。本發(fā)明的另一方面，涉及一種藥物組合物，其含有本發(fā)明所述的融合蛋白，以及任選的藥物上可接受的載體。在本發(fā)明知，術(shù)語“藥物上可接受的”意味著制藥領(lǐng)域公認(rèn)的可用于動(dòng)物，更特別的是可用于人的。術(shù)語“載體”指稀釋劑、佐劑(例如(完全或不完全)弗氏佐劑)、賦形劑、或用于容納或施用治療劑的介質(zhì)。這些藥用載體可以是無菌液體，諸如水和油，包括源自石油、動(dòng)物、植物、或合成的油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、諸如此類。靜脈內(nèi)施用藥用組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液態(tài)載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、諸如此類。如果需要， 組合物還可以包含較少數(shù)量的潤濕或乳化劑如透明質(zhì)酸鈉，或是PH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠囊粉劑、緩釋配方、諸如此類的形式。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物為凍干注射劑形式，其中含有 0. 01% -0. 2%的融合蛋白，以及5%的甘露醇，以及藥物上可接受的載體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，所述融合蛋白可以通過基因重組表達(dá)的方法或者化學(xué)合成的方法制備。在本發(fā)明中，所述融合蛋白是通過基因工程重組表達(dá)的方法獲得的。實(shí)例一重組融合蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建和工程菌的獲得以設(shè)計(jì)好的SEQ ID NOl氨基酸序列為模板，根據(jù)中心法則，選擇大腸桿菌偏好的密碼子，得到融合蛋白的所對(duì)應(yīng)的核酸序列，再使用全基因合成技術(shù)得到上述目的基因片段。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉的重組技術(shù)獲得重組基因載體PUC-GRP2，對(duì)插入載體的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定。驗(yàn)證其基因序列的正確性后，擴(kuò)增保存，從該載體上切取下目的基因片段，插入表達(dá)載體中，重組質(zhì)粒命名為PGRP2。然后用CaC12法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3， 涂布在含有抗生素的篩選平板培養(yǎng)基表面，挑選陽性菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為 0. 6-0. 8時(shí)加入IPTG 1. OmM誘導(dǎo)3-4小時(shí)離心收集菌體，8M尿素破菌后12% SDS-PAGE電泳時(shí)出現(xiàn)一條明顯的蛋白表達(dá)帶，表達(dá)量為40%。經(jīng)天然型PE的單克隆抗體免疫印跡檢定， 顯示陽性反應(yīng)，再把重組表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)宿主菌中，經(jīng)培養(yǎng)表達(dá)，疏水層析和離子交換層析得到目的蛋白GRP-PE40KDEL，用MTT細(xì)胞測(cè)活法測(cè)定GRP-PE40KDEL的殺傷腫瘤細(xì)胞的活性，所獲得的高效表達(dá)融合蛋白的工程菌命名為PGRP2/BL21DE3。實(shí)例二目的蛋白的表達(dá)1)搖瓶表達(dá)將如上述制備的基因工程菌PGRP2/BL21DE3，在LB培養(yǎng)基中搖瓶過夜培養(yǎng)(37°C，200rpm)，再按體積比1 30接種至LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3小時(shí)后，加入 0. ImMIPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。收集菌體經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)融合蛋白(43KD)以可溶性表達(dá)為主，表達(dá)量占菌體總蛋白的40%。2)大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)a.培養(yǎng)基組成a)種子液培養(yǎng)基(LB)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升。b)上罐培養(yǎng)基(15升)磷酸氫二鈉250克、磷酸二氫鉀110克、氯化鈉13.克、氯化銨30克、胰蛋白胨120克。以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨(dú)滅菌后加入發(fā)酵罐。硫酸鎂30克、葡萄糖450克、補(bǔ)料(500克/升)葡萄糖。發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)i)種子培養(yǎng)從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升Q50毫升的三角瓶)LB中，36°C、200 轉(zhuǎn)/分、8小時(shí)后將這50毫升種子液轉(zhuǎn)接到700毫升LB中，36°C、200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)過夜。ii)發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)過程
將培養(yǎng)好的種子液(0D600 = 5-8)加入罐中，調(diào)好各參數(shù)，36 °C、150轉(zhuǎn)、溶氧 100%,開始發(fā)酵；5小時(shí)后開始以2. 5速流加2小時(shí)，約加入800毫升補(bǔ)料，加入0. 5克IPTG 誘導(dǎo)(五小時(shí))。實(shí)例三目的蛋白純化(1)疏水層析采用疏水層析介質(zhì)(Octyl Sepharose 4Fast Flow)，平衡液A采用25mM Tris-HCl，pH8，IM硫酸銨，平衡后，裂菌的離心上清上樣(補(bǔ)硫酸銨至1M)，用A平衡5個(gè)柱體積后，線性梯度洗脫，0-20個(gè)柱體積，1-0. IM硫酸銨，收集融合蛋白峰。(2)陰離子交換層析采用Source 30Q陰離子交換層析介質(zhì)，平衡液A為25mM Tris-HCl，pH8，平衡，上一步得到的樣品用水稀釋4倍上樣，平衡，線性梯度洗脫，0-20個(gè)柱體積，0-0. 5M NaCl，收集目的融合蛋白峰。(3)陰離子交換層析采用 Q Sepharose High Performance 層析介質(zhì)，平衡液為 20mM PB, pH7. 4，上一步得到的樣品用水稀釋3倍進(jìn)行上樣，平衡后采用20mM PB，pH7.4，0-lM NaCl，0_10個(gè)柱體積的梯度洗脫，收集目的蛋白洗脫峰。實(shí)例四活性測(cè)定(MTT法)用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖中活細(xì)胞的數(shù)目，以此確定融合蛋白殺傷各種腫瘤細(xì)胞的活力，所選的腫瘤細(xì)胞包括SPC (人肺腺癌細(xì)胞)、MGC (人胃癌細(xì)胞)、PC-3(人前列腺癌細(xì)胞)和A549(人肺癌細(xì)胞)。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板3塊，每孔接種細(xì)胞數(shù)為IX 104、每塊培養(yǎng)板每種細(xì)胞重復(fù)接種20個(gè)孔，37°C、5% C02條件下培養(yǎng)，然后分別加入等比稀釋的融合蛋白樣品，繼續(xù)培養(yǎng)對(duì)，48及7 后，每孔加5g/L MTT 20 μ 1再培養(yǎng)4h，然后去上清液加入二甲亞砜200 μ 1，將培養(yǎng)板放在微量振蕩器上振蕩lOmin，待MTT被細(xì)胞還原形成甲顆粒完全溶解后，立即用酶標(biāo)儀、波長570nm測(cè)定其吸光度，然后通過標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算公式計(jì)算出目的蛋白活性。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算其平均IC50值。結(jié)果見表1，表1.實(shí)例中的融合蛋白細(xì)胞活性
權(quán)利要求
1.一種基因工程融合蛋白，具有SEQ ID NOl所示的氨基酸序列。
2.一種多核苷酸序列，其編碼如權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
3.權(quán)利要求1中的融合蛋白為主要成分的藥物組合物，主要攻擊胃泌素釋放肽受體異常表達(dá)的各類腫瘤細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3中的重組載體的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1中的融合蛋白，是使用基因工程重組表達(dá)載體經(jīng)過轉(zhuǎn)化、發(fā)酵和純化而得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可以定向殺死腫瘤細(xì)胞的融合蛋白，是由胃泌素釋放肽(GRP)組成的導(dǎo)向部分和由細(xì)胞毒素組成的效應(yīng)部分構(gòu)成，具有定向到達(dá)并殺死過量表達(dá)GRP受體的腫瘤細(xì)胞的特性。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102250252SQ20101017337
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者李詠梅, 李樹民, 莘旭妮 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所