專利名稱：含有氨基酸加合鹽的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種以氨基酸加合鹽，其溶劑化物或其生理上可接受的鹽為活性成分的藥物組合物以及該組合物在治療栓塞性疾病和癌轉移中的應用。
血栓性疾病(例如中風、腦卒中、心肌梗死和半身不遂)的發(fā)生率和死亡率均居各種疾病之首。由癌細胞轉移形成的繼發(fā)性癌引起的癌癥病人死亡大約占癌癥病人死亡人數(shù)的80％。目前，應用藥物抗栓和溶栓仍然是治療血栓性疾病的主要手段。由于現(xiàn)有藥物尚難以滿足臨床需要，研究開發(fā)療效更好的新藥成為研究者努力的方向。以粘附受體為靶點設計和尋找新的優(yōu)秀抗血栓藥物，是當前使用的一種有效方法。
由于血小板活化在血栓形成中起重要作用。纖維蛋白原中的RGD序列與活化的血小板表面受體結合是血栓形成的共同通路(Andrieux，A.，Hudry-Clergeon G.，Ryckewaert J.J.，et al.，Amino acid sequences infibrinogen mediating its interaction with its platelet receptor，GP IIb/IIIa，J.Biol，Chem.1989，264(16)，9258-9265)。國內(nèi)外一些研究人員以阻斷該通路為目標，進行了一系列含RGD多肽藥物的篩選工作(PlowE.F.，Pier-schacher M.D.，Ruoslahti K.，et al.，The effect of Arg-Gly-Asp-containing peptides on fibrinogen and von willebrand factor bindingto platelets，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82，8057-8061；Lender A.，Yao W.Q.，Sprengeler P.A.，Design and synthesis of sulfur-free cyclichexapeptides which contain the RGD sequence and bind to the fibrinogenGP IIb/IIIareceptor，Int.J.Peptide Protein Res，1993，42，509-517；Lucchessi B.R.，Rote W.E.，Driscoll E.M.，et al.，Prevention ofthrombosis and rethrombosis and enhancement of the thrombolyticactions of recombinant tissue-type plasminogen activator in the canineheart by DMP 728，a glycoprotein IIb/IIIaantagonist，Br.J.Pharmacol.，1994，113，1333-1343；Nichols A.J.，Vasko J.A.，Valocik R.E.，et al.，The in vitro pharmacological profile of SK&106760，a novel GP IIb/IIIaantagonist，Throb.Res.1994，75(2)，143-156；彭師奇，趙明，王超等，心血管活性多肽以及它們的合成和在醫(yī)學中的應用，發(fā)明專利申請公開說明書，95106340.5，中華人民共和國專利局，1997年4月2日)。這些研究帶有兩個明顯的特點，一是篩選的化合物都需要靜脈給藥，二是通過抑制活化的血小板聚集達到阻斷血栓形成最后通路的目標。αIIbβ3受體由α和β兩條跨膜亞鏈聚集構成，通過“活化”或信號“外化”介導它們對配體的親和度(Williams M.J.，Maghes P.E.，O’toole T.E.，et al.，Trends Cell Biol.，1994，4，109-112；SchwartzM.A.，Schaller M.D.，Gimsberg M.H.，Annu.Rev.Cell Biol.，1995，11，549-599)。信號“外化”可以包括由αIIbβ3胞漿區(qū)到細胞外區(qū)的構象變化的增殖，導致高親和性的配基結合(O’toole T.E.，Loftus J.C.，Du X.et al.，Cell Regul.，1990，1，883-893；Sims P.J.，Ginsberg M.H.，Plow E F.，et al.，J.Biol.Chem.，1991，266，7345-7352)。α和β亞單元的胞漿區(qū)享有類似的近膜機構，該機構在膜-胞漿界面之后有非極性殘基順序地連接極性殘基的序列，α亞基為GFFKR，β亞基為LLv-iHDR(高度保守的殘基大寫，低保守的殘基小寫，破折號為不保守的殘基)。無論是去除α亞單元還是β亞單元的胞漿區(qū)的這些殘基，都會“活化”整合素，把整合素鎖定在高親和狀態(tài)(O’Toole T.E.，Mandelman D.，F(xiàn)orsyth J.，et al.，Science，1991，254，845-847；O’TooleT.E.，Katagiri Y.，F(xiàn)aull R.J.，et al.，J.Cell Biol.，1994，124，1047-1059；Hughes P.E.，O’Toole T.E.，Ylanne Y.，et al.，J.Biol.Chem.，1995，270，12411-12417；Crowe R.，Kern A.，Marcantonio E.E.，Mol.Biol.Cell，1995，6，997-1010)。研究整合素的組裝表面，發(fā)現(xiàn)在α亞單元和β亞單元胞漿區(qū)的近膜部分存在一種相互作用(Briesewitz R.，KernA.，Marcantonio E.E.，Mol.Biol.Cell，1994，269，14411-14418)，這種相互作用是通過α的R995和β的D723之間形成鹽橋來實現(xiàn)的(Hughes P.E.，Diaz-Gonzalez F.，Leong L.，et al.，J.Biol.Chem.，1996，271(12)，6571-6574)。這種鹽橋破壞時，整合素進入活化狀態(tài)。保持鹽橋的穩(wěn)定性，可以維持血小板的靜息狀態(tài)。
已見文獻報道的抗血栓多肽藥物設計的共同點是，血小板活化之后以拮抗作用的多肽競爭αIIbβ3受體，抑制作用發(fā)生在整合素進入活化狀態(tài)之后。本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，保持α亞單元的R995和β亞單元的D723之間形成鹽橋的穩(wěn)定狀態(tài)，使整合素不發(fā)生活化，保持與配基的低親和狀態(tài)，是抗血栓多肽藥物設計的新途徑。從化學觀點看，中和-D(723)·+R(995)鹽橋的電性或置換鹽橋的任一離子，均可造成-D(723)·+R(995)鹽橋的解體。只要在受體附近提供一種緩沖環(huán)境，緩沖任何中和鹽橋電性的傾向，或消除置換鹽橋基團的企圖，都可以保持鹽橋的穩(wěn)定性，抑制血栓形成。
本發(fā)明篩選了一系列與-D(723)·+R(995)性質(zhì)類似的鹽類作為鹽橋穩(wěn)定劑，發(fā)現(xiàn)氨基酸復鹽具有鹽橋穩(wěn)定化作用，其中氨基酸加合鹽顯示優(yōu)秀的抗血栓作用。本發(fā)明提供了具有以下結構的氨基酸加合鹽，其溶劑化物或其生理上可接受的鹽AA·BA其中AA代表L型或D型氨基酸如天冬氨酸，谷氨酸等，BA代表L型或D型氨基酸如精氨酸，賴氨酸，組氨酸，鳥氨酸，色氨酸等，本發(fā)明典型的化合物如下
(分子量307)氨基酸加合鹽目前是作為普通的化學試劑應用的(SIGMA公司的化學試劑手冊)，未見用于藥物的報道。
本發(fā)明提供的氨基酸加合鹽，其pH為中性，不影響體內(nèi)前列環(huán)素(PGI2)的水平，對胃粘膜無刺激性、既不會造成胃粘膜局部缺血和壞死，也不會引起血栓反彈，顯示了良好的應用前景。
本發(fā)明提供的氨基酸加合鹽及其藥物組合物是用通用的方法制備的。
本發(fā)明提供的氨基酸加合鹽藥物組合物可以包括多種劑型，如片劑，膠囊，粉劑，顆粒劑，溶液劑，酏劑，栓劑，透皮劑，噴霧劑和注射劑以及各種緩釋，控釋，填埋劑型等，上述劑型的藥物組合物可以包括任何藥物可接受的載體，這些藥物可接受的載體可以是常用的賦形劑、稀釋劑，適合這些制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的實例包括以下物質(zhì)填料和增量劑，例如淀粉、糖、甘露糖醇和硅酸衍生物；粘合劑，例如羧甲基纖維素和其它的纖維素衍生物，藻酸鹽，明膠和聚乙烯吡咯烷酮；增濕劑，例如甘油；崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；延緩溶解的試劑，例如石蠟；加速再吸收劑，例如季銨化合物；表面活性劑，例如十六烷醇、甘油單硬脂酸酯；吸附載體，例如高嶺土和膨潤土；以及潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、固體聚乙二醇等。
以下實施例用于說明本發(fā)明，這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應當理解為對本發(fā)明的限制，實施例中的氨基酸加合鹽均為天冬氨酸和精氨酸的加合鹽。實施例1氨基酸加合鹽的制備7.39g(55.56mmol)L-Asp，9.67g(55.56mm01)L-Arg及20ml蒸餾水于室溫下攪拌2小時，得到的均相溶液過濾，濾液減壓濃縮，得到16.38g(98％)白色結晶型產(chǎn)物。飛行時間質(zhì)譜176[Arg+1]+。
HPLC檢測，HP1090液相色譜儀，C18反向柱，水(100％-35％)/乙腈(0％-65％)梯度洗脫，流速為1ml/min，洗脫時間30分鐘，最高柱壓250Bar，單峰，樣品純度不低于99％，保留時間為6.868min。紅外吸收光譜(IR)用Perking-Elmer983紅外吸收光譜儀測定，掃描方式3，噪音濾器1，分辨率5.0，縱坐標％T，縱坐標低點15，掃描范圍4000-600cm-1，吸收度0.50，樣品制備方法KBr壓片。主要吸收峰3000cm-1(寬帶，ν+NH3)，1610cm-1(寬帶，δ+NH3)，1520cm-1(寬帶，δ+NH3)，1600cm-1(VC＝O，不對稱)，1410cm-1(VC＝O，對稱)。
實施例2血液流變學實驗30只雄性Wistar大鼠(體重220-260g)，隨機分為三組，空白對照組用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，陽性對照組用阿司匹林灌胃(36mg/kg，懸浮于0.2％CMC中，4ml/只)，用藥組氨基酸加合鹽灌胃(61.4mg/kg，溶于CMC中，4ml/只)，每天灌藥1次，連續(xù)灌8天，第九天灌藥后1小時用戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)經(jīng)腹主動脈取血，用R80 VISCOMETER型血流變儀(北京世帝科學儀器公司產(chǎn)，錐板式)檢測各流變學參數(shù)，結果見表1。表1.血流變測值(n＝10)檢驗項目檢驗結果空白對照組陽性對照組 用藥組全血高切值 8.74±1.475.82±0.545.44±1.13(CP)100全血中切值 10.45±2.056.74±0.526.51±1.58(CP)10全血中切值(CP)312.69±2.957.93±0.507.93±2.23全血低切值(CP)116.76±4.80 10.07±0.51 10.51±3.50ESR血沉(mm/h) 2.20±0.923.90±0.884.50±1.90紅細胞壓積(％) 47.40±2.22 43.70±1.70 43.30±2.26全血高切還原粘 16.44±3.11 11.07±1.24 10.17±2.32度全血低切還原粘34.59±10.2120.84±1.3121.70±7.17度紅細胞聚集指數(shù) 1.93±0.261.74±0.11 1.88±0.31血沉方程K值 9.90±4.38 18.40±4.38 21.20±9.64表1的數(shù)據(jù)表明，與阿司匹林一樣，氨基酸加合鹽可以改善大鼠的血流變狀況。實施例3抗血小板聚集實驗30只雄性Wistar大鼠(體重220-260g)，隨機分為3組，空白對照組用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，陽性對照組用阿司匹林灌胃(36mg/kg，懸浮于0.2％CMC，4ml/只)，用藥組氨基酸加合鹽灌胃(61.4mg/kg，溶于0.2％CMC，4ml/只)，每天灌藥一次，連續(xù)灌8天，第九天灌藥后1小時先用戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，然后用硅化注射器(其中裝有1/9血量的3.8％枸櫞酸鈉溶液)經(jīng)腹主動脈取血，取得的血漿以1000轉/分離心5分鐘，取上層PRP。余下的血漿以4000轉/分離心10分鐘，取上層PPP調(diào)節(jié)PRP中的血小板數(shù)，使血小板數(shù)在60萬-70萬/μl。將調(diào)好的PRP裝入比濁管中，加入終濃度為1mmol/l的ADP作誘導劑，用Born氏比濁法測定5分鐘內(nèi)的血小板最大聚集率。儀器為BS631型血小板聚集儀(北京生化儀器廠出品)。結果見表2。表2.氨基酸加合鹽抗ADP誘導的血小板聚集作用組別 空白對照組 陽性對照組 用藥組最大聚集率 32.88±6.62 16.88±5.67**10.75±3.62**#(％X±S)聚集抑制率 -48.40±14.06**65.00±12.59**#(％X±S)
n＝10；**與空白對照組比較，p＜0.01；#與陽性對照組比較，p＜0.05結果表明，阿司匹林和氨基酸加合鹽相比，雖然都能有效地抑制ADP誘導的血小板聚集(p＜0.01)，但氨基酸加合鹽比阿司匹林更優(yōu)秀(p＜0.05)。實施例4抗血小板粘附實驗1.30只雄性Wistar大鼠(體重220-260g)，隨機分為3組，空白對照組用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，陽性對照組用阿司匹林灌胃(36mg/kg，懸浮于0.2％CMC，4ml/只)，用藥組氨基酸加合鹽灌胃(61.4mg/kg，溶于0.2％CMC中，4ml/只)，每天灌藥一次，連續(xù)灌8天，第九天灌藥后1小時用戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，注射(3mg/kg)肝素抗凝，采用玻璃球柱法測定抗血小板粘附作用。結果見表3。
表3.氨基酸加合鹽的抗血小板粘附作用組別 空白對照組 陽性對照組 用藥組粘附數(shù) 121.48±23.5893.70±42.74 59.10±18.30#(103/mm3)粘附率(％) 30.50±6.47 22.80±10.20 14.50±4.72#n＝10；#與陽性對照組比較，p＜0.05結果表明，與阿司匹林不同，氨基酸加合鹽有明顯的抗血小板粘附作用。實施例5凝血象實驗30只雄性Wistar大鼠(體重220-260g)，隨機分為3組，空白對照組用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，陽性對照組用阿司匹林灌胃(36mg/kg，懸浮于0.2％CMC，4ml/只)，用藥組氨基酸加合鹽灌胃(61.4mg/kg，溶于0.2％CMC中，4ml/只)，每天灌藥一次，連續(xù)灌8天，第九天灌藥后1小時用戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，腹主動脈取血(3ml，0.3ml 3.8％枸櫞酸鈉溶液抗凝)，用Thromboscreen 400C全自動分析儀(德國產(chǎn))測定凝血象，結果見表4、表5和表6。
表4.凝血酶(原)時間(秒)組別 空白對照組陽性對照組用藥組血漿復鈣時間 128.40±25.31 130.80±27.85 143.70±65.46凝血酶時間 47.98±10.3548.37±8.5641.14±7.97凝血酶原時間21.92±3.3121.35±3.5017.48±3.12部分凝血活酶時 26.80±3.9729.68±4.2029.38±4.65間n＝10表5.FP含量組別 空白對照組 陽性對照組用藥組含量(X±S) 251.68±125.60 191.01±63.85 279.60±126.32*n=10；*與陽性對照組比較，p＜0.05表6.優(yōu)球蛋白溶解實驗組別空白對照組陽性對照組用藥組結果-----++ -------- +--+---+-- -- +-
n＝10結果表明，氨基酸加合鹽與阿司匹林一樣對凝血象無明顯影響。實施例6出血時間和凝血時間實驗(1)30只雄性Wistar大鼠(體重220-260g)，隨機分為3組，空白對照組用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，陽性對照組用阿司匹林灌胃(36mg/kg，懸浮于0.2％CMC，4ml/只)，用藥組氨基酸加合鹽灌胃(61.4mg/kg，溶于CMC，4ml/只)，每天灌藥一次，連續(xù)灌8天，第九天灌藥后1小時測定出血時間和全血凝固時間，結果見表7。
表7.出血時間和凝血時間(秒)組別 空白對照組 陽性對照組 用藥組出血時間 43.00±11.30 61.00±15.17**80.90±11.89**##凝血時間100.10±19.56139.00±35.20**185.80±37.43##n＝10；**與空白對照組比較，p＜0.01；##與陽性對照組比較，p＜0.01結果表明，雖然氨基酸加合鹽與阿司匹林一樣，都可明顯延長小鼠尾動脈出血時間及全血凝固時間，但氨基酸加合鹽更優(yōu)秀。
(2)30只昆明種雄性小白鼠(體重18-20g)，隨機分為3組，空白對照組用0.2％CMC灌胃(0.25ml/只)，陽性對照組用阿司匹林灌胃(36mg/kg，懸浮于0.2％CMC，0.25ml/只)，用藥組氨基酸加合鹽灌胃(61.4mg/kg，溶于0.2％CMC中，0.25ml/只)，一次給藥，用藥前禁食4小時，自由飲水，給藥后1小時測定小鼠尾動脈出血時間，結果見表8。
表8.出血時間(秒)組別 空白對照組陽性對照組 用藥組出血時間 211.40±51.44 322.30±146.12*540.80±289.74**#n＝10；*與空白對照組比較，p＜0.05；**與空白對照組比較，p＜0.01；#與陽性對照組比較p＜0.05結果表明，一次服用氨基酸加合鹽對小鼠尾動脈出血時間的延長優(yōu)于與阿司匹林。實施例7.血栓形成實驗(1)30只雄性Wistar大鼠(體重380-410g)，隨機分為3組，空白對照組用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，陽性對照組用阿司匹林灌胃(36mg/kg，懸浮于0.2％CMC，4ml/只)，用藥組DR加合鹽灌胃(61.4mg/kg，溶于0.2％CMC，4ml/只)，每天灌藥一次，連續(xù)灌8天，第九天灌藥后1小時用戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，仰臥位固定，分離氣管，氣管中插入一塑料套管供必要時吸出氣管分泌物用，分離右頸總動脈及左頸外靜脈。在外徑2mm的硅油化聚乙烯管中加入準確稱重的6cm長4號手術縫合線，聚乙烯管中充滿肝素生理鹽水溶液(50u/ml)。將聚乙烯管的一端插入頸外靜脈，往靜脈內(nèi)準確注入肝素(50u/kg)抗凝，再將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈。打開動脈夾，使血液從右頸總動脈經(jīng)聚乙烯管返回左頸外靜脈。血流持續(xù)15分鐘后中斷血流，迅速取出帶血栓的絲線稱重，用減重法計算血栓濕重。帶血栓絲線在干燥器中放置4天，再用減重法稱重計算血栓干重。結果見表9。
表9.絲線血栓重量(mg)組別 空白對照組陽性對照組 用藥組血栓濕重(X±S) 7.12±1.60 4.90±0.96**3.75±0.82**血栓干重(X±S) 1.60±0.35 0.99±0.20*0.83±0.18*n＝10；*與空白對照組比較，p＜0.05；**與空白對照組比較，p＜0.01(2)30只雄性Wistar大鼠(體重370-400g)，隨機分為3組，空白對照組用0.2％CMC灌胃(4ml/只)，陽性對照組用阿司匹林灌胃(36mg/kg，懸浮于0.2％CMC，4ml/只)，用藥組DR加合鹽灌胃(122mg/kg，溶于0.2％CMC，4ml/只)，一次給藥，灌藥前禁食4小時，自由飲水。灌藥后1小時用戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，仰臥位固定，分離氣管，氣管中插入一塑料套管供必要時吸出氣管分泌物用，分離右頸總動脈及左頸外靜脈。在外徑2mm的硅油化聚乙烯管中加入準確稱重的6cm長4號手術縫合線，聚乙烯管中充滿肝素生理鹽水溶液(50u/ml)。將聚乙烯管的一端插入頸外靜脈，往管內(nèi)準確注入肝素(50u/kg)抗凝，再將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈。打開動脈夾，使血液從右頸總動脈經(jīng)聚乙烯管返回左頸外靜脈。血流持續(xù)15分鐘后中斷血流，迅速取出帶血栓的絲線稱重，用減重法計算血栓濕重。帶血栓絲線在干燥器中放置4天，再用減重法稱重計算血栓干重。結果見表10。
表10.絲線血栓重量(mg)組別空白對照組陽性對照組用藥組血栓濕重(X±S) 27.23±8.80 15.41±2.95**15.54±5.11**血栓干重(X±S) 5.69±1.233.00±0.60**3.29±1.46**n＝10；**與空白對照組比較，p＜0.01結果表明，DR加合鹽和阿司匹林一樣均可有效地抑制血栓形成。
權利要求
1.含有氨基酸加合鹽，其溶劑化物或其生理上可接受的鹽的藥物組合物，所述氨基酸加合鹽用如下通式表示AA·BA其中AA代表L型或D型氨基酸，BA代表L型或D型氨基酸。
2.權利要求1的藥物組合物，其中AA代表L型或D型酸性氨基酸，如天冬氨酸，谷氨酸，BA代表的L型或D型堿性氨基酸，如精氨酸，賴氨酸，組氨酸，鳥氨酸，色氨酸，
3.權力要求2的藥物組合物，其中的氨基酸加合鹽為下式化合物
(分子量307)
4.權利要求1的藥物組合物，作為蛋白粘附受體抑制劑用于治療或預防血栓性疾病。
5.權力要求1的藥物組合物，作為蛋白粘附受體抑制劑，用于治療或預防各類癌轉移。
6.權力要求1的藥物組合物，含有藥物可接受的載體。
7.權力要求1的藥物組合物，包括AA·BA與一種或幾種抗血栓藥物或溶栓藥物組成的復方藥物組合物。
8.權力要求1的藥物組合物，包括AA·BA與一種或幾種抗癌藥組成的復方藥物組合物。
9.可以通過口服，注射，透皮，舌下，直腸或呼吸道給藥的權利要求1的藥物組合物，
10.權利要求1的藥物組合物，包括片劑，膠囊劑，粉劑，顆粒劑，溶液劑，酏劑，栓劑，透皮劑，噴霧劑和注射劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有氨基酸加合鹽,其溶劑化物或其生理上可接受的鹽的藥物組合物:AA·BA,其中:AA代表L型或D型氨基酸,BA代表L型或D型氨基酸,該組合物可用于治療或預防血栓性疾病。
文檔編號A61K31/185GK1242192SQ98103040
公開日2000年1月26日 申請日期1998年7月21日 優(yōu)先權日1998年7月21日
發(fā)明者彭師奇, 王超, 趙明, 李春波, 毛偉, 呂志強 申請人:浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠