專利名稱：包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的穩(wěn)定的藥 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包括生長激素的穩(wěn)定的藥物制劑，制備這種制劑的方法，用于穩(wěn)定生長激素制劑的包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的用途和用于治療易受生長激素影響的疾病的方法。
背景技術：
人和常見家養(yǎng)動物的生長激素是垂體腺前頁合成和分泌的約191個氨基酸的蛋白。人類生長激素由191個氨基酸所組成。
生長激素是涉及不僅身體生長的調(diào)節(jié)，而且蛋白、碳水化合物和脂類代謝調(diào)節(jié)的一種關鍵性激素。生長激素的主要作用是促進生長。
生長激素影響的器官系統(tǒng)包括骨骼、結(jié)締組織、肌肉和內(nèi)臟如肝臟、腸及腎臟。
直到現(xiàn)在的導致如人類生長激素(hGH)和Met-hGH以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的重組技術和生長激素基因的克隆開發(fā)以前，人類生長激素僅可從人類尸體的垂體腺中提取而獲得。生長激素很有限的供應限制其用于童年和青春期侏儒癥治療中的縱向生長促進中，盡管已提議其特別用于治療矮的身材(由于生長激素缺乏，正常的矮身材及唐氏綜合癥)、成年人生長激素缺乏、不育、燒傷治療、傷口愈合、營養(yǎng)不良、骨頭接合、骨質(zhì)疏松癥、迷散性胃出血以及偽關節(jié)(psendoarthrosis)。
此外，生長激素已被提議用于增加家養(yǎng)動物的生長速度或降低人類消費的宰殺動物的脂肪比例。
生長激素的藥物制劑趨于不穩(wěn)定。產(chǎn)生了降解產(chǎn)物如脫酰胺或磺化(sulfoxydated)產(chǎn)物以及二聚體或多聚體形式-尤其在生長激素溶液中。
hGH顯著的降解反應為1)通過直接的水解的脫酰胺作用或通過環(huán)狀的琥珀酰亞胺中間體以形成不同量的L-asp-hGH、L-iso-asp-hGH、D-asp-hGH和D-iso-asp-hGH(參考1-3)，和2)位置14和位置125甲硫氨酸殘基的氧化作用(參考4-9)。在凍干狀態(tài)及溶液中hGH的主要降解產(chǎn)物為脫酰胺的hGH。
脫酰胺作用尤其發(fā)生于位置149的天冬酰胺并以較少的程度發(fā)生于位置152的天冬酰胺。
位置14和125的hGH也很容易被氧化，尤其在溶液中(4-8)。
hGH在溶液中形成磺化物(sulfoxides)的氧化一般是由于溶于制劑中的氧氣。氧氣在蒸餾水中的溶解性約200μM(9)。由于在制劑中包括4IU/ml的hGH的濃度相應于60nm的hGH為1.3mg/ml，故在正常的貯存條件下，氧氣將以超過約3000倍用于hGH氧化的化學計量的量存在。在封閉(taping)和包裝制劑以前通過去除緩沖液中的氣體以試圖解決此問題是不切合實際的。
目前，認為這些脫酰胺形式和氧化形式的hGH應該具有無毒或沒有改變的生物學活性或受體結(jié)合特性，但有跡象表明磺化物的構(gòu)型穩(wěn)定性較天然hGH降低。
為了開發(fā)包括hGH的穩(wěn)定、溶解的制劑，知道脫酰胺和磺化物形成速度以及控制反應的方法是至關重要的。
降解的動力學依賴于hGH配方中的溫度、pH和不同的添加劑或佐劑。
由于不穩(wěn)定性，為了最大限度地減少降解，目前，生長激素被凍干并于4℃以凍干形式貯存直至重新調(diào)配使用。
目前，包括hGH的凍干藥物制劑由病人重新調(diào)配且然后在達14天的使用期內(nèi)于4℃作為溶液貯存，這其中將發(fā)生部分降解。
此外，凍干生長激素重新調(diào)配的方法讓病人為難。因此，目前優(yōu)選在使用前盡可能晚地重新調(diào)配生長激素并以凍干狀態(tài)貯存和運輸制劑。從生產(chǎn)商到用藥的環(huán)節(jié)適宜于在控制的低溫如4℃處理制劑，在此溫度下允許達2年的長時間保存壽命(shelflife)。
然而，用于自我療法的筆式系統(tǒng)(pen systems for self-medication)的擴展使用和使用的擴展領域要求在終末使用者不可總得到“足夠”冷卻的條件下穩(wěn)定足夠長時間的制劑。
優(yōu)選地，對于終末使用者，制劑應以凍干狀態(tài)穩(wěn)定約一種月并且在盒式使用的試用期(the intended period of use of a cartridge)在筆式裝置(in a pen device)以重新調(diào)配的狀態(tài)額外穩(wěn)定一種月。
因此，需要更為穩(wěn)定的生長激素制劑，其在凍干狀態(tài)在相對較高的溫度時穩(wěn)定一段時間并且在溶液中相對較高的溫度時額外穩(wěn)定一段使用期。當將生長激素的施用從診所轉(zhuǎn)移到不可得到上述最佳貯存的待治療個體家中時這種穩(wěn)定作用是非常重要的。
此外，為了利于病人進行處理，生長激素施用方式換成使用筆式裝置要求包括生長激素的穩(wěn)定的溶解制劑?？芍苽浒ㄉL激素穩(wěn)定的溶解制劑，病人易于使用的適于筆式裝置的小盒形式(in the form ofcartridges fitting into the pendevice)，然后病人可避免重新調(diào)配制劑并且，因此，將不必具有凍干的制劑，用于重新調(diào)配的合適賦形劑(vehicle)以及用于制劑無菌調(diào)配的必需技巧和無菌設備。
為了安全的原因，避免剛好制劑使用前重新調(diào)配凍干的制劑也將是必需的。
此外，避免生長激素制劑制備中的凍干步驟也將是個優(yōu)勢。凍干是一種耗時且昂貴的方法并且由于冷凍干燥器有限的容量也經(jīng)常是制備中的“瓶頸”。
因此，為了使溶解hGH的制劑在保存期和達一種月的使用期穩(wěn)定需要降低降解過程的速度。
穩(wěn)定hGH的以前嘗試在防止二聚體形成中沒有完全成功。Becker，G.W.，生物技術和應用生化9，478(1987)中記錄了與二聚體形成有關的問題。
國際專利公開No.WO89/09614和澳大利亞專利申請No.30771/89公布了一種含有人類生長激素甘氨酸和甘露醇的穩(wěn)定藥物制劑。這種制劑在凍干狀態(tài)的正常處理和貯存過程中以及重新調(diào)配后的使用期內(nèi)顯現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性。
公開的歐洲專利申請No.303 746公開了動物生長激素可以不同的穩(wěn)定劑穩(wěn)定以導致不溶物減少的形成和水環(huán)境中可溶性活性的保存，這種穩(wěn)定劑包括某些多元醇、氨基酸、在生理pH時具有帶電側(cè)基的氨基酸聚合物和膽堿鹽。多元醇選自非還原性糖、糖醇、糖酸、季戊四醇、乳糖、水溶性葡聚糖和Ficoll；氨基酸選自甘氨酸、肌氨酸、賴氨酸或其鹽、絲氨酸、精氨酸或其鹽、甜菜堿、N，N-二甲基-甘氨酸、天冬氨酸或其鹽、谷氨酸或其鹽；在生理pH時具有帶電側(cè)基的氨基酸聚合物選自多聚賴氨酸、多聚天冬氨酸、多聚谷氨酸、多聚精氨酸、多聚組氨酸、多聚烏氨酸及其鹽；且膽堿衍生物選自膽堿氯化物、膽堿檸檬酸二氫鹽、膽堿酒石酸氫鹽、膽堿碳酸氫鹽、三膽堿檸檬酸鹽、膽堿抗壞血酸鹽、膽堿硼酸鹽、膽堿葡萄糖酸鹽、膽堿磷酸鹽、二(膽堿)硫酸鹽和膽堿mucate。
美國專利說明No.4,917,685公開了一種設計待輸入(implanted)的包括用與EP303746中提到的相同穩(wěn)定劑穩(wěn)定的生長激素的運載系統(tǒng)。
公開的歐洲專利申請No.374,120公開了一種包括hGH和具有三個羥基多元醇的穩(wěn)定制劑。提到甘油和三(羥甲基)氨基甲烷。此外，公開了組氨酸鹽酸鹽與多元醇一起作為緩沖液的存在。
國際專利公開No.WO93/12811公開了以凍干粉形式或包括天冬酰胺水溶液形式的生長激素穩(wěn)定制劑。
國際專利公開No.WO93/12812公開了以凍干粉形式或包括組氨酸水溶液形式的生長激素穩(wěn)定制劑。在這種制劑中脫酰胺作用與相應的包括磷酸鹽緩沖液生長激素的制劑相比降低了25-30％。
國際專利公開No.WO93/19776公開了包括檸檬酸鹽作為緩沖液的包括生長激素的蛋白制劑，其較包括磷酸鹽緩沖液的制劑更為穩(wěn)定。該制劑也可包括氨基酸如甘氨酸和丙氨酸和/或甘露醇或其它糖醇和/或甘油和/或其它碳水化合物及任選包括防腐劑如苯甲醇。
國際專利公開No.WO94/03198公開了一種穩(wěn)定的水溶液，其中含有人類生長激素、緩沖液、非離子性表面活性劑，和任選含有中性鹽、甘露醇、或防腐劑。
發(fā)明簡述現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽作為添加劑的人類生長激素制劑對脫酰胺作用和氧化作用顯示出很高的穩(wěn)定性。該產(chǎn)品的穩(wěn)定性允許以凍干狀態(tài)或以溶解或重新溶解制劑的形式對其貯存和運輸。
根據(jù)本發(fā)明待用的包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽可以是包括10到20個氨基酸殘基的肽，優(yōu)選包括3到10個氨基酸殘基，更優(yōu)選包括3到6個氨基酸殘基如3或4個氨基酸殘基。根據(jù)本發(fā)明的一種方面，較短肽的堿性和酸性氨基酸殘基由1個或2個氨基酸殘基所分離。
本發(fā)明的藥物制劑可配制用于任何合適方式的施用，如通過腸道外或口腔施用或施用于粘膜，如鼻腔施用。藥物制劑可以包括在小瓶(vial)或小室(cartridge)或任何其它合適的容器如預先填滿的注射器或筆式裝置(pen device)中的劑量形式存在。
因此，本發(fā)明的制劑可以是凍干粉的形式，該凍干粉后來用常規(guī)的賦形劑如蒸餾水或注射用水重新調(diào)配，或者是包括生長激素的溶液形式。這種賦形劑可包括常規(guī)的防腐劑如苯甲醇和酚類(phenoles)，如苯酚或間-甲酚或其混合物。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是人類生長激素的藥物制劑形式，其中包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽并進一步包括以生長激素緩沖水溶液形式的載體。這種制劑是現(xiàn)成的(ready-to-use)形式并且可作為水溶液貯存和運輸而無任何重要的降解。
待用于生長激素溶液的緩沖液可以是，如，組氨酸、檸檬酸鹽、酒石酸鹽或磷酸鹽緩沖液。
為了穩(wěn)定性的原因，溶液pH優(yōu)選調(diào)至約2到8之間，優(yōu)選從約5到7，更優(yōu)選從約6.0到7.0，甚至更為優(yōu)選從約6.0到6.8。
為了獲得穩(wěn)定作用優(yōu)選加入包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽，其量達100mM，更為優(yōu)選其量約1-10mM，優(yōu)選約2-6mM，最優(yōu)選約3-5mM。
此外，為了便于使用前重新調(diào)配制劑時對其處理，如，凍干和凍干制劑快速而完全的溶解，本發(fā)明的藥物制劑可包括用于調(diào)整增強性(tonicity)的鹽和任選地包括賦形劑。
賦形劑可選自二糖如乳糖繭密糖二霉菌酸酯(trehalose)和蔗糖，糖醇如山梨醇或甘露醇，多糖如作為葡聚糖產(chǎn)品的商品化聚合物如葡聚糖40，葡聚糖70或葡聚糖75以及Ficoll和多價醇如聚乙二醇或聚乙烯醇或這些物質(zhì)中2種或更多種的組合。
本發(fā)明的進一步方面涉及制備包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的藥物制劑的方法，其中的生長激素通過以下方法溶于包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的溶液中，包括溶解包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽于任選含有苯甲醇的去離子水中，加入生長激素并且任選調(diào)節(jié)pH至約2到約8。
pH可通過加入酸而調(diào)節(jié)，該酸對生長激素無副作用，優(yōu)選為生理上可接受的酸如無機酸，如鹽酸、硫酸或硝酸或有機酸如醋酸。
在本發(fā)明方法的實施方案中，任選加入鹽和賦形劑，之后將溶液裝入容器并凍干。
本發(fā)明的另一方面涉及包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽用于生長激素穩(wěn)定制劑配制的用途。
本發(fā)明的另一方面涉及用于治療易受生長激素影響的疾病的方法，包括施用包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的制劑。
在本文中“生長激素”可以是任何來源的生長激素，如鳥、牛、馬、人類、羊、豬、鮭魚、真鱒(trout)或金槍魚的生長激素，優(yōu)選為牛、人類或豬的生長激素，人類生長激素最為優(yōu)選。用于本發(fā)明的生長激素可以是分離自自然來源的，如通過以常規(guī)方式提取垂體腺的天然生長激素，或者是通過重組技術，如E.B.Jensen和S.Carlsen在生物技術和生物工程。36，1-11(1990)中所描述而制備的生長激素?！吧L激素”也可是截短形式的生長激素，其中的一種或更多個氨基酸殘基被刪除；其類似物，只要替代不具有任何副作用如抗原性或降低的功能，天然分子中的一種或更多個氨基酸殘基被別的氨基酸殘基，優(yōu)選天然氨基酸殘基所替代；或者其衍生物，如具有N-或者C-末端延伸如Met-hGH。優(yōu)選的生長激素為hGH。
術語生長激素“劑量”指在施用方案(regimen)中產(chǎn)生治療效應的量。制備其制劑，根據(jù)現(xiàn)成的制劑計算，其中含有至少約0.1mg/ml的hGH量，優(yōu)選向上約10mg/ml的hGH量，優(yōu)選從約1mg/ml到約40mg/ml，更優(yōu)選從約1mg/ml至約40mg/ml，更優(yōu)選從約1mg/ml到約25mg/ml，如從1mg/ml到約5mg/ml的hGH量。例如，對于使用這些施用組合物至患垂體機能不良侏儒癥的人類，這些制劑含有從約0.1mg/ml到約10mg/ml，相應于用于試圖治療(intended treatment)的當前期望的劑量方案(dosage regimen)。濃度范圍對本發(fā)明并不至關重要且可通過監(jiān)督施用的內(nèi)科醫(yī)生加以改變。
包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的待用于本發(fā)明的肽優(yōu)選包括自然產(chǎn)生的α氨基酸殘基。氨基酸可以為1個或d個氨基酸或其混合物。
“酸性氨基酸殘基”為如谷氨酸或天冬氨酸，且“堿性氨基酸殘基”為如賴氨酸或精氨酸。
在本文中當制劑較包括磷酸緩沖液的常規(guī)制劑更為穩(wěn)定并優(yōu)選與包括組氨酸作為穩(wěn)定劑的相應配方一樣穩(wěn)定，且其中的hGH脫酰胺作用與WO93/12812中公開的磷酸緩沖液相比減少約20％時，“高度穩(wěn)定性”便獲得。
用于本發(fā)明方法的溶劑可以是水，醇如乙醇，n-丙醇或異丙醇、丁醇或其混合物。溶劑可以包括防腐劑如苯甲醇和酚類，如苯酚或m-甲酚或其混合物。
發(fā)明詳述本發(fā)明在下面的說明本發(fā)明的實施例中更為詳細地加以解釋。它們沒有被認為是限制了附屬權(quán)利要求所定義的本發(fā)明范圍。實驗部分實施例脫酰胺作用的減少在5mM包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽(Lys-Gly-Asp-Ser)的存在時于37℃測定pH6.8的包括4mg/ml hGH的hGH制劑的脫酰胺作用速度。
通過溶解8mg hGH于2ml 10mM的Lys-Gly-Asp-Ser或組氨酸溶液中而制備hGH制劑。因此，加入2ml 3.0％的苯甲醇以得到4mg/mlhGH、5mM Lys-Gly-Asp-Ser或組氨酸、1.5％苯甲醇、pH6-8(加入HCl或NaOH調(diào)節(jié))的最終制劑。
下表中所述的hGH制劑于37℃貯存7天，并通過IE-HPLC分析脫酰胺的hGH含量。結(jié)果顯示于下表。
表
*偏離6.8每0.1個pH單位校正1％的脫酰胺(desamido)在起始物質(zhì)中脫酰胺hGH的含量為2.0％從上表，似乎通過加入Lys-Gly-Asp-Ser，hGH的脫酰胺作用降低到至少與通過加入組氨酸而獲得的相同水平(與磷酸緩沖液相比25-30％，參考上面的WO93/12812)。
上面的結(jié)果表明通過加入達100mM，優(yōu)選1-10mM，更優(yōu)選2-6mM且最優(yōu)選約3-5mM低濃度的Lys-Gly-Asp-Ser，脫酰胺作用的速度降低至很大的程度。因此，通過以Lys-Gly-Asp-Ser替代磷酸緩沖液，脫酰胺作用的速度可降低超過30％。
作為防腐劑的苯甲醇的使用似乎對脫酰胺速度沒有影響。
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權(quán)利要求
1.包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的藥物制劑。
2.權(quán)利要求1的藥物制劑，進一步包括以生長激素緩沖水溶液形式的載體，生長激素中含有包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽。
3.權(quán)利要求1或2的藥物制劑，其中的pH調(diào)至從約2到約8之間的值。
4.以前權(quán)利要求中任一權(quán)利要求的藥物制劑，其中包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽的濃度達到約100mM。
5.以前權(quán)利要求中任一權(quán)利要求的藥物制劑，進一步包括鹽和/或糖類。
6.權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求的藥物制劑，其中的生長激素為hGH。
7.制備包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的藥物制劑的方法，該方法包括(a)將肽溶解于任選含有防腐劑的去離子水中以形成溶液，和(b)向該溶液中加入生長激素，和(c)任選調(diào)節(jié)pH至pH2到約pH8。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，任選向其中加入鹽和/或賦形劑，之后將溶液裝入容器中并凍干。
9.包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽用于制備穩(wěn)定的生長激素制劑的用途。
10.治療易受生長激素影響的疾病的方法，包括施用權(quán)利要求1-6中任何一個權(quán)利要求的制劑。
全文摘要
包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽作為添加劑或緩沖物質(zhì)的藥物制劑對脫酰胺作用,氧化作用和肽鍵的斷裂顯示出很高的穩(wěn)定性。該產(chǎn)品的穩(wěn)定性允許以凍干的狀態(tài)或在周圍溫度中以溶解或重新溶解制劑的形式貯存及其運輸。
文檔編號A61P1/16GK1190896SQ9619546
公開日1998年8月19日 申請日期1996年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月12日
發(fā)明者T·克里斯坦森, P·巴爾史密特, H·H·索里恩森, O·H·奧爾森, L·希姆 申請人:諾沃挪第克公司