專(zhuān)利名稱(chēng)：組合物,其提取物及它們的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括羌活，獨(dú)活，黃芩，黃連和葛根的組合物，其提取物，其制備方法及上述組合物或其提取物的藥物用途，尤其是在鎮(zhèn)痛解熱，由病毒尤其是流感病毒引起的感冒，抗炎及增強(qiáng)免疫功能方面的用途。
背景技術(shù)：
目前用于預(yù)防或治療發(fā)燒，炎癥，由病毒引起的感冒或增強(qiáng)免疫功能的藥物大多數(shù)為化學(xué)合成藥，這些藥物在治療中或多或少都會(huì)帶來(lái)一些藥物不良反應(yīng)。因此，尋找并開(kāi)發(fā)療效明確且藥物不良反應(yīng)小的來(lái)自植物或動(dòng)物的產(chǎn)品仍是十分需要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)研究現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)包括來(lái)自植物的羌活、獨(dú)活、葛根、黃芩和黃連的組合物或其提取物具有優(yōu)良的解熱鎮(zhèn)痛、緩解或減輕或治療由病毒尤其是流感病毒引起的感冒癥狀、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用且基本無(wú)藥物不良反應(yīng)。
因此，本發(fā)明涉及組合物，其包括來(lái)自植物的羌活、獨(dú)活、葛根、黃芩和黃連。
本發(fā)明還涉及提取物，其特征在于該提取物是來(lái)自植物的羌活、獨(dú)活、葛根、黃芩和黃連混合物的C1-4烷基醇提取物。
本發(fā)明還涉及提取物的制備方法，其包括a.用含水C1-4烷基醇提取羌活、獨(dú)活、葛根、黃芩和黃連的混合物；b.過(guò)濾a)中提取液，減壓濃縮濾液至浸膏，其相對(duì)密度為1.15-1.20；
c.將b)中浸膏與水?dāng)嚢?，室溫靜置，抽濾；d.干躁c)中抽濾后的沉淀物。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包括來(lái)自植物羌活、獨(dú)活、葛根、黃芩和黃連的提取物和/或藥用載體。
本發(fā)明還涉及來(lái)自植物的羌活、獨(dú)活、葛根、黃芩和黃連的組合物或其提取物在制備用于預(yù)防或治療發(fā)燒、由病毒引起的感冒，炎癥或與免疫功能有關(guān)癥狀或疾病的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所用的羌活優(yōu)選為傘形科植物羌活(Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang)的干躁根莖，其通常應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2000年版(一部)第144頁(yè)羌活項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定。進(jìn)一步講，所述羌活優(yōu)選含異歐胡前素(C16H14O4)不少于0.3％。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所用的獨(dú)活優(yōu)選為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸(Angelica pubescens Maxin.F.biserrata Shan et Yuan)的干躁根，其通常應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2000年版(一部)第215頁(yè)獨(dú)活項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定。進(jìn)一步講，所述獨(dú)活優(yōu)選含蛇床子素(C15H16O3)不少于0.3％。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所用黃芩優(yōu)選為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干躁根，其應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2000年版(一部)第248頁(yè)黃芩項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所用的黃連優(yōu)選毛茛科植物黃連(Coptischipensis Franch)的干躁根莖，其應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2000年版(一部)第250頁(yè)黃連項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所用葛根優(yōu)選為蘭科植物苷葛藤(Puerariathomsonii Benth)的干燥根，其應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2000年版(一部)第273頁(yè)葛根項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的組合物可以經(jīng)煎煮后使用。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的提取物可以單獨(dú)或與藥物載體混合通過(guò)口服或非腸道途徑給藥。適于口服給藥的劑型舉例講有片劑，膠囊，口服液或懸浮液等。適于非腸道給藥的劑型舉例講有注射液。進(jìn)一步講，本發(fā)明提取物也可為單位劑型，如0.1-0.8g本發(fā)明提取物/粒膠囊。
根據(jù)本發(fā)明講，本發(fā)明中所述含水C1-4烷基醇優(yōu)選為80％乙醇水溶液。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所述藥用載體為制藥領(lǐng)域中已知的藥用載體，舉例講，如國(guó)家藥品注冊(cè)中允許使用的藥用載體或賦形劑或輔料。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所述提取物的制備可以如下進(jìn)行將羌活，獨(dú)活，葛根，黃芩和黃連的混合物用80％乙醇回流提取兩次，每次1小時(shí)。第1次提取所加80％乙醇量為羌活，獨(dú)活，葛根，黃芩和黃連量的8倍，然后濾過(guò)；第二次提取所加80％乙醇量為所述混合物的6倍量，濾過(guò)。合并第一次和第二次的乙醇提取液，減壓濃縮至浸膏，加6倍量水到浸膏中，充分?jǐn)嚢瑁o置6小時(shí)，抽濾。所得沉淀于60-100℃下干燥，然后粉碎，過(guò)60目篩，得粉末狀物。提取率6-48％。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明提取物(下面簡(jiǎn)稱(chēng)本品)具有下面性質(zhì)(1)取本品0.3g，加無(wú)水乙醚20ml，室溫放置2小時(shí)，濾過(guò)，濾液低溫?fù)]去乙醚，殘?jiān)右宜嵋阴?ml使溶解，作為供試品溶液。取異歐前胡素對(duì)照品，加甲醇制成每ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取羌活對(duì)照藥材0.2g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液4μl、對(duì)照品溶液2μl、對(duì)照藥材溶液4μl，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-苯-乙酸乙酯(3∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，105℃加熱約5小時(shí)至斑點(diǎn)清晰，冷卻，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；(2)取本品0.3g，加無(wú)水乙醚20ml，室溫放置2小時(shí)，濾過(guò)，濾液低溫?fù)]去乙醚，殘?jiān)右宜嵋阴?ml使溶解，作為供試品溶液。取蛇床子素對(duì)照品，加甲醇制成每ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取獨(dú)活對(duì)照藥材0.2g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液4μl、對(duì)照品溶液2μl、對(duì)照藥材溶液4μl，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙醚-冰醋酸(10∶10∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同藍(lán)紫色的熒光斑點(diǎn)；
(3)取本品0.2g，加甲醇10ml，室溫放置1小時(shí)，濾過(guò)，濾液即作為供試品溶液。取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取黃連對(duì)照藥材0.1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液2μl、對(duì)照品溶液1μl、對(duì)照藥材溶液2μl，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同亮黃色的熒光斑點(diǎn)；水分不得超過(guò)5.0％(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄IX H水分測(cè)定法項(xiàng)下烘干法)。
總香豆素含量對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取蛇床子素對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇制成每ml含0.087mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取對(duì)照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，置于25ml量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻。以無(wú)水乙醇為空白。照分光光度法(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄V)，在322nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測(cè)定法取本品約50mg，精密稱(chēng)定，置50ml三角瓶中，加無(wú)水乙醚30ml，超聲提取30分鐘，濾過(guò)，用無(wú)水乙醚分次洗滌濾紙和漏斗，洗滌液與濾液合并，回收乙醚，殘?jiān)詿o(wú)水乙醇溶解，置于25ml量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，靜置。精密量取上述溶液1ml置25ml量瓶中，以無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻。照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，測(cè)定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中總香豆素的含量，計(jì)算，即得。
本品含總香豆素以蛇床子素(C15H16O3)計(jì)，不得低于6.5％。
總黃酮對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品適量，以80％乙醇溶解，制成濃度為0.088mg/ml的對(duì)照品溶液。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取對(duì)照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，置于25ml量瓶中，以80％乙醇稀釋至刻度，搖勻。以80％乙醇為空白。照分光光度法(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄V)，在276nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測(cè)定法取本品約30mg，精密稱(chēng)定，置50ml量瓶中，加80％乙醇30ml，超聲提取10分鐘，以80％乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1ml拌入0.5g聚酰胺粉(80-120目)，水浴加熱揮干溶劑后，加到已裝有0.5g聚酰胺粉的層析柱中，用水洗脫40ml，棄去，改用80％乙醇洗脫，收集洗脫液約100ml，減壓濃縮至小體積，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加80％乙醇稀釋至刻度，搖勻。照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，測(cè)定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中總黃酮的含量，計(jì)算，即得。
本品含總黃酮以黃芩苷(C12H18O11)計(jì)，不得低于24.3％。
總生物堿對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，以水溶解，制成濃度為0.022mg/ml的對(duì)照品溶液。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取對(duì)照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，置于50ml分液漏斗中，加水補(bǔ)充至同一體積，依次精密加入pH5.20的鄰苯二甲酸氫鉀溶液5ml、0.1％溴麝香草酚藍(lán)溶液1ml、氯仿10ml，用力振搖2分鐘，靜置40分鐘，分取下層氯仿液，以相應(yīng)的試劑為空白。照分光光度法(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄V)，在416nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測(cè)定法取本品約30mg，精密稱(chēng)定，置50ml量瓶中，加80％乙醇30ml，超聲提取10分鐘，以80％乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液0.5ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加水補(bǔ)充至同一體積”起，依法測(cè)定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中總生物堿的含量，計(jì)算，即得。
本品含總生物堿以鹽酸小檗堿(C20H17NO4·HCl)計(jì)，不得低于19.2％。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例及試驗(yàn)例用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但其并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例1本發(fā)明組合物的組成成份 量(克)羌活(干燥根莖) 700獨(dú)活(干燥根) 525黃芩(干燥根) 525黃連(干燥根莖) 525葛根(干燥根) 525實(shí)施例2本發(fā)明提取物的制備將羌活700g，獨(dú)活525g，葛根525g，黃芩525g和黃連525g混合，往其中加入80％乙醇回流提取2次，每次1小時(shí)。其中第一次提取加入的80％乙醇量為所述混合物的8倍量，提取后濾過(guò)；第二次提取加入的80％乙醇量為所述混合物的6倍量，提取后過(guò)濾。合并第1次提取和第二次提取的80％乙醇提取液，減壓濃縮(65℃，0.095MPa)至浸膏(50℃，相對(duì)密度1.15-1.20)，加水至浸膏總重的6倍，充分?jǐn)嚢?，室溫清?小時(shí)，抽濾，沉淀物80℃下真空干躁，粉碎，過(guò)60目篩，得到提取率為6.48％的本發(fā)明提取物。
實(shí)施例3實(shí)施例2提取物對(duì)正常和發(fā)熱大鼠體溫的作用材料與方法受試藥物實(shí)施例2。清華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系藥物藥理室提供。批號(hào)010318。用時(shí)以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
雄性Wistar大鼠，非近交系封閉群。體重195.58±10.56g(正常體溫)。178.73±11.13g(發(fā)熱大鼠治療給藥)，185.42±13.55g(發(fā)熱大鼠預(yù)防給藥)。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng)提供。合格證號(hào)SCXK11-00-0006。每組12只。
干酵母粉。100g/袋。批號(hào)990608。丹麥合資丹保利酵母廠生產(chǎn)。用時(shí)以生理鹽水調(diào)至所需濃度。
HP-200液晶溫度計(jì)。測(cè)溫探頭Φ2mm。北京師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)。
對(duì)正常大鼠體溫的影響取大鼠隨機(jī)分組，測(cè)量體溫兩次，間隔30分鐘，取兩次體溫差值在0.4℃以內(nèi)者作為試驗(yàn)對(duì)象。灌胃不同劑量的藥物，給藥后分別于1，2，3，4，5，6小時(shí)測(cè)量體溫，并記錄之。計(jì)算體溫波動(dòng)值和曲線下面積。做組間比較。
對(duì)發(fā)熱大鼠的治療作用取大鼠隨機(jī)分組，測(cè)量體溫兩次，間隔30分鐘，取兩次體溫差值在0.4℃以內(nèi)者，作為試驗(yàn)對(duì)象。背部皮下注射15％干酵母生理鹽水液，1mL/100g體重。注射后放入籠中，禁食不禁水，于注射后3-5小時(shí)測(cè)體溫，取體溫升高0.8以上者納入試驗(yàn)組，灌胃不同劑量的藥物。分別于藥后1，2，3，4，5，6小時(shí)測(cè)量體溫并記錄之，計(jì)算體溫升高值和曲線下面積。
對(duì)大鼠體溫升高的預(yù)防作用取大鼠隨機(jī)分組，測(cè)量體溫兩次，間隔30分鐘，取兩次體溫差值在0.4以內(nèi)者，作為試驗(yàn)對(duì)象?？诜煌瑒┝康乃幬?，于給藥后即刻背部皮下注射酵母液，劑量同上。于注射后1，2，3，4，5，6小時(shí)測(cè)量體溫，計(jì)算體溫升高值和曲線下面積(AUC)，以此來(lái)反應(yīng)體溫抑制指數(shù)。
大鼠測(cè)深部直腸溫度(探頭6cm)來(lái)反應(yīng)體溫。
體溫升高值＝藥后體溫-正常平均體溫。
體溫抑制指數(shù)(TRI)＝∑[(Ci+Ci-1)/2*Δt](C體溫變化值，i采樣點(diǎn)。t測(cè)試時(shí)間。
劑量設(shè)置

給藥途徑與體積灌胃，1mL/100g體重。
1.空白對(duì)照蒸餾水。
2.陽(yáng)性藥對(duì)照感冒軟膠囊。北京同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風(fēng)解熱的作用，用于外感風(fēng)寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無(wú)汗、骨節(jié)酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒。zz-3242-京衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1993)第004008號(hào)。
阿斯匹林。0.3g/片。具有解熱鎮(zhèn)痛的作用。批號(hào)001208。北京市曙光制藥廠生產(chǎn)。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)以EXCEL軟件處理。組間t檢驗(yàn)。以P＜0.05，P＜0.01為顯著性檢驗(yàn)水平。
結(jié)果見(jiàn)表1-1至1-5。
表1-1對(duì)正常大鼠體溫的影響(x±s)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05。n＝10
表1-2不同藥物對(duì)發(fā)熱大鼠的預(yù)防作用(x±s)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝10
表1-3不同藥物對(duì)發(fā)熱大鼠體溫的抑制作用(x±s)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝10
表1-4不同藥物大鼠體溫指數(shù)比較(x±s)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝10
表1-5不同藥物對(duì)發(fā)熱大鼠體溫的升高百分率(x±s)

*體溫升高百分率＝[(給藥后體溫升高均值-給藥前體溫升高均值)/給藥前體溫升高均值*100％]**“-”體溫降低?！?”體溫升高。
討論與結(jié)論1對(duì)正常大鼠體溫的影響。給藥后不同時(shí)間內(nèi)對(duì)照組體溫略有下降。阿斯匹林體溫下降較明顯，但由于標(biāo)準(zhǔn)差過(guò)大，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例2提取物三劑量組體溫變化無(wú)明顯差異。感冒軟膠囊在藥后2，3小時(shí)體溫?zé)o明顯下降，略有升高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但由于體溫升高在0.2℃之內(nèi)，無(wú)實(shí)際意義。
2對(duì)酵母液給大鼠背部皮下注射導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)生致熱原，從而引起發(fā)熱。這種發(fā)熱需要3-5小時(shí)。在體溫升高之前有一個(gè)明顯體溫下降的過(guò)程，在這一時(shí)期大鼠明顯地表現(xiàn)為倦縮、寒顫等。此與體內(nèi)產(chǎn)熱過(guò)程有關(guān)。而且這種體溫下降越明顯，之后的發(fā)熱越高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例2提取物能夠明顯減輕造模后大鼠體溫下降，并能在一定程度上抑制其后的發(fā)熱。大中劑量在注射酵母后3，5，6小時(shí)與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。陽(yáng)性藥阿斯匹林在注射酵母后2小時(shí)體溫明顯降低，并與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在5，6小時(shí)能夠明顯抑制體溫的升高。感冒軟膠囊與阿斯匹林有相同的效應(yīng)。只是作用輕于阿斯匹林。對(duì)注射酵母后的體溫下降無(wú)明顯抑制作用。
3在注射酵母后待大鼠體溫升高至0.8℃以上者作為發(fā)熱模型，然后口服不同劑量的藥物，以觀察其解熱作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥后實(shí)施例2提取物對(duì)發(fā)熱大鼠的體溫有明顯的抑制作用，大劑量組藥后1小時(shí)體溫下降16.9％，2，3小時(shí)體溫分別下降33.8％和50.7％。相同時(shí)間對(duì)照組體溫則分別上升7.07％，7.07％和11.11％。陽(yáng)性藥阿斯匹林表現(xiàn)出作用快但持續(xù)時(shí)間短特點(diǎn)，藥后1-3小時(shí)體溫分別下降35.3％，63.3％和52.1％。以后體溫回升。感冒軟膠囊解熱作用弱于實(shí)施例2提取物，藥后1-3小時(shí)，體溫分別下降9.95％，25.3％和22.6％。具體結(jié)果參表5.4 TRI(temperature resistant index)為不同時(shí)間點(diǎn)體溫變化值所描繪曲線下面積(AUC)之和。它不但反應(yīng)某一時(shí)間點(diǎn)體溫的高低，而且全面反應(yīng)在實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間內(nèi)整個(gè)體溫變化的情況。是一個(gè)綜合評(píng)價(jià)藥物解熱作用的指標(biāo)。結(jié)果表明，實(shí)施例2提取物對(duì)發(fā)熱大鼠體溫整體有明顯的抑制作用，大中小三劑量TRI6小時(shí)分別為3.060±1.152，3.690±1.617和4.040±1.515，與對(duì)照組相比(5.230±0.947)，差異有顯著性(P＜0.05)。阿斯匹林有明顯的作用，TRI6小時(shí)為3.060±0.909。感冒軟膠囊也有明顯的抑制作用，其TRI6小時(shí)為3.990±1.051，但不及實(shí)施例2提取物大劑量組，僅相當(dāng)于中劑量組效應(yīng)。
對(duì)正常大鼠及發(fā)熱預(yù)防作用的TRI6小時(shí)，由于個(gè)體差異較大，標(biāo)準(zhǔn)差過(guò)大，雖有一定的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
但總地來(lái)說(shuō)，實(shí)施例2提取物對(duì)正常大鼠體溫?zé)o明顯影響，對(duì)發(fā)熱大鼠的體溫有明顯的抑制作用。
二對(duì)發(fā)熱家兔體溫的作用實(shí)施例2提取物能夠明顯的抑制發(fā)熱家兔的體溫升高.
觀察實(shí)施例2提取物對(duì)發(fā)熱家兔的體溫影響。
材料與方法受試藥物實(shí)施例2提取物。批號(hào)及來(lái)源同前。用時(shí)以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
動(dòng)物為雄性日本大耳白家兔，非近交系封閉群。體重1.78±0.14kg。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng)提供。合格證號(hào)SCXK11-00-0002。每組6只。
大腸桿菌內(nèi)毒素。購(gòu)自上海第二醫(yī)科大學(xué)微生物教研室。批號(hào)001116。肝素為Sigma產(chǎn)品。
HP-200液晶溫度計(jì)。測(cè)溫探頭Φ2mm。北京師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)。AS-2100恒溫水浴振蕩儀。上海醫(yī)用儀器廠生產(chǎn)。LD5-2A型離心機(jī)。北京醫(yī)用離心機(jī)廠。
試驗(yàn)主要步驟內(nèi)生致熱原制備參文獻(xiàn)[7-9]進(jìn)行。
將正常雄性大鼠肝素化(1200ug/kg，iv)，然后頸總動(dòng)脈取血，在全血中加入大腸桿菌內(nèi)毒素(5ug/100mL全血)，38℃水浴振蕩溫育1小時(shí)，2000轉(zhuǎn)離心15分鐘，用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀，再離心15分鐘，去上清。在沉淀中加入與原上清等體積的無(wú)菌生理鹽水，38℃水浴培養(yǎng)18小時(shí)，2000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清液，用Φ0.22um的微孔濾膜超濾。取濾液(EP液)分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 發(fā)熱家兔模型的制備及給藥取正常家兔隨機(jī)分為6組，測(cè)兩次體溫，取均值作為正常體溫。每只家兔耳緣靜脈注射EP液，3mL/kg體重。注射完即刻灌胃不同劑量的藥物。分別于給藥后0.5，1，2，3，4，5，6小時(shí)測(cè)1次體溫。計(jì)算體溫變化值和曲線下面積。做組間比較。
3兔測(cè)深部直腸溫度(探頭6cm)來(lái)反應(yīng)體溫.
5體溫升高值＝藥后體溫-正常平均體溫。
體溫抑制指數(shù)(TRI)＝∑[(Ci+Ci-1)/2*Δt](C體溫變化值，i采樣點(diǎn)。t測(cè)試時(shí)間。
劑量設(shè)置
灌胃，2mL/kg體重。
1.空白對(duì)照蒸餾水。
2.陽(yáng)性藥對(duì)照感冒軟膠囊。北京同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風(fēng)解熱的作用，用于外感風(fēng)寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無(wú)汗、骨節(jié)酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒。zz-3242-京衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1993)第004008號(hào)。
阿斯匹林。0.3g/片。具有解熱鎮(zhèn)痛的作用。批號(hào)001208。北京市曙光制藥廠生產(chǎn)。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)以EXCEL軟件處理。組間t檢驗(yàn)。以P＜0.05，P＜0.01為顯著性檢驗(yàn)水平。
結(jié)果表2-1不同藥物對(duì)發(fā)熱家兔體溫的抑制作用(x±s)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝6表2-2不同藥物家兔體溫指數(shù)比較(x±s)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01。n＝6
表2-3不同藥物對(duì)發(fā)熱家兔體溫的升高百分率的影響

*體溫升高百分率＝[(給藥后體溫升高均值-0.5小時(shí)體溫升高均值)/0.5小時(shí)體溫升高均值*100％]**“-”體溫降低。“+”體溫升高。
討論與結(jié)論1在注射EP后各組家兔體溫均明顯升高，唯小劑量組升高幅度較小。對(duì)照組體溫升高持續(xù)5小時(shí)，待6小時(shí)時(shí)體溫下降。
2實(shí)施例2提取物三劑量組對(duì)發(fā)熱家兔體溫有明顯的抑制作用。以大劑量明顯，并呈一定的量效關(guān)系。一般在藥后2小時(shí)體溫明顯下降，并能持續(xù)至5-6小時(shí)。陽(yáng)性藥阿斯匹林作用較快，在藥后1小時(shí)即使體溫明顯下降，下降率為38.3％。感冒軟膠囊解熱特點(diǎn)基本同實(shí)施例2提取物。
3結(jié)果表明，實(shí)施例2提取物對(duì)發(fā)熱大鼠體溫整體有明顯的抑制作用，大中小三劑量TRI6小時(shí)分別為3.358±1.066，4.019±1.067和2.854±0.978，與對(duì)照組相比(5.325±1.03)，差異有顯著性(P＜0.05)。以大、小劑量組明顯。阿斯匹林有明顯的作用，TRI6小時(shí)為2.850±0.788。感冒軟膠囊也有明顯的抑制作用，其TRI6小時(shí)為3.708±1.175，但不及實(shí)施例2提取物大、小劑量組，僅相當(dāng)于中劑量組效應(yīng)。
實(shí)施例2提取物對(duì)對(duì)發(fā)熱家兔的體溫有明顯的抑制作用。
實(shí)施例4實(shí)施例2提取物的抗病毒作用在MDCK細(xì)胞中研究實(shí)施例2提取物對(duì)細(xì)胞的毒性，及對(duì)流感病毒甲型，流感病毒乙型的抑制效果。實(shí)驗(yàn)表明對(duì)流感病毒甲型，實(shí)施例2提取物兩批實(shí)驗(yàn)的半數(shù)有效濃度(IC50)平均為0.055±0.011mg/mL，對(duì)流感病毒乙型，兩批實(shí)驗(yàn)的半數(shù)有效濃度平均為0.048±0.0014mg/mL，對(duì)細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TD50)平均為0.188±0mg/mL。實(shí)施例2提取物0.078mg/mL在VERO細(xì)胞內(nèi)對(duì)COXB3感染的CPE無(wú)抑制作用。
觀察觀察實(shí)施例2提取物對(duì)感染小鼠的抗病毒作用，以及在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)流感病毒甲、乙型，COXB3的抑制作用。具體如下所示。
對(duì)小鼠感染病毒的保護(hù)作用材料與方法[受試藥物]實(shí)施例2提取物。批號(hào)及來(lái)源同前。用時(shí)以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
KM小鼠，非近交系封閉群，雄性。體重15.24±0.81g。由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。合格證號(hào)96-36號(hào)。每組15只。
購(gòu)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所。流感病毒(A31.四川97-315)。牛肉湯粉。購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)001224。試驗(yàn)步驟稀釋病毒用肉湯將流感病毒稀釋成2個(gè)LD50/0.05ml，置冰水浴中備用。感染小鼠選健康小鼠，隨機(jī)分為7組，每組15只，于乙醚輕度麻醉下滴鼻感染(小鼠用乙醚麻醉，使其頭部仰起，用注射針頭插入鼻腔，緩慢滴入流感病毒接種物)，用0.25ml注射器每只小鼠接種50ul。
藥物防治于病毒感染前一天開(kāi)始灌胃給藥，每天兩次，共給藥3天。連續(xù)觀察14天。逐日記錄動(dòng)物發(fā)病癥狀和死亡數(shù)。設(shè)病毒、藥物、陽(yáng)性藥和正常對(duì)照組等。
灌胃，0.2ml/10g體重。
1.空白對(duì)照蒸餾水。
2.陽(yáng)性藥對(duì)照。感冒軟膠囊。北京同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風(fēng)解熱的作用，用于外感風(fēng)寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無(wú)汗、骨節(jié)酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒。zz-3242-京衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1993)第004008號(hào)。
病毒唑。50mg/片。批號(hào)010414。蘇中制藥廠生產(chǎn)?？共《舅帯＝Y(jié)果表3-1實(shí)施例2提取物對(duì)流感病毒感染小鼠存活率的影響(x±s)

x2檢驗(yàn)，與病毒對(duì)照組相比，*P＜0.05。
對(duì)流感病毒的抑制試驗(yàn)每mL20-30萬(wàn)個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔0.1mL，37℃ 2.5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，棄培養(yǎng)液，加入適量病毒，37℃ 2.5％CO2吸附2.5-3小時(shí)，棄病毒液，加入列毒濃度的藥液，作2倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度分別為5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15625，0.079，0.039mg/mL.每濃度2個(gè)孔，37℃ 2.5％CO2培養(yǎng)48小時(shí)，觀察細(xì)胞病變，完全破壞為4；75％破壞為3；50％破壞為2，25％破壞為1；無(wú)病變?yōu)?。計(jì)算每濃度藥液平均細(xì)胞病變程度。共進(jìn)行兩批實(shí)驗(yàn)，設(shè)細(xì)胞對(duì)照，病毒對(duì)照，陽(yáng)性藥病毒唑?qū)φ?
藥物效果計(jì)算計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(IC50)及治療指數(shù)(TI).
IC50＝Antilog[(A+(50-A)/(B-A))×C]A＝Log＜50％藥物濃度。B＝Log＞50％藥物濃度。C＝Log稀釋倍數(shù)。
TI＝TD50/IC504VER細(xì)胞培養(yǎng)液及實(shí)驗(yàn)方法同MDCK細(xì)胞.
結(jié)果實(shí)施例2提取物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性二批實(shí)驗(yàn)濃度為2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125，0.015625mg/mL，顯微鏡觀察細(xì)胞病變，二批實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)施例2提取物對(duì)MDCK細(xì)胞半數(shù)有毒濃度TD50為0.188±0mg/mL。
表3-2實(shí)施例2提取物體外抗流感病毒甲型及乙型細(xì)胞的IC50(x±s)

注兩批實(shí)驗(yàn)用藥物為同一批號(hào)。
結(jié)論1小鼠抗病毒試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例2提取物具有一定抗病毒作用?？梢愿纳聘腥拘∈蟮纳|(zhì)量，延長(zhǎng)生存時(shí)間，降低死亡率。三劑量死亡抑制率分別為57.13％，42.87％和28.51％。大中劑量的差異與病毒對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。陽(yáng)性藥病毒唑表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其抑制率為64.31％。感冒軟膠囊為42.87％，效果同實(shí)施例2提取物中劑量組。
2實(shí)施例2提取物對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)有毒濃度為0.188±0mg/mL，對(duì)VERO細(xì)胞的TD50為0.156±0mg/mL.實(shí)施例2提取物抑制流感甲型病毒IC50為0.055±0.011mg/mL，治療指數(shù)為3.4，對(duì)流感病毒乙型IC50為0.048±0.0014mg/mL，治療指數(shù)為3.9.實(shí)施例2提取物最大無(wú)毒濃度0.078mg/mL對(duì)COXB3病毒無(wú)抑制作用.
實(shí)施例5
實(shí)施例2提取物的體內(nèi)外抗菌作用(一)對(duì)小鼠感染金葡菌的對(duì)抗作用材料與方法[受試藥物]實(shí)施例2提取物。批號(hào)及來(lái)源同前。用時(shí)以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
KM小鼠，非近交系封閉群，雌雄各半。體重18.77±0.67g。由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。合格證號(hào)96-36號(hào)。每組20只。
金黃色葡萄球菌ATCC25923。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)所藥理室提供。牛肉湯粉。購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)001224。
1.稀釋菌液。用金黃色葡萄球菌的肉湯過(guò)夜培養(yǎng)物作系列稀釋(10-1，10-2，10-3......)，取每稀釋液0.05ml腹腔注射于小鼠，引起小鼠全部死亡的最低細(xì)菌量(稀釋度)為最小致死量(MLD)，選取引起80-90％小鼠死亡的的細(xì)菌液備用。
2.感染小鼠。選健康小鼠，隨機(jī)分為6組，每組20只，腹腔注射經(jīng)預(yù)試實(shí)驗(yàn)測(cè)得LD80-90稀釋度的金黃色葡萄球菌液感染各組小鼠，每鼠注射0.5ml。
3.藥物防治于感染接種前1h，感染接種后6h，24h各給藥一次，每次0.5ml。設(shè)細(xì)菌、藥物、陽(yáng)性藥和正常對(duì)照組等，連續(xù)觀察10天，逐日記錄動(dòng)物發(fā)病癥狀和死亡數(shù)。
4.數(shù)據(jù)處理死亡率＝每組死亡數(shù)/每組數(shù)×100％死亡抑制率(％)＝(細(xì)菌對(duì)照組死亡率-實(shí)驗(yàn)組死亡率)/細(xì)菌對(duì)照組死亡率×100％[給藥途徑與體積]灌胃，0.5ml/只。

1.空白對(duì)照蒸餾水。
2.陽(yáng)性藥對(duì)照感冒軟膠囊，北京同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風(fēng)解熱的作用，用于外感風(fēng)寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無(wú)汗、骨節(jié)酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒.zz-3242-京衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1993)第004008號(hào)。
結(jié)果表4-1對(duì)小鼠抗菌作用的影響(x±s)

x2檢驗(yàn)，與細(xì)菌對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
二體外抗菌作用材料與方法[藥物]實(shí)施例2提取物和對(duì)照藥感冒軟膠囊，均同上。
MH瓊脂培養(yǎng)基由中國(guó)藥品生物制品檢定所購(gòu)進(jìn)。MH肉湯培養(yǎng)基和腦心浸液培養(yǎng)基為美國(guó)DIFCO公司產(chǎn)品。
試驗(yàn)菌株為25株實(shí)驗(yàn)室保存標(biāo)準(zhǔn)菌株和近兩年北京地區(qū)醫(yī)院臨床分離菌，質(zhì)控菌選用金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸桿菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。
最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定。采用平皿稀釋法和DENLAY多點(diǎn)接種進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯及腦心浸液增菌；藥物加少量乙醇助溶后用MH肉湯二倍稀釋成各種所需濃度，分別加適量到平皿中，MH瓊脂培養(yǎng)基溶化后定量注入含藥液平皿內(nèi)混勻，藥物的終濃度分別為0.1，0.2，0.4......50mg/mL。肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌和糞腸球菌的培養(yǎng)基內(nèi)含5％脫纖維的羊血，平皿中培養(yǎng)基凝固后用多點(diǎn)接種器接種試驗(yàn)菌(105cfu/點(diǎn))，置35℃恒溫培養(yǎng)18小時(shí)(肺炎球菌、化膿鏈球菌和糞腸球菌置5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí))后觀察結(jié)果，無(wú)菌生長(zhǎng)的平皿中所含藥物最小的濃度即為最低抑菌濃度(MIC)。
結(jié)果表4-2實(shí)施例2提取物的抗菌譜測(cè)定


結(jié)論1實(shí)施例2提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌中金葡菌、表葡菌、化膿鏈球菌和肺炎鏈球菌均有一定抗菌活性。其中對(duì)化膿性鏈球菌和肺炎鏈球菌的抗菌活性較強(qiáng)，MIC分別為0.8和1.56mg/mL，但對(duì)糞腸球菌的抗菌活性較弱，MIC≥50mg/mL；實(shí)施例2提取物對(duì)革蘭氏陰性菌中銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、摩根變形桿菌、雷極變形桿菌、陰溝腸桿菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、弗勞地枸櫞酸桿菌和流感嗜血桿菌均有一定抗菌活性，其中對(duì)摩根變形桿菌和流感嗜血桿菌的抗菌活性較強(qiáng)，MIC分別為3.125和6.25-12.5mg/mL對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌和肺炎克雷白桿菌的MIC均≥50mg/mL。
2以體外有明顯抑菌作用的菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923做小鼠體內(nèi)接種，結(jié)果表明，實(shí)施例2提取物具有明顯抑制感染小鼠死亡率的作用。三劑量由大到小死亡抑制率分別為76.47％，58.82％和41.18％。感冒軟膠囊在體外實(shí)驗(yàn)中效果不明顯，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出一定的活性，其對(duì)感染小鼠死亡抑制率為52.94％。
實(shí)施例6實(shí)施例2提取物對(duì)化學(xué)刺激所致疼痛及炎癥腫脹的抑制作用。
觀察實(shí)施例2提取物對(duì)醋酸所致小鼠疼痛的抑制作用。對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹的抑制作用。
材料與方法[受試藥物]實(shí)施例2提取物。批號(hào)及來(lái)源同前。用時(shí)以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
雄性KM小鼠，非近交系封閉群。體重19.68±1.27g(醋酸扭體)。19.23±0.78g(巴豆油致炎)。由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。合格證號(hào)96-036號(hào)。每組12只。
冰醋酸。分析純。北京化學(xué)試劑廠。批號(hào)001116。巴豆油。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所植化室提供。
AR1520/B電子天平(精密度0.0001g)。美國(guó)OHAUS有限公司。電子秒表，上海儀表廠生產(chǎn)。
1對(duì)醋酸所致小鼠扭體試驗(yàn)將小隨機(jī)分為6組，每組12只，連續(xù)給藥3天，于第3天給藥后1小時(shí)，每只鼠腹腔注射(IP)0.6％冰醋酸生理鹽水(0.1mL/10g體重)。計(jì)算注射后15分鐘內(nèi)小鼠扭體次數(shù)和扭體潛伏期。
2對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹的抑制作用將小隨機(jī)分為6組，每組12只，連續(xù)給藥3天，于第3天給藥后即時(shí)給小鼠左耳部涂以2％巴豆油(V/V)(20％無(wú)水乙醇和78％乙醚配制)。4小時(shí)后處死小鼠，取左右耳，并用Φ9mm打孔器分別取左右耳組強(qiáng)。測(cè)重量。計(jì)算耳腫脹率[＝(左耳重量-右耳重量)/右耳重量×100％]。腫脹抑制率[＝(對(duì)照組腫脹率-給藥組腫脹率)/對(duì)照組腫脹率×100％]。該試驗(yàn)為自身對(duì)照，右耳為空白對(duì)照，左耳涂巴豆油。
灌胃，0.2mL/10g體重。
1.空白對(duì)照蒸餾水。
2.陽(yáng)性藥對(duì)照感冒軟膠囊。北京同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風(fēng)解熱的作用，用于外感風(fēng)寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無(wú)汗、骨節(jié)酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒。zz-3242-京衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1993)第004008號(hào)。
阿斯匹林。0.3g/片。具有解熱鎮(zhèn)痛的作用。批號(hào)001208。北京市曙光制藥廠生產(chǎn)。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)以EXCEL軟件處理。組間t檢驗(yàn)。以P＜0.05，P＜0.01為顯著性檢驗(yàn)水平。
結(jié)果表5-1不同藥物對(duì)小鼠醋酸扭體的影響(x±s)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01。n＝12
表5-2不同藥物對(duì)小鼠耳腫脹的影響(x±s)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01。
討論與結(jié)論1實(shí)施例2提取物能夠明顯抑制醋酸引起的小鼠疼痛的扭體反應(yīng)，延長(zhǎng)反應(yīng)的潛伏期。大中小三劑量扭體抑制率分別為43.05％、46.67％和48.17％。無(wú)明顯量效關(guān)系。陽(yáng)性藥阿斯匹林和感冒軟膠囊具有同樣的效應(yīng)，其扭體抑制率分別為37.49％和36.04％。
2實(shí)施例2提取物三劑量對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用，大中小三劑量腫脹抑制率分別為41.99％34.46％和37.79％。陽(yáng)性藥阿斯匹林也有明顯的抑制作用，其腫脹抑制率為30.86％。感冒軟膠囊有抑制趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其腫脹抑制率為14.25％。
3結(jié)果表明，實(shí)施例2提取物對(duì)化學(xué)刺激所致疼痛及炎癥腫脹均具有明顯的抑制作用。
實(shí)施例7對(duì)小鼠對(duì)免疫功能的影響 觀察實(shí)施例2提取物對(duì)小鼠碳粒廓清功能的影響。對(duì)小鼠脾臟T細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響。
材料與方法[受試藥物]實(shí)施例2提取物。批號(hào)及來(lái)源同前。用時(shí)以蒸餾水溶解藥物至所需濃度。
雄性昆明種小鼠，非近交系封閉群。體重20.48±1.07g(碳粒廓清)，每組10只。。雌性昆明種小鼠19.66±0.78g(淋轉(zhuǎn))，每組3只。。由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。合格證號(hào)96-036號(hào)。[試劑]印度墨汁。北京化工廠生產(chǎn)。批號(hào)991008。用時(shí)以生理鹽水稀釋(1∶4，V/V)。人參皂苷，含量92％。由北京醫(yī)科大學(xué)天然與仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植化組提供。MTT(四氮唑蘭)，購(gòu)自Sigma公司。RPMI1640培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司，新生牛血清，購(gòu)自浙江省金華清湖牛利用研究所(批號(hào)001018)。巰基乙醇，分析純，北京化工廠生產(chǎn)。[實(shí)驗(yàn)儀器]BIO-RAD 550型酶標(biāo)儀。日本BIO-RAD公司。MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱。日本SANYO公司。150-C潔凈工作臺(tái)。北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠。CK-40倒置顯微鏡。日本OLMPUS公司。CK-30生物顯微鏡。日本OLMPUS公司。800型離心機(jī)，上海市手術(shù)器械廠生產(chǎn)。96孔培養(yǎng)板，美國(guó)CASTER公司產(chǎn)品。
1對(duì)小鼠碳粒廓能功能的影響[2]將小隨機(jī)分為6組，每組10只，連續(xù)給藥3天，于第3天給藥后1小時(shí)，每只鼠尾靜脈注射生理鹽水配制的印度墨汁。0.1mL/10g體重。分別于注射后0分和6分鐘眶上靜脈叢采血，每次采血25uL。采血后即刻加入2mL0.1％Na2CO3溶液中混勻。于675nm處測(cè)試吸光度(A675nm)。取小鼠肝、脾臟稱(chēng)重。計(jì)算k值[＝(logA1-logA2)/(t2-t1)]，碳粒廓清α值[＝(3√k×體重g)/(肝重g+脾重g)]。A10分鐘時(shí)吸光度。A26分鐘時(shí)吸光度。
2對(duì)小鼠脾臟T細(xì)胞增殖能力的影響將小隨機(jī)分為6組，每組3只，連續(xù)給藥7天，于第7天給藥后1小時(shí)，脫頸處死，即刻浸泡于75％乙醇中滅菌3分鐘。取出后無(wú)菌條件下取脾臟，依文獻(xiàn)[10-11]制備脾臟淋巴細(xì)胞，經(jīng)1640液洗2遍后，用含20％新生牛血清的RPMI1640液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL，分別加入96孔板中，每孔100uL。在加入細(xì)胞之前，須先加入20mg/mLConA，每孔20uL.對(duì)照孔加入等體積的1640液。將培養(yǎng)板放入5％CO2培養(yǎng)箱中37℃54小時(shí)。54小時(shí)后取出每孔加入10mg/mLMTT液20uL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，之后吸取上清，加入巰基乙醇，每孔200uL，在酶標(biāo)儀570nm處測(cè)吸光值。計(jì)算T細(xì)胞增殖百分率[＝(A加入ConA-A未加ConA)/A未加ConA×100％][劑量設(shè)置][給藥途徑與體積]灌胃，0.2mL/10g體重。
1.空白對(duì)照蒸餾水。
2.陽(yáng)性藥對(duì)照感冒軟膠囊。北京同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)8170098。本品由羌活、麻黃、荊芥穗、川芎、薄荷等藥物組成，具有散風(fēng)解熱的作用，用于外感風(fēng)寒引起的頭痛身熱、鼻塞流涕、惡寒無(wú)汗、骨節(jié)酸痛、咽喉腫痛等癥，450mg/粒。zz-3242-京衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1993)第004008號(hào)。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)以EXCEL軟件處理。組間t檢驗(yàn)。以P＜0.05，P＜0.01為顯著性檢驗(yàn)水平。
結(jié)果表6-1不同藥物對(duì)小鼠碳粒廓清能力的影響(x±s)

與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01。n＝10表6-2不同藥物對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響(x±s)

與對(duì)照組相比，#P＝0.0688，##P＝0.063。n＝3與對(duì)照組相比，*P＜0.05。
討論與結(jié)論1實(shí)施例2提取物能夠明顯增強(qiáng)小鼠外周淋巴細(xì)胞的吞噬能力，三劑量組均有明顯作用，與對(duì)照組相比差異有顯著性，但無(wú)明顯量效關(guān)系。感冒軟膠囊也具有明顯的作用。人參皂苷未表現(xiàn)出明顯的作用。其原因尚待進(jìn)一步研究。
2實(shí)施例2提取物三劑量對(duì)小鼠脾T細(xì)胞增殖能力有一定的促進(jìn)作用。其增殖率分別為對(duì)(46.99±22.83)％，(32.25±16.17)％和(20.39±22.45)％。對(duì)照組為(10.50±9.53)％。人參皂苷增殖率為(47.17±23.86)％。明顯高于對(duì)照組。但由于對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)差過(guò)大，故無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其P值分別為0.0688(人參皂苷)和0.063(實(shí)施例2提取物大劑量)。感冒軟膠囊無(wú)明顯作用。
3綜上表明，實(shí)施例2提取物對(duì)正常小鼠特異性和非特異性免疫功能均有一定的促進(jìn)作用。其中對(duì)非特異性免疫功能作用更加明顯。
權(quán)利要求
1.組合物，其包括來(lái)自植物的羌活、獨(dú)活、葛根、黃芩和黃連。
2.提取物，其特征在于該提取物是來(lái)自植物的羌活、獨(dú)活、葛根、黃芩和黃連混合物的C1-4烷基醇提取物。
3.藥物制劑，所述制劑包括權(quán)利要求2的提取物。
4.藥物制劑，其中所述制劑為片劑、膠囊、口服液、懸浮液或注射液。
5.權(quán)利要求3或4的制劑，其中所述制劑的單位劑型中含0.1-0.8g權(quán)利要求2的提取物。
6.權(quán)利要求2的提取物，其中所述提取物含不得低于6.5％的總香豆素。
7.權(quán)利要求2的提取物，其中所述提取物含不得低于24.3％的總黃酮。
8.權(quán)利要求2的提取物，其中所述提取物含不得低于19.2％的總生物堿。
9.權(quán)利要求2提取物的制備方法，其包括a.用含水C1-4烷基醇提取羌活、獨(dú)活、葛根、黃芩和黃連的混合物；b.過(guò)濾a)中提取液，減壓濃縮濾液至浸膏，其相對(duì)密度為1.15-1.20；c.將b)中浸膏與水?dāng)嚢?，室溫靜置，抽濾；d.干躁c)中抽濾后的沉淀物。
10.權(quán)利要求1的組合物或權(quán)利要求2的提取物在制備用于預(yù)防或治療發(fā)燒、由病毒引起的感冒，炎癥或與免疫功能有關(guān)癥狀或疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括羌活，獨(dú)活，黃芩，黃連和葛根的組合物，其提取物，其制備方法及上述組合物或其提取物的藥物用途，尤其是在鎮(zhèn)痛解熱，由病毒尤其是流感病毒引起的感冒，抗炎及增強(qiáng)免疫功能方面的用途。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1907350SQ20051008900
公開(kāi)日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2005年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日
發(fā)明者杜力軍, 鐘睒睒 申請(qǐng)人:養(yǎng)生堂有限公司