專利名稱：繁縷多糖及制備方法和用途及其組合物和制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及繁縷多糖，還涉及該繁縷多糖的制備方法。本發(fā)明還涉及該繁縷多糖的用途，同時(shí)還涉及到含有繁縷多糖的組合物。本發(fā)明也涉及到含有繁縷多糖組合物及其制劑。
繁縷是石竹科植物Stellaria media(L.)Cyr.的干燥全草。歷代本草及書(shū)籍多處記載它有治療惡瘡、皮膚病的功效?！睹绹?guó)化學(xué)文摘》從1920年到2001年第134卷為止，所報(bào)道的繁縷屬植物的化學(xué)成分主要是黃酮及黃酮甙類、皂甙及皂甙原類、環(huán)縮氨酸類、阿魏酸及其酯類、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、奎寧酸、抗壞血酸類、草酸及草酸鈣、單?；肴樘穷愔?、生物堿類等等。CN 1377680A公開(kāi)了一種廣譜抗病毒藥物的制備方法及其用途，它是從植物繁縷或其同屬植物中提取的含硫、含氮、含鈣的總有機(jī)酚酸或/和總有機(jī)酚酸鹽及其糖苷類的大極性化合物的組合物，可以抑制艾滋病病毒、肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、皰疹病毒等?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中還報(bào)導(dǎo)了有關(guān)繁縷與其它藥物組合制成治療濕疹的膏劑，皮膚再生的化妝品，也有繁縷預(yù)防脫發(fā)、牙槽炎、腸粘連疾病及用于口腔清潔等方面的用途。但是至今為止，沒(méi)有報(bào)道過(guò)繁縷多糖的活性，本發(fā)明人在對(duì)繁縷屬植物的研究過(guò)程中，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)繁縷多糖也是具有抗艾滋病病毒和皰疹病毒的活性，而且還發(fā)現(xiàn)繁縷多糖與繁縷總黃酮的組合物的抗艾滋病病毒和皰疹病毒的功效更好，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的之一是提供繁縷多糖。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供繁縷多糖的制備方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種組合物，該組合物含有繁縷多糖和繁縷總黃酮。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供了該組合物的制備方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供了繁縷多糖和含有繁縷多糖的組合物在制備抗病毒藥物的用途。
本發(fā)明所述的繁縷多糖是從繁縷或繁縷屬和牛繁縷屬中提取得到的。分子量分布在4000-2000000之間，多糖上含肽和羧基。
本發(fā)明所述的繁縷多糖可以從下列植物中提取，這些植物包括繁縷屬植物Stellaria L.及牛繁縷屬植物Malachium Fries至少包括以下77種，即薄葉繁縷Stellaria leptohylla Hance、長(zhǎng)瓣繁縷Stellaria hungeana Fenzl.、褐瓣雀舌草Stellariaalsine var.Phaeuspetala Hand.-Mazz.、安徽繁縷Stellariaanhwiensis Migo.、細(xì)尖繁縷Stellaria apiculata Wils.4987Stellaria(L)Scop.、薄葉阿里山繁縷Stellariaarisanensis var.Leptophylla Hayata.、北繁縷Stellariaborealis Bigel.、小茸毛繁縷Stellaria tomentalla Ohwi.、大衛(wèi)繁縷Stellaria davidii Hemsl.、沙生繁縷Stellariaarenaria Maxim.、短瓣繁縷Stellaria brachypetala Bge.、華繁縷Stellaria chinensis Regel.、阿里山繁縷Stellariaarisanensis Hayata.、東北繁縷Stellariacherleriae(Fisch.)Will.、厚葉繁縷Stellaria crassifolia、皺葉繁縷Stellaria crispate Wall.、雀舌草Stellaria alsineGrimm.、偃臥繁縷Stellaria decumbens Edgew.、二歧聚傘花繁縷Stellaria dichasioides Williams.、窄葉雙歧繁縷Stellariadichotoma var.Lanceolata Bge.、西南繁縷Stellaria delavayiFranch.、石竹葉繁縷Stellaria dianthifolia Williams.、針狀偃臥繁縷Stellaria decunbens var.Acicularia Edgew.EtHook.f.、雙歧繁縷Stellaria dichotoma L.、線葉雙歧繁縷Stellaria dichotoma var.Stephenjiana Willd.、澤繁縷Stellaria diversiflora Maxim.、凹脈繁縷Stellaria depressaSchnid.、翻白繁縷Stellaria discolor Turcz.、禾葉繁縷Stellaria graminea L.、鋪散繁縷Stellaria diffusa Wills.、杜氏繁縷Stellaria duthiei Gandoger.、線莖繁縷Stellariafilicaulis Mak.、裸蕊異花繁縷Stellaria diversiflora var.Gymnandra Franch.、多花繁縷Stellaria florida Fisch.、長(zhǎng)毛繁縷Stellaria pilosa Franch.、線柄繁縷Stellaria filipesKomar.、鈍萼繁縷Stellaria amblyosepala Schrenk.、疏柔毛禾葉繁縷Stellaria graminea var.Pilosula Maxim.、變綠禾葉繁縷Stellaria graminea、東繁縷Stellaria maximowixzianaFranch var.Viridescens Maxim.、江孜繁縷Stellariagyantsensis Williams.、湖北繁縷Stellaria henryi Williams.、興安繁縷Stellaria hsinganensis Kitagawa.、霞草繁縷Stellaria gypsophiloides Fenzl.、繁縷Stellariamedia(L.)Cyr.、小花繁縷Stellaria micrantha Hayata.、內(nèi)曲繁縷Stellaria infracta Maxim.、柔繁縷Stellaria mitansWilliams.、鵝腸繁縷Stellaria neglecta Weihe.、新沼生繁縷Stellaria neo-alustris Kitagawa.、八蕊繁縷Stellariaoctandra Fobedim.、紅莓繁縷Stellaria oxycoccoides Komar.、石生繁縷Stellaria saxatilis Buch-Ham.、柄花繁縷Stellariapeduncularis Bge.、臺(tái)灣繁縷Stellaria cicrantha Hayata.、沼生繁縷Stellaria palustria L.、土耳其斯坦繁縷Stellariaturkestanica Schischk.、展葉繁縷Stellaria patentifoliaKitagawa.、假石生繁縷Stellaria pseudosaxatilis Hand.-Mass.、五臺(tái)繁縷Stellaria wutaica Hand.-Mazz.、網(wǎng)脈繁縷Stellaria reticulivena Hayata.、巖繁縷Stellaria rupestrisHemsl.、抱莖石生繁縷Stellaria saxatilis var.AmplexicaulisHand.-mazz.、三型繁縷Stellaria trimorpha Nakai.、小繁縷Stellaria pusilla Schmid.、燧瓣繁縷Stellaria radians L.、準(zhǔn)葛爾繁縷Stellaria soongorica Roshev.、蘇氏繁縷Stellariasouliei Williams.、星毛繁縷Stellaria stellato-pilosaHayata.、園萼繁縷Stellarias tronglosepala Hand.-Mazz.、擬傘花繁縷Stcllaria subumbellata Edgew.、濕地繁縷Stellariauda Williams.、綠花繁縷Stellaria virdiflora Pax et O.Hoffm.、巫山繁縷Stellaria wushanensis Williams.、傘花繁縷Stellaria umbellate Turcz.、云南繁縷Stellariayunnanensis franch.j、及牛繁縷屬植物牛繁縷Malachiumaquaticum(L.)Fries。
本發(fā)明繁縷多糖的制備方法包括下列步驟將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8-12倍的低級(jí)醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶媒后，減壓濃縮提取液至40℃測(cè)定密度為1.05-1.1，向濃縮液中加95％乙醇使醇濃度達(dá)到60-70％，醇沉，過(guò)濾，將沉淀用70％乙醇洗滌至灰白色，在70℃下真空干燥得到，得率為1.6-2.4％，多糖含量為10-15％。
其中低級(jí)醇為30-40％的乙醇、甲醇，也可用異丁醇或正丁醇。優(yōu)選30-40％的乙醇。
本發(fā)明所述的抗艾滋病病毒和皰疹病毒的組合物，它含有80-90％繁縷總黃酮和10-20％繁縷多糖。
本發(fā)明組合物中的繁縷總黃酮可以用下列方法制得將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8-12倍的低級(jí)醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶媒后，減壓濃縮提取液至40℃測(cè)定密度為1.05-1.1，向濃縮液中加95％乙醇使醇濃度達(dá)到60-70％，醇沉，過(guò)濾，濾液濃縮，真空干燥，得到。
本發(fā)明組合物中的繁縷總黃酮還可以用下列方法制得將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8-12倍的低級(jí)醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶媒后，減壓濃縮提取液至40℃測(cè)定密度為1.05-1.1，上大孔樹(shù)脂床分離，以蒸餾水洗脫，再以40-95％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時(shí)，以新西蘭牡荊甙-I作對(duì)照對(duì)洗脫液采用薄層層析法監(jiān)控，收集含有對(duì)應(yīng)色斑的洗脫液，減壓濃縮，70℃下真空干燥，得到。
本發(fā)明所述的組合物中的繁縷總黃酮也可以用下列方法制得將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8-12倍的低級(jí)醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶媒后，減壓濃縮提取液至40℃測(cè)定密度為1.05-1.1，上聚酰胺柱分離，以蒸餾水洗脫，再以40-95％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時(shí)，以新西蘭牡荊甙-I作對(duì)照對(duì)洗脫液采用薄層層析法監(jiān)控，收集含有對(duì)應(yīng)色斑的洗脫液，減壓濃縮，70℃下真空干燥，得到。
本發(fā)明的所述的繁縷總黃酮還可以從下列植物中提取，這些植物包括繁縷屬植物Stellaria L.及牛繁縷屬植物MalachiumFries至少包括以下77種，即薄葉繁縷Stellaria leptohyllaHance、長(zhǎng)瓣繁縷Stellaria hungeana Fenzl.、褐瓣雀舌草Stellaria alsine var.Phaeuspetala Hand.-Mazz.、安徽繁縷Stellaria anhwiensis Migo.、細(xì)尖繁縷Stellaria apiculataWils.4987Stellaria(L)Scop.、薄葉阿里山繁縷Stellariaarisanensis var.Leptophylla Hayata.、北繁縷Stellariaborealis Bigel.、小茸毛繁縷Stellaria tomentalla Ohwi.、大衛(wèi)繁縷Stellaria davidii Hemsl.、沙生繁縷Stellariaarenaria Maxim.、短瓣繁縷Stellaria brachypetala Bge.、華繁縷Stellaria chinensis Regel.、阿里山繁縷Stellariaarisanensis Hayata.、東北繁縷Stellariacherleriae(Fisch.)Will.、厚葉繁縷Stellaria crassifolia、皺葉繁縷Stellaria crispate Wall.、雀舌草Stellaria alsineGrimm.、偃臥繁縷Stellaria decumbens Edgew.、二歧聚傘花繁縷Stellaria dichasioides Williams.、窄葉雙歧繁縷Stellariadichotoma var.Lanceolata Bge.、西南繁縷Stellaria delavayiFranch.、石竹葉繁縷Stellaria dianthifolia Williams.、針狀偃臥繁縷Stellaria decunbens var.Acicularia Edgew.EtHook.f.、雙歧繁縷Stellaria dichotoma L.、線葉雙歧繁縷Stellaria dichotoma var.Stephenjiana Willd.、澤繁縷Stellaria diversiflora Maxim.、凹脈繁縷Stellaria depressaSchnid.、翻白繁縷Stellaria discolor Turcz.、禾葉繁縷Stellaria graminea L.、鋪散繁縷Stellaria diffusa Wills.、杜氏繁縷Stellaria duthiei Gandoger.、線莖繁縷Stellariafilicaulis Mak.、裸蕊異花繁縷Stellaria diversiflora var.Gymnandra Franch.、多花繁縷Stellaria florida Fisch.、長(zhǎng)毛繁縷Stellaria pilosa Franch.、線柄繁縷Stellaria filipesKomar.、鈍萼繁縷Stellaria amblyosepala Schrenk.、疏柔毛禾葉繁縷Stellaria graminea var.Pilosula Maxim.、變綠禾葉繁縷Stellaria graminea、東繁縷Stellaria maximowixzianaFranch var.Viridescens Maxim.、江孜繁縷Stellariagyantsensis Williams.、湖北繁縷Stellaria henryi Williams.、興安繁縷Stellaria hsinganensis Kitagawa.、霞草繁縷Stellaria gypsophiloides Fenzl.、繁縷Stellariamedia(L.)Cyr.、小花繁縷Stellaria micrantha Hayata.、內(nèi)曲繁縷Stellaria infracta Maxim.、柔繁縷Stellaria mitansWilliams.、鵝腸繁縷Stellaria neglecta Weihe.、新沼生繁縷Stellaria neo-alustris Kitagawa.、八蕊繁縷Stellariaoctandra Fobedim.、紅莓繁縷Stellaria oxycoccoides Komar.、石生繁縷Stellaria saxatilis Buch-Ham.、柄花繁縷Stellariapeduncularis Bge.、臺(tái)灣繁縷Stellaria cicrantha Hayata.、沼生繁縷Stellaria palustria L.、土耳其斯坦繁縷Stellariaturkestanica Schischk.、展葉繁縷Stellaria patentifoliaKitagawa.、假石生繁縷Stellaria pseudosaxatilis Hand.-Mass.、五臺(tái)繁縷Stellaria wutaica Hand.-Mazz.、網(wǎng)脈繁縷Stellaria reticulivena Hayata.、巖繁縷Stellaria rupestrisHemsl.、抱莖石生繁縷Stellaria saxatilis var.AmplexicaulisHand.-mazz.、三型繁縷Stellaria trimorpha Nakai.、小繁縷Stellaria pusilla Schmid.、燧瓣繁縷Stellaria radians L.、準(zhǔn)葛爾繁縷Stellaria soongorica Roshev.、蘇氏繁縷Stellariasouliei Williams.、星毛繁縷Stellaria stellato-pilosaHayata.、園萼繁縷Stellaria stronglosepala Hand.-Mazz.、擬傘花繁縷Stellaria subumbellata Edgew.、濕地繁縷Stellariauda Williams.、綠花繁縷Stellaria virdiflora Pax et O.Hoffm.、巫山繁縷Stellaria wushanensis Williams.、傘花繁縷Stellaria umbellate Turcz.、云南繁縷Stellariayunnanensis franch.j、及牛繁縷屬植物牛繁縷Malachiumaquaticum(L.)Fries。
本發(fā)明所述的病毒包括艾滋病病毒、皰疹病毒、呼吸道病毒、腸道病毒、尖銳濕疣病毒、感冒病毒和腺病毒，其中的皰疹病毒包括單純性皰疹病毒-1、單純性皰疹病毒-2和水痘-帶狀皰疹病毒。
實(shí)施例1繁縷多糖將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8倍的20-40％乙醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶媒后，減壓濃縮提取液至40℃測(cè)定密度為1.05-1.1，向濃縮液中加95％乙醇使醇濃度達(dá)到60-70％，醇沉，過(guò)濾，將沉淀用70％乙醇洗滌至灰白色，在70℃下真空干燥得到，得率為2.10％，多糖含量為10-15％(采用硫酸-苯酚法測(cè)定，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn))。
實(shí)施例2采用實(shí)施例1的相同方法，區(qū)別在于將繁縷用小花繁縷替換，得率為1.89％。
實(shí)施例3采用實(shí)施例1的相同方法，區(qū)別在于將繁縷用沙生繁縷替換，得率為1.57％。
實(shí)施例4采用實(shí)施例1的相同方法，區(qū)別在于將繁縷用安徽繁縷替換，得率為2.03％。
實(shí)施例5采用實(shí)施例1的相同方法，區(qū)別在于將繁縷用多葉繁縷替換，得率為1.96％。
實(shí)施例6采用實(shí)施例1的相同方法，區(qū)別在于將繁縷用湖北繁縷替換，得率為1.68％。
實(shí)施例7采用實(shí)施例1的相同方法，區(qū)別在于將繁縷用薄葉繁縷替換，得率為2.21％。
實(shí)施例8采用實(shí)施例1的相同方法，區(qū)別在于將繁縷用華繁縷替換，得率為1.86％。
實(shí)施例9采用實(shí)施例1的相同方法，區(qū)別在于將繁縷用石竹葉繁縷替換，得率為1.78％。
實(shí)施例10口香糖取繁縷多糖330g和繁縷總黃酮42g，以適量的口香糖膠，以戊糖作矯味劑，制成1000片每片含372g活性成分的口香糖。作為口腔抗病毒消毒劑、保健品。
實(shí)施例11含片取繁縷多糖330g和繁縷總黃酮42g，加適量的香料、矯味劑和輔料，壓片制成1000含片，每片含活性成分372mg。用于口腔抗病毒消毒劑和保健品。
實(shí)施例12糖漿劑取繁縷多糖330g、繁縷總黃酮42g、苯甲酸鈉25g和適量的桔子香精，用單糖漿配成10000ml?？诜?，每次10ml，一日三次。用于治療艾滋病、單純性皰疹和水痘-帶狀皰疹等各種病毒性疾病。
實(shí)施例13片劑取繁縷多糖330g和繁縷總黃酮42g，加淀粉糊精制成1000片。一日三次，每次1-2片。用于治療艾滋病、單純性皰疹和水痘-帶狀皰疹等各種病毒性疾病。
實(shí)施例14膠囊劑取繁縷多糖330g和繁縷總黃酮42g，加淀粉糊精適量制成小顆粒，填入1000粒膠囊，含活性成份372mg/粒。用于治療艾滋病、單純性皰疹和水痘-帶狀皰疹等各種病毒性疾病。
實(shí)施例15乳劑將單硬脂酸鋁10g加熱溶于精制麻油80ml中，加司盤(pán)-80 10g，然后加實(shí)施例提取的繁縷多糖330g和繁縷總黃酮42g水溶液5000ml，攪拌乳化，使成W/O型乳劑。另取2％吐溫-80水溶液加入上述W/O型乳劑中，邊加邊攪拌，最后通過(guò)乳勻機(jī)，勻化得到W/O/W型復(fù)合乳劑。W/O型乳劑直徑4μm。用于治療艾滋病、單純性皰疹和水痘-帶狀皰疹等各種病毒性疾病。
試驗(yàn)例1繁縷多糖體外抗艾滋病病毒的活性試驗(yàn)1材料和方法病毒HIV-1018a是從AZT治療前的HIV-1感染的個(gè)體獲得。它由美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校的Douglas Richmen教授提供。
細(xì)胞外周血單核細(xì)胞(PBMC)使用Ficoll-Hypaque密度梯度離心方法，從未感染HIV的健康供血者的外周血分離得到的。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)抗病毒活性的測(cè)定將2×105PBMC/100微升的新西蘭牡荊甙-1暴露于用接種50微升的HIV-1的100TCID50。同時(shí)，給每個(gè)孔中加入各種濃度的新西蘭牡荊甙100微升。感染4天培后，取上清液測(cè)定p24抗原產(chǎn)生。按照操作說(shuō)明通過(guò)完整病毒抗原捕獲ELISA(Coulter Corp.，Hialeah FL)復(fù)制來(lái)定量HIV-1p24抗原。細(xì)胞毒性測(cè)定使用包括3H-胸腺嘧啶所測(cè)定的細(xì)胞增生描述可能的藥物細(xì)胞毒性作用。在含有各種濃度的新西蘭牡荊甙-1的96孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)4天后，將1μ Ci胸腺嘧啶(DuPont NEN，Boston MA)加入到2×105細(xì)胞/200微升培養(yǎng)基。加入3H-胸腺嘧啶后，在37℃培養(yǎng)6小時(shí)并測(cè)定3H-TdR。用SigmaPlot Scirntific GraphingSystem計(jì)算50％抑制濃度(IC50)和50％毒性濃度(TC50)，計(jì)算治療指數(shù)TI值＝TC50/IC50。
試驗(yàn)結(jié)果HIV-1018a p24抗原產(chǎn)生(pg/ml)(感染后4天，用病毒將細(xì)胞感染2小時(shí))
結(jié)論繁縷多糖對(duì)相同時(shí)間病毒接種的細(xì)胞的IC50為0.17μg/ml，TC50為453.4μg/ml，治療指數(shù)為2667。繁縷多糖對(duì)HIV-1018a預(yù)感染PBMCs3小時(shí)的IC50為0.39μg/ml，TC50為453.4μg/ml，治療指數(shù)為1162.6。
試驗(yàn)例2繁縷多糖和繁縷總黃酮組合物體外抗皰疹病毒的活性試驗(yàn)
1試驗(yàn)材料和方法細(xì)胞As49/20S細(xì)胞(用于單純皰疹病毒I型，HSV-1的培養(yǎng))，A-549細(xì)胞(用于單純皰疹病毒II型，HSV-II的培養(yǎng))購(gòu)自美國(guó)ATCC；HELF(人胚肺成纖維細(xì)胞，用于水痘-帶狀皰疹病毒，VZV的培養(yǎng))由美國(guó)科州醫(yī)學(xué)中心兒科傳染病系提供。
培養(yǎng)基最小基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle(Sigma，St Louis，MO，美國(guó))，加上10％胎牛血清。
病毒毒株HSV-I 690，HSV-II SKB-1，CAVZV均由美國(guó)科州醫(yī)學(xué)中心兒科傳染病系提供。
樣品繁縷總黃酮和繁縷多糖的組合物由海南制藥集團(tuán)藥物研究所提供。對(duì)照藥物磷甲酸(PFA)和阿昔洛韋由美國(guó)科州醫(yī)學(xué)中心傳染病系提供。
抗HSV-1和抗VZV活性根據(jù)保護(hù)細(xì)胞病變作用的程度決定?？笻SV-II的活性根據(jù)病毒形成的空斑數(shù)目變化決定。
樣品毒性測(cè)定用苔玢藍(lán)染色方法判斷細(xì)胞成活數(shù)目，藍(lán)染細(xì)胞為死細(xì)胞，無(wú)色細(xì)胞為活細(xì)胞。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用Chou Dose Effect的軟件處理數(shù)據(jù)。
2試驗(yàn)設(shè)計(jì)樣品在細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)HSV-1復(fù)制的抑制作用樣品和陽(yáng)性對(duì)照藥物阿昔洛韋和磷甲酸在96-孔培養(yǎng)板內(nèi)連續(xù)1∶4稀釋，每孔藥物的體積為100微升。As49/20S細(xì)胞100微升(106細(xì)胞/毫升)和50微升HSV-1-690(MOI＝0.005)加入每一孔中。在37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)程度。無(wú)病變和CPE在＜25％、＜50％、＜75％和＞75％分別給予-，+，++，+++，++++的記錄。毒性測(cè)定的設(shè)計(jì)相同于上述敘述，只是用50微升的培養(yǎng)液代替病毒懸液，并在48小時(shí)后用Typan Blue染色決定細(xì)胞死活數(shù)目，最后用Chou Dose Effect軟件處理數(shù)據(jù)，算出藥物50％抑制濃度IC50。
樣品在細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)HSV-II復(fù)制的抑制作用樣品和陽(yáng)性對(duì)照藥物阿昔洛韋在96-孔培養(yǎng)板內(nèi)連續(xù)1∶4稀釋，每孔藥物的體積為100微升。A-549細(xì)胞100微升(106細(xì)胞/毫升)和50微升HSV-II SKB-1(MOI＝0.005)加入每一孔中。在37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)72小時(shí)，用Gicmsa染細(xì)胞，計(jì)數(shù)空斑數(shù)目。毒性測(cè)定與數(shù)據(jù)處理同前述，算出藥物50％抑制濃度IC50。
樣品在細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)VZV復(fù)制的抑制第20代的HELF用0.5％胰酶/EDTA1消化制成105/毫升的細(xì)胞懸液。0.5毫升的HELF細(xì)胞懸液種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，在37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)，細(xì)胞單層成長(zhǎng)。被CAVZV感染的105HFLF細(xì)胞加到每一孔中攻擊正常的HELF細(xì)胞，2小時(shí)后加入不同濃度的樣品和陽(yáng)性對(duì)照藥物阿昔洛韋并在37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)。在感染4天后于顯微鏡下觀察CPE，記錄病變的程度為-，+，++，+++，++++，代表無(wú)病變，CPE＜25％，＜50％，＜75％，＞75％。毒性測(cè)定與數(shù)據(jù)處理與前相同，算出藥物50％的抑制濃度。
3結(jié)果表1新西蘭牡荊甙-1抗HSV-1的活性感染2天后的As49/20S細(xì)胞系中的HSV-1(HSV-1 690)的細(xì)胞病理作用
表2新西蘭牡荊甙-1抗HSV-2的活性PEU的數(shù)量/0.1(105細(xì)胞)HSV-2(SKB-1)所產(chǎn)生的A-549細(xì)胞
表3新西蘭牡荊甙-1抗VZV體外活性試驗(yàn)人胎肺成纖維細(xì)胞(HELF)的VZV的細(xì)胞病理作用
4結(jié)論本發(fā)明組合物體外明顯抑制HSV-1、HSV-2、VZV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，50％抑制HSV-1濃度為30.9微克/毫升；50％抑制HSV-2的濃度為45.3微克/毫升；50％抑制VZV的濃度為200微克/毫升。根據(jù)IC50的數(shù)據(jù)，本發(fā)明組合物抑制HSV-1＞HSV-2＞VZV。
試驗(yàn)例2本發(fā)明組合物體外抗艾滋病病毒的活性試驗(yàn)1材料和方法病毒HIV-1018a是從AZT治療前的HIV-1感染的個(gè)體獲得。它由美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校的Douglas Richmen教授提供。
細(xì)胞外周血單核細(xì)胞(PBMC)使用Ficoll-Hypaque密度梯度離心方法，從未感染HIV的健康供血者的外周血分離得到的。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)抗病毒活性的測(cè)定將2×105PBMC/100微升的新西蘭牡荊甙-1暴露于用接種50微升的HIV-1的100TCID50。同時(shí)，給每個(gè)孔中加入各種濃度的新西蘭牡荊甙100微升。感染4天培后，取上清液測(cè)定p24抗原產(chǎn)生。按照操作說(shuō)明通過(guò)完整病毒抗原捕獲ELISA(Coulter Corp.，Hialeah FL)復(fù)制來(lái)定量HIV-1p24抗原。細(xì)胞毒性測(cè)定使用包括3H-胸腺嘧啶所測(cè)定的細(xì)胞增生描述可能的藥物細(xì)胞毒性作用。在含有各種濃度的新西蘭牡荊甙-1的96孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)4天后，將1μCi胸腺嘧啶(DuPont NEN，Boston MA)加入到2×105細(xì)胞/200微升培養(yǎng)基。加入3H-胸腺嘧啶后，在37℃培養(yǎng)6小時(shí)并測(cè)定3H-TdR。用SigmaPlot Scirntific GraphingSystem計(jì)算50％抑制濃度(IC50)和50％毒性濃度(TC50)，計(jì)算治療指數(shù)TI值＝TC50/IC50。
試驗(yàn)結(jié)果HIV-1018a p24抗原產(chǎn)生(pg/ml)(感染后4天，用病毒將細(xì)胞感染2小時(shí))
結(jié)論繁縷多糖和繁縷總黃酮的組合物對(duì)相同時(shí)間病毒接種的細(xì)胞的IC50為9.7μg/ml，TC50為200.5μg/ml，治療指數(shù)為21。繁縷多糖和繁縷總黃酮的組合物對(duì)HIV-1018a預(yù)感染PBMCs3小時(shí)的IC50為11.5μg/ml，TC50為200.5μg/ml，治療指數(shù)為17。
權(quán)利要求
1.繁縷多糖，其特征在于它是從繁縷中提取的，分子量分布在4000-2000000之間，多糖上含肽和羧基。
2.按照權(quán)利要求1所述的繁縷多糖，它可以采用下列方法提取得到將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8-12倍的低級(jí)醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶媒后，減壓濃縮提取液至40℃測(cè)定密度為1.05-1.1，向濃縮液中加95％乙醇使醇濃度達(dá)到60-70％，醇沉，過(guò)濾，將沉淀用70％乙醇洗滌至灰白色，在70℃下真空干燥得到，得率為1.6-2.4％，多糖含量為10-15％。
3.按照權(quán)利要求2所述的繁縷多糖，其中低級(jí)醇為30-40％的乙醇、甲醇，也可用異丁醇或正丁醇。
4.按照權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述的繁縷多糖，其中它還可以從下列植物中提取獲得薄葉繁縷Stellaria leptohyllaHance、長(zhǎng)瓣繁縷Stellaria hungeana Fenzl.、褐瓣雀舌草Stellaria alsine var.Phaeuspetala Hand.-Mazz.、安徽繁縷Stellaria anhwiensis Migo.、細(xì)尖繁縷Stellaria apiculataWils.4987Stellaria(L)Scop.、薄葉阿里山繁縷Stellariaarisanensis var.Leptophylla Hayata.、北繁縷Stellariaborealis Bigel.、小茸毛繁縷Stellaria tomentalla Ohwi.、大衛(wèi)繁縷Stellaria davidii Hemsl.、沙生繁縷Stellariaarenaria Maxim.、短瓣繁縷Stellaria brachypetala Bge.、華繁縷Stellaria chinensis Regel.、阿里山繁縷Stellariaarisanensis Hayata.、東北繁縷Stellariacherleriae(Fisch.)Will.、厚葉繁縷Stellaria crassifolia、皺葉繁縷Stellaria crispate Wall.、雀舌草Stellaria alsineGrimm.、偃臥繁縷Stellaria decumbens Edgew.、二歧聚傘花繁縷Stellaria dichasioides Williams.、窄葉雙歧繁縷Stellariadichotoma var.Lanceolata Bge.、西南繁縷Stellaria delavayiFranch.、石竹葉繁縷Stellaria dianthifolia Williams.、針狀偃臥繁縷Stellaria decunbens var.Acicularia Edgew.EtHook.f.、雙歧繁縷Stellaria dichotoma L.、線葉雙歧繁縷Stellaria dichotoma var.Stephenjiana Willd.、澤繁縷Stellaria diversiflora Maxim.、凹脈繁縷Stellaria depressaSchnid.、翻白繁縷Stellaria discolor Turcz.、禾葉繁縷Stellaria graminea L.、鋪散繁縷Stellaria diffusa Wills.、杜氏繁縷Stellaria duthiei Gandoger.、線莖繁縷Stellariafilicaulis Mak.、裸蕊異花繁縷Stellaria diversiflora var.Gymnandra Franch.、多花繁縷Stellaria florida Fisch.、長(zhǎng)毛繁縷Stellaria pilosa Franch.、線柄繁縷Stellaria filipesKomar.、鈍萼繁縷Stellaria amblyosepala Schrenk.、疏柔毛禾葉繁縷Stellaria graminea var.Pilosula Maxim.、變綠禾葉繁縷Stellaria graminea、東繁縷Stellaria maximowixzianaFranch var.Viridescens Maxim.、江孜繁縷Stellariagyantsensis Williams.、湖北繁縷Stellaria henryi Williams.、興安繁縷Stellaria hsinganensis Kitagawa.、霞草繁縷Stellaria gypsophiloides Fenzl.、小花繁縷Stellariamicrantha Hayata.、內(nèi)曲繁縷Stellaria infracta Maxim.、柔繁縷Stellaria mitans Williams.、鵝腸繁縷Stellaria neglectaWeihe.、新沼生繁縷Stellaria neo-alustris Kitagawa.、八蕊繁縷Stellaria octandra Fobedim.、紅莓繁縷Stellariaoxycoccoides Komar.、石生繁縷Stellaria saxatilis Buch-Ham.、柄花繁縷Stellaria peduncularis Bge.、臺(tái)灣繁縷Stellaria cicrantha Hayata.、沼生繁縷Stel laria palustriaL.、土耳其斯坦繁縷Stellaria turkestanica Schischk.、展葉繁縷Stellaria patentifolia Kitagawa.、假石生繁縷Stellariapseudosaxatilis Hand.-Mass.、五臺(tái)繁縷Stellaria wutaicaHand.-Mazz.、網(wǎng)脈繁縷Stellaria reticulivena Hayata.、巖繁縷Stellaria rupestris Hemsl.、抱莖石生繁縷Stellariasaxatilis var.Amplexicaulis Hand.-mazz.、三型繁縷Stellariatrimorpha Nakai.、小繁縷Stellaria pusilla Schmid.、燧瓣繁縷Stellaria radians L.、準(zhǔn)葛爾繁縷Stellaria soongoricaRoshev.、蘇氏繁縷Stellaria souliei Williams.、星毛繁縷Stellaria stellato-pilosa Hayata.、園萼繁縷Stellariastronglosepala Hand.-Mazz.、擬傘花繁縷Stellariasubumbellata Edgew.、濕地繁縷Stellaria uda Williams.、綠花繁縷Stellaria virdiflora Pax et O.Hoffm.、巫山繁縷Stellaria wushanensis Williams.、傘花繁縷Stellariaumbellate Turcz.、云南繁縷Stellaria yunnanensis franch.j、及牛繁縷屬植物牛繁縷Malachium aquaticum(L.)Fries。
5.繁縷多糖的制備方法，它包括下列步驟將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8-12倍的低級(jí)醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶媒后，減壓濃縮提取液至40℃測(cè)定密度為1.05-1.1，向濃縮液中加95％乙醇使醇濃度達(dá)到60-70％，醇沉，過(guò)濾，將沉淀用70％乙醇洗滌至灰白色，在70℃下真空干燥得到。
6.按照權(quán)利要求5所述的繁縷多糖制備方法，其中低級(jí)醇為30-40％的乙醇、甲醇，也可用異丁醇或正丁醇。
7.按照權(quán)利要求6所述的繁縷多糖制備方法，其中30-40％的乙醇。
8.按照權(quán)利要求5-6所述的制備方法，其中的可以用下列植物替換繁縷植物薄葉繁縷Stellaria leptohylla Hance、長(zhǎng)瓣繁縷Stellaria hungeana Fenzl.、褐瓣雀舌草Stellaria alsincvar.Phaeuspetala Hand.-Mazz.、安徽繁縷Stellaria anhwiensisMigo.、細(xì)尖繁縷Stellaria apiculata Wils.4987Stellaria(L)Scop.、薄葉阿里山繁縷Stellaria arisanensis var.Leptophylla Hayata.、北繁縷Stellaria borealis Bigel.、小茸毛繁縷Stellaria tomentalla Ohwi.、大衛(wèi)繁縷Stellariadavidii Hemsl.、沙生繁縷Stellaria arenaria Maxim.、短瓣繁縷Stellaria brachypetala Bge.、華繁縷Stellaria chinensisRegel.、阿里山繁縷Stellaria arisanensis Hayata.、東北繁縷Stellaria cherleriae(Fisch.)Will.、厚葉繁縷Stellariacrassifolia、皺葉繁縷Stellaria crispate Wall.、雀舌草Stellaria alsine Grimm.、偃臥繁縷Stellaria decumbensEdgew.、二歧聚傘花繁縷Stellaria dichasioides Williams.、窄葉雙歧繁縷Stellaria dichotoma var.Lanceolata Bge.、西南繁縷Stellaria delavayi Franch.、石竹葉繁縷Stellariadianthifolia Williams.、針狀偃臥繁縷Stellaria decunbens var.Acicularia Edgew.Et Hook.f.、雙歧繁縷Stellaria dichotomaL.、線葉雙歧繁縷Stellaria dichotoma var.StephenjianaWilld.、澤繁縷Stellaria diversiflora Maxim.、凹脈繁縷Stellaria depressa Schnid.、翻白繁縷Stellaria discolorTurcz.、禾葉繁縷Stellaria graminea L.、鋪散繁縷Stellariadiffusa Wills.、杜氏繁縷Stellaria duthiei Gandoger.、線莖繁縷Stellaria filicaulis Mak.、裸蕊異花繁縷Stellariadiversiflora var.Gymnandra Franch.、多花繁縷Stellariaflorida Fisch.、長(zhǎng)毛繁縷Stellaria pilosa Franch.、線柄繁縷Stellaria filipes Komar.、鈍萼繁縷Stellaria amblyosepalaSchrenk.、疏柔毛禾葉繁縷Stellaria graminea var.PilosulaMaxim.、變綠禾葉繁縷Stellaria graminea、東繁縷Stellariamaximowixziana Franch var.Viridescens Maxim.、江孜繁縷Stellaria gyantsensis Williams.、湖北繁縷Stellaria henryiWilliams.、興安繁縷Stellaria hsinganensis Kitagawa.、霞草繁縷Stellaria gypsophi loides Fenzl.、小花繁縷Stellariamicrantha Hayata.、內(nèi)曲繁縷Stellaria infracta Maxim.、柔繁縷Stellaria mitans Williams.、鵝腸繁縷Stellaria neglectaWeihe.、新沼生繁縷Stellaria neo-alustris Kitagawa.、八蕊繁縷Stellaria octandra Fobedim.、紅莓繁縷Stellariaoxycoccoides Komar.、石生繁縷Stellaria saxatilis Buch-Ham.、柄花繁縷Stellaria peduncularis Bge.、臺(tái)灣繁縷Stellaria cicrantha Hayata.、沼生繁縷Stellaria palustriaL.、土耳其斯坦繁縷Stellaria turkestanica Schischk.、展葉繁縷Stellaria patentifolia Kitagawa.、假石生繁縷Stellariapseudosaxatilis Hand.-Mass.、五臺(tái)繁縷Stellaria wutaicaHand.-Mazz.、網(wǎng)脈繁縷Stellaria reticulivena Hayata.、巖繁縷Stellaria rupestris Hemsl.、抱莖石生繁縷Stellariasaxatilis var.Amplexicaulis Hand.-mazz.、三型繁縷Stellariatrimorpha Nakai.、小繁縷Stellaria pusilla Schmid.、燧瓣繁縷Stellaria radians L.、準(zhǔn)葛爾繁縷Stellaria soongoricaRoshev.、蘇氏繁縷Stellaria souliei Williams.、星毛繁縷Stellaria stellato-pilosa Hayata.、園萼繁縷Stellariastronglosepala Hand.-Mazz.、擬傘花繁縷Stellariasubumbellata Edgew.、濕地繁縷Stellaria uda Williams.、綠花繁縷Stellaria virdiflora Pax et O.Hoffm.、巫山繁縷Stellaria wushanensis Williams.、傘花繁縷Stellariaumbellate Turcz.、云南繁縷Steliaria yunnanensis franch.j、及牛繁縷屬植物牛繁縷Malachium aquaticum(L.)Fries。
9.繁縷多糖在制備抗病毒藥物的用途。
10.按照權(quán)利要求9所述的用途，其中的病毒為艾滋病病毒和皰疹病毒。
11.按照權(quán)利要求10所述的用途，其中的皰疹病毒為單純性皰疹病毒-1、單純性皰疹病毒-2和水痘-帶狀皰疹病毒。
12.一種治療艾滋病病毒和皰疹病毒的組合物，它含有80-90％繁縷總黃酮和10-20％繁縷多糖。
13.按照權(quán)利要求12所述的組合物，其中的繁縷總黃酮可以用下列方法制得將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8-12倍的低級(jí)醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶媒后，減壓濃縮提取液至40℃測(cè)定密度為1.05-1.1，向濃縮液中加95％乙醇使醇濃度達(dá)到60-70％，醇沉，過(guò)濾，濾液濃縮，真空干燥，得到。
14.按照權(quán)利要求12所述的組合物，其中的繁縷總黃酮可以用下列方法制得將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8-12倍的低級(jí)醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶媒后，減壓濃縮提取液至40℃測(cè)定密度為1.05-1.1，上大孔樹(shù)脂床分離，以蒸餾水洗脫，再以40-95％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時(shí)，以新西蘭牡荊甙-I作對(duì)照對(duì)洗脫液采用薄層層析法監(jiān)控，收集含有對(duì)應(yīng)色斑的洗脫液，減壓濃縮，70℃下真空干燥，得到。
15.按照權(quán)利要求12所述的組合物，其中的繁縷總黃酮可以用下列方法制得將繁縷生藥或鮮草(折換成干草)用8-12倍的低級(jí)醇在40-50℃減壓回流提取，每次1-3小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶媒后，減壓濃縮提取液至40℃測(cè)定密度為1.05-1.1，上聚酰胺柱分離，以蒸餾水洗脫，再以40-95％的乙醇或甲醇洗脫，洗脫時(shí)，以新西蘭牡荊甙-I作對(duì)照對(duì)洗脫液采用薄層層析法監(jiān)控，收集含有對(duì)應(yīng)色斑的洗脫液，減壓濃縮，70℃下真空干燥，得到。
16.權(quán)利要求13-15中任何一項(xiàng)所述的組合物，其中低級(jí)醇為30-40％的乙醇、甲醇，也可用異丁醇或正丁醇。
17.按照權(quán)利要求16所述的組合物，其中30-40％的乙醇。
18.按照權(quán)利要求13-17中任何一項(xiàng)所述的組合物，其中繁縷總黃酮還可以從下列植物提取繁縷屬植物Stellaria L.及牛繁縷屬植物Malachium Fries至少包括以下77種，即薄葉繁縷Stellaria leptohylla Hance、長(zhǎng)瓣繁縷Stellaria hungeanaFenzl.、褐瓣雀舌草Stellaria alsine var.PhaeuspetalaHand.-Mazz.、安徽繁縷Stellaria anhwiensis Migo.、細(xì)尖繁縷Stellaria apiculata Wils.4987Stellaria(L)Scop.、薄葉阿里山繁縷Stellaria arisanensis var.Leptophylla Hayata.、北繁縷Stellaria borealis Bigel.、小茸毛繁縷Stellariatomentalla Ohwi.、大衛(wèi)繁縷Stellaria davidii Hemsl.、沙生繁縷Stellaria arenaria Maxim.、短瓣繁縷Stellariabrachypetala Bge.、華繁縷Stellaria chinensis Regel.、阿里山繁縷Stellaria arisanensis Hayata.、東北繁縷Stellariacherleriae(Fisch.)Will.、厚葉繁縷Stellaria crassifolia、皺葉繁縷Stellaria crispate Wall.、雀舌草Stellaria alsineGrimm.、偃臥繁縷Stellaria decumbens Edgew.、二歧聚傘花繁縷Stellaria dichasioides Williams.、窄葉雙歧繁縷Stellariadichotoma var.Lanceolata Bge.、西南繁縷Stellaria delavayiPranch.、石竹葉繁縷Stellaria dianthifolia Williams.、針狀偃臥繁縷Stellaria decunbens var.Acicularia Edgew.EtHook.f.、雙歧繁縷Stellaria dichotoma L.、線葉雙歧繁縷Stellaria dichotoma var.Stephenjiana Willd.、澤繁縷Stellaria diversiflora Maxim.、凹脈繁縷Stellaria depressaSchnid.、翻白繁縷Stellaria discolor Turcz.、禾葉繁縷Stellaria graminea L.、鋪散繁縷Stellaria diffusa Wills.、杜氏繁縷Stellaria duthiei Gandoger.、線莖繁縷Stellariafilicaulis Mak.、裸蕊異花繁縷Stellaria diversiflora var.Gymnandra Franch.、多花繁縷Stellaria florida Fisch.、長(zhǎng)毛繁縷Stellaria pilosa Franch.、線柄繁縷Stellaria filipesKomar.、鈍萼繁縷Stellaria amblyosepala Schrenk.、疏柔毛禾葉繁縷Stellaria graminea var.Pilosula Maxim.、變綠禾葉繁縷Stellaria graminea、東繁縷Stellaria maximowixzianaFranch var.Viridescens Maxim.、江孜繁縷Stellariagyantsensis Williams.、湖北繁縷Stellaria henryi Williams.、興安繁縷Stellaria hsinganensis Kitagawa.、霞草繁縷Stellaria gypsophiloides Fenzl.、繁縷Stellariamedia(L.)Cyr.、小花繁縷Stellaria micrantha Hayata.、內(nèi)曲繁縷Stellaria infracta Maxim.、柔繁縷Stellaria mitansWilliams.、鵝腸繁縷Stellaria neglecta Weihe.、新沼生繁縷Stellaria neo-alustris Kitagawa.、八蕊繁縷Stellariaoctandra Fobedim.、紅莓繁縷Stellaria oxycoccoides Komar.、石生繁縷Stellaria saxatilis Buch-Ham.、柄花繁縷Stellariapeduncularis Bge.、臺(tái)灣繁縷Stellaria cicrantha Hayata.、沼生繁縷Stellaria palustria L.、土耳其斯坦繁縷Stellariaturkestanica Schischk.、展葉繁縷Stellaria patentifoliaKitagawa.、假石生繁縷Stellaria pseudosaxatilis Hand.-Mass.、五臺(tái)繁縷Stellaria wutaica Hand.-Mazz.、網(wǎng)脈繁縷Stellaria reticulivena Hayata.、巖繁縷Stellaria rupestrisHemsl.、抱莖石生繁縷Stellaria saxatilis var.AmplexicaulisHand.-mazz.、三型繁縷Stellaria trimorpha Nakai.、小繁縷Stellaria pusilla Schmid.、燧瓣繁縷Stellaria radians L.、準(zhǔn)葛爾繁縷Stellaria soongorica Roshev.、蘇氏繁縷Stellariasouliei Williams.、星毛繁縷Stellaria stellato-pilosaHayata.、園萼繁縷Stellaria stronglosepala Hand.-Mazz.、擬傘花繁縷Stellaria subumbellata Edgew.、濕地繁縷Stellariauda Williams.、綠花繁縷Stellaria virdiflora Pax et O.Hoffm.、巫山繁縷Stellaria wushanensis Williams.、傘花繁縷Stellaria umbellate Turcz.、云南繁縷Stellariayunnanensis franch.j、及牛繁縷屬植物牛繁縷Malachiumaquaticum(L.)Fries。
19.權(quán)利要求12-18中任何一項(xiàng)所述的組合物在制備抗病毒藥物的用途。
20.按照權(quán)利要求19所述的用途，其中病毒包括艾滋病病毒和皰疹病毒。
21.按照權(quán)利要求20所述的用途，其中的皰疹病毒包括單純性皰疹病毒-1、單純性皰疹病毒-2和水痘-帶狀皰疹病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了繁縷多糖、繁縷多糖的制備方法和繁縷多糖在抗艾滋病病毒和皰疹病毒的藥物的用途。本發(fā)明還公開(kāi)了含有繁縷多糖和繁縷總黃酮的組合物，該組合物在抗艾滋病病毒和皰疹病毒方面有更好的功效。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1521193SQ0310361
公開(kāi)日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者樓金, 張龍清, 張興權(quán), 樓 金 申請(qǐng)人:海南亞洲制藥有限公司