專利名稱：重組的減毒細小病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于用于保護動物免于細小病毒感染的病毒疫苗、它們的生產(chǎn)和用途的領域。更具體地，本發(fā)明涉及包含減毒細小病毒的疫苗，所述減毒細小病毒包括可源自新的細小病毒分離物的衣殼蛋白及其片段。
背景技術：
細小病毒屬于單鏈DNA病毒科。在一些動物如貓、狗和豬中，細小病毒可引起疾病。因為病毒需要活躍分裂的細胞以便復制，感染的組織的類型隨動物的年齡而變化。在任何年齡都可以影響胃腸道和淋巴系統(tǒng)，導致嘔吐、腹瀉和免疫抑制，但是在子宮內(nèi)或在小于兩周齡時被感染的貓中僅看到小腦發(fā)育不全，在3周和8周齡之間被感染的小狗中看到心肌疾病。
犬細小病毒是在年幼小狗中尤其致命的疾病，約80%致死，在非常年幼的小狗中引起胃腸道損傷和脫水以及心臟綜合癥。它是通過與被感染的狗的糞便接觸而傳播的。癥狀包括嗜睡、嚴重腹瀉、發(fā)燒、嘔吐、食欲不振和脫水。豬細小病毒在豬中引起被稱為SMEDI的生殖疾病，其代表為死胎、木乃伊化、胚胎死亡和不孕。貓泛白細胞減少癥在小貓中常見，并引起發(fā)燒、低白細胞數(shù)、腹瀉和死亡。小于兩周的貓?zhí)汉托∝埖母腥疽鹦∧X發(fā)育不全。水貂腸炎病毒在對貓泛白細胞減少癥的作用中是相似的，除了它不會引起小腦發(fā)育不全。不同的細小病毒在水紹和其它Il自科動物中引起阿留申病(Aleutian Disease),其特征在于淋巴結(jié)病、脾腫大、腎小球性腎炎、貧血和死亡。細小病毒的最準確的診斷方法是通過ELISA?？梢詫ω?、狗和豬進行針對細小病毒的免疫。在DNA水平上，已知犬、貓和豬細小病毒具有高度同源的基因組。犬細小病毒(CPV2)是ー種在狗中引起急性、且有時是致命的腸炎的病毒(Kelly，Aust. Vet. J. 54;593，1978;Appel 等，Vet. Rec. 105 ;156_159，1979)。1977 年左右首先出現(xiàn)的該病毒可能通過單個衣殼蛋白中少數(shù)突變而從在貓中非常密切相關的病毒(即貓泛白細胞減少癥病毒(FPLV))產(chǎn)生的；物種跳躍可能涉及在其它食肉動物(如水貂或浣熊)的中間傳遞(Truyen 等，Virology 215, 186-189，1996)。早在1979年，出現(xiàn)了 CPV2的第一種變異體，被稱為CPV2a，隨后很快在1984年出現(xiàn)了 CPV2b (Parrish 等，Science 230，1046-1048, 1985，和 J. Virol. 65 ;6544_6552，1991)。最初的2型病毒現(xiàn)在已經(jīng)從野外(field)中消失，被2a和2b變異體所替代；盡管這兩種類型的相對比例在國與國間有變化(前面的Truyen等；Chinchkar等，Arch.Virol. 151， 1881-1887， 2006 ；Pereira 等，Infect. Genet. Evol. 3， 399-409，2007)。在衣殼蛋白(VP2)中的氨基酸變化，其特征為從2至2a以及至2b的轉(zhuǎn)變，是非常有限的。在 87 (Met 至 Leu)、300 (Gly 至 Ala)、305 (Tyr 至 Asp)和 555 (Val 至 lie)位的替換發(fā)生在2至2a的進化中，在426 (Asn至Asp)和555 (lie至Val)的替換發(fā)生在從2a出現(xiàn) 2b 中(前面的 Parrish 等；Truyen 等，J. Virol. 69，4702-4710，1995)。最近，報道了在 555 位缺乏 Val 至 Ile 替換的 2a 株(Wang 等，VirusGenes 31，171-174，2005 ；Martella等，Virus Genes 33, 11-13，2006)。似乎單一的氨基酸改變可以區(qū)分CPV2a和CPV2b VP2序列。新近，在意大利出現(xiàn)了病毒株，其中426位的氨基酸(2a中為Asn，2b中為Asp)已經(jīng)變?yōu)楣劝彼?Glu)殘基(Buonavoglia 等，J. Gen. Virol. 82，3021-3025，2001 ；Martella 等，J. Clin. Microbiol. 42，1333-1336，2004)。這些被稱為 CPV2c 病毒的Glu 426變異體是在意大利和其他歐洲國家傳播的(circulating)并與其它CPV類型共存(Decaro 等，J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472，2006),并且也已經(jīng)在地理上多樣的國家如越南和蘇格蘭分離得到(Nakamura等，ArchVirol. 149, 2261-2269，2004，Spibey 等，Vet. Microbiol 128，48-55，2008)，這些事實表明它們在至少一定比例的狗群體中具有優(yōu)勢。犬細小病毒的相對快速進化已經(jīng)導致貓宿主范圍的丟失以及然后重新獲得(前面的Truyen等，1996)，這種重新獲得的在貓中復制的能力可以很好地解釋2a、2b和2c變異體對最初的2型病毒的替代。在二十世紀七十年代末期和二十世紀八十年代早期，由于 刺激交叉保護的共享抗原，活的和滅活的FPL疫苗用于保護狗免于CPV疾病，然而它們提供的保護水平較差，免疫持續(xù)時間較短。這些疫苗被活的減毒CPV疫苗所替代，其提供了優(yōu)異的保護和更長的免疫持續(xù)時間。目前活的減毒疫苗來自CPV2b分離物或最初的2型病毒。由于2型病毒已經(jīng)在該野外中被2a、2b以及現(xiàn)在的2c病毒完全替代，已經(jīng)考慮到對于減毒的 2 型疫苗提供的保護水平(Pratelli 等，Clin. Diag. Lab. Tmmuno1. 8, 612-615，2001 ；Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50，1999)。然而，基于現(xiàn)有的單克隆抗體的研究，與以前的變異體相比，每種新的抗原變異體已經(jīng)失去至少一個中和表位(Strassheim等，Virology 198, 175-184，1994 ;前面的Pereira等)。以前已經(jīng)表明，即使用針對各種抗原類型產(chǎn)生的血清在體外進行的交叉中和研究的確顯示出顯著差異(前面的Pratelli等)，活的減毒的CPV2疫苗能夠保護狗免于2a 和 2b 野外攻擊(Greenwood 等，Vet. Record. 136, 63-67，1995)。最近顯示，活的減毒的2型疫苗(Nobivac-Intervet)能夠保護狗免于用最近的CPV 變異體 CPV2c 的攻擊(Spibey 等，Vet. Microbiol 128，48-55，2008)。盡管如此，在該領域中存在著提高動物(尤其是貓、狗和豬)免于新型細小病毒感染的免疫カ的疫苗的需求。然而，未獲得這種疫苗，尤其是未獲得對于犬細小病毒2C型特異性的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了對上述問題的解決方案，其在于提供了ー種包含重組細小病毒和藥學上可接受的載體的疫苗，所述重組細小病毒包含從減毒的第一細小病毒可獲得的DNA序列，其中編碼所述第一細小病毒的衣殼蛋白或其片段的DNA被可源自第二細小病毒(如犬細小病毒，更具體是2c型細小病毒)的衣殼蛋白或其片段所替代。令人驚訝的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種疫苗能夠誘導更高滴度的免于第二犬細小病毒攻擊的保護性抗體，同時保持了針對2型株的良好的免疫力，而重組的犬細小病毒仍然是減毒的。
發(fā)明詳述
可以用本領域技術人員的普通技術從野外分離的病毒株獲得編碼第二犬細小病毒的衣殼蛋白的病毒DNA。在實施例部分，通過使用2c型分離物說明了這一點。來自減毒的犬細小病毒的病毒DNA也是本領域可以獲得的，實施例顯示了從Intervet (Nobivac parvo)獲得的疫苗株中包含的最初的2型病毒的分離。更具體地，病毒DNA從CPV 2c型野外分離物獲得。用不同的限制性酶消化每種DNA制備物從而使從每種制備物產(chǎn)生兩種重疊的片段。純化并分離片段。然后將選擇的片段轉(zhuǎn)染進易感細胞。這如圖I所圖示。兩種片段天然重組后，獲得了在常規(guī)的減毒的2型病毒的背景下包含2c型分離物的衣殼蛋白的雜合病毒。分離并純化這種病毒，并與藥學上可接受的載體混合并作為疫苗使用。用CPV2c型病毒的野外分離物和用2型疫苗的親本病毒攻擊接受新疫苗的狗。令人驚訝的是，新的疫苗提供了足夠的針對常規(guī)的2型分離物的抗體滴度，并提供了針對2c型CPV的改進的保護。可以有利地將這種疫苗用于保護狗免于犬細小病毒、尤其是2c型的感染。更通常地，上述發(fā)現(xiàn)顯示，通過用第二犬細小病毒的衣殼區(qū)域或其相關片段替換第一犬細小病毒的衣殼區(qū)域，減毒的病毒可作為用于免于另一犬細小病毒感染的重組疫苗的基礎。因此，本發(fā)明涉及重組細小病毒，其包括從減毒的第一細小病毒獲得的DNA序列，其中編碼所述第一細小病毒的衣殼蛋白或其片段的DNA被源自第二細小病毒的衣殼蛋白或其片段所替代。來自第一和第二細小病毒的衣殼蛋白需要至少ー個氨基酸不同。在這種背景下的術語“衣殼蛋白或其片段”是指包含第一和第二細小病毒之間的衣殼蛋白的差異的全長衣殼蛋白或其這種部分。優(yōu)選地，用第二細小病毒的全長衣殼蛋白替代第一細小病毒的全長衣殼蛋白。本發(fā)明使用的術語“全長”和“基本上全長”意在表明，蛋白或核酸序列包含行使其功能所必要的所有的元件，優(yōu)選地，該序列應當包含天然序列的所有元件(氨基酸或核苷酸)。本發(fā)明的重組細小病毒可以有利地用于保護動物免于細小病毒感染的疫苗中。發(fā)現(xiàn)這種疫苗保護動物免于第一以及第二病毒的感染，而重組疫苗保持減毒從而使它不能誘導任何細小病毒感染的臨床癥狀。本發(fā)明還涉及用于獲得本發(fā)明的重組細小病毒的方法，其包括以下步驟
a.從減毒的第一細小病毒株獲得至少ー種第一DNA片段，所述第一 DNA片段不編碼衣殼蛋白，
b.從第二細小病毒株獲得至少ー種第二DNA片段，所述第二 DNA片段編碼衣殼蛋白，
c.用步驟a和b中獲得的DNA片段轉(zhuǎn)染對于細小病毒容許(permissive)的細胞，
d.允許DNA片段重組，
e.在第一細小病毒的基因組的遺傳背景中篩選編碼源自第二細小病毒的病毒衣殼蛋白的減毒的重組病毒，f.在允許在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)細小病毒的條件下培養(yǎng)細胞，
g.從細胞培養(yǎng)物獲得重組細小病毒。優(yōu)選地，細小病毒是犬細小病毒，甚至更優(yōu)選地，第一細小病毒是2型犬細小病毒，第二犬細小病毒是2c型犬細小病毒；這導致產(chǎn)生保護狗免于2型以及2c型感染、同時保持其減毒特性的疫苗。為了明確地顯示減毒位點不在衣殼蛋白中，用化學合成的版本替代減毒株中的衣殼蛋白基因，所述化學合成的版本的序列源自強毒的2c野外分離物。這種方法也產(chǎn)生了根據(jù)本發(fā)明的減毒病毒。
圖I :獲得雜合的2/2c病毒分離物的天然重組(非GM)方法的示意圖。將源自2型疫苗和2c型野外病毒的兩種重疊片段轉(zhuǎn)染進細胞，并在同源重組后分離病毒。圖2 :顯示限制性酶位點Pac I和Xmn I的CPV株154att的感染性質(zhì)?？寺〉氖疽鈭D。陰影方框表示末端回文序列。圖3 :顯示選擇用于進ー步操作的部分Pac I/Xmn I消化的選擇的產(chǎn)物的示意圖。圖4 :包含其中衣殼基因被強毒的CPV2c衣殼序列替代的154att疫苗病毒DNA的質(zhì)粒。
實施例實施例I 重組病毒的產(chǎn)牛
從商售的 Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health)獲得 154att株，Jess株是2c型病毒的野外分離物。使用包含5%胎牛血清的M6B8培養(yǎng)基使病毒生長在貼壁的犬或貓腎細胞(如A72 & CrFK)上。用標準“Hirt”法的修改方法從被感染的細胞培養(yǎng)物制備復制形式(RF)DNA(McMaster 等 1981)。用限制性酶PstI消化從154 att株制備的RF DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分離片段。從凝膠切出3055堿基對(bp)條帶(對應于CPV的左手末端)并用Qiagen Qiaquick凝膠提取柱純化。用限制性酶XmnI消化從CPV Jess感染的細胞分離的RF DNA。再次通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段,隨后用Qiagen Qiaquick凝膠提取柱純化約2750 bp條帶(對應于包括衣殼序列的CPV的右手末端)。將來自154att和Jess的純化的3055 bp和2750bp片段合并并轉(zhuǎn)染進培養(yǎng)中的A72或CrFK細胞。根據(jù)廠商說明書，用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)將約3Mg的姆種片段進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，傳代細胞并用血凝(HA)分析法監(jiān)測。在第4代時用HA檢測病毒。使用標準DNA測序方法，用RF DNA或PCR片段模板進行雜合病毒的DNA序列測定。通過有限稀釋法純化在貼壁的易感犬或貓細胞上的病毒。實施例2:從克隆的病毒DNA構(gòu)建的重組病毒
從克隆的片段產(chǎn)生重組病毒。將病毒株154att的基因組克隆進標準的克隆載體pBluescript (Stratagene inc.)。為了保持回文末端序列完整,將質(zhì)粒在許多重組系統(tǒng)缺陷的細菌宿主DL795中繁殖。細小病毒基因組的克隆已經(jīng)在文獻中描述，所需的技術對于本領域技術人員而言是已知的。用限制性酶Pac I消化獲得的154att的克隆(pl54)而不允許消化完整進行，即限制性酶消化僅僅是部分的。然后使消化的片段經(jīng)受限制性酶Xmn I的消化。然后通過瓊脂糖凝膠電泳分離消化的DNA片段，從凝膠切出下圖中所示的片段，并用Qiagen Qiaquick凝膠提取柱純化。Xmn I和右手的Pac位點位于細小病毒基因組中的衣殼區(qū)域的兩側(cè)。如下用CPV的強毒株的衣殼基因替代154 att的衣殼基因。圖2中所示的Xmn I位點和右手的Pac I位于衣殼基因的邊界之外。Pac I位點和衣殼基因的末端之間約IlObp 序列在154att株和強毒的分離物之間差異顯著。在Xmn I位點和衣殼基因的起始處之間的短序列( 55 bp)中還沒有記錄到序列改變。因此，為了將物質(zhì)的交換僅僅限制在衣殼序列；化學合成了強毒的CPV衣殼序列，保留了 PacI位點和衣殼終止信號之間的疫苗特異性序列。下面，顯示了包含CPV衣殼基因的化學合成的序列。下面所示的序列在本文作為SEQ ID NO 1 提供。
權利要求
1.一種減毒的重組細小病毒，其包含從減毒的第一細小病毒可獲得的DNA序列，其中編碼所述第一細小病毒的衣殼蛋白或其片段的DNA被可源自第二細小病毒的衣殼蛋白或其片段所替代。
2.根據(jù)權利要求I所述的重組細小病毒，其中所述從減毒的第一細小病毒可獲得的DNA序列基本上是全長的。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的重組細小病毒，其中源自所述第二細小病毒的所述衣殼蛋白基本上是全長的。
4.根據(jù)權利要求1-3所述的重組細小病毒，其中所述細小病毒選自犬細小病毒、貓細小病毒和豬細小病毒。
5.根據(jù)權利要求1-4所述的重組細小病毒，其中所述第一細小病毒是2型犬細小病毒和/或其中所述第二細小病毒是2c型犬細小病毒。
6.用于保護動物免于細小病毒感染的疫苗，所述疫苗包含根據(jù)權利要求1-5所述的重組細小病毒和藥學上可接受的載體。
7.用于獲得根據(jù)權利要求1-5所述的重組細小病毒的方法，其包括以下步驟 a.從不編碼衣殼蛋白的減毒的第一細小病毒株獲得至少ー種DNA片段， b.從編碼衣殼蛋白的第二細小病毒株獲得至少ー種DNA片段， c.用步驟a和b中獲得的DNA片段轉(zhuǎn)染對于細小病毒容許的細胞， d.允許DNA片段重組， e.在第一細小病毒的基因組的遺傳背景中篩選編碼源自第二細小病毒的病毒衣殼蛋白的減毒的重組病毒， f.在允許在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)細小病毒的條件下培養(yǎng)細胞， g.從細胞培養(yǎng)物獲得重組細小病毒。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述細小病毒選自犬細小病毒、貓細小病毒和豬細小病毒。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述第一細小病毒是2型犬細小病毒株以及所述第二細小病毒是2c型犬細小病毒株。
10.根據(jù)權利要求6所述的疫苗用于保護動物免于細小病毒感染的用途。
11.根據(jù)權利要求10所述的用途，其中所述細小病毒是犬細小病毒株，尤其是2c型犬細小病毒。
全文摘要
本發(fā)明屬于用于保護動物免于細小病毒感染的病毒疫苗、它們的生產(chǎn)和用途的領域。更具體地，本發(fā)明涉及包含減毒細小病毒的疫苗，所述減毒細小病毒包括可源自另一種細小病毒的衣殼蛋白及其片段。令人驚訝的是發(fā)現(xiàn)這種疫苗能夠誘導更高滴度的免于第二種類型的細小病毒株攻擊的保護性抗體，同時保持針對第一種類型的細小病毒的良好的免疫力。重組病毒株也仍然是減毒的。
文檔編號A61K39/23GK102791288SQ201180012606
公開日2012年11月21日 申請日期2011年3月3日 優(yōu)先權日2010年3月5日
發(fā)明者N.斯皮貝 申請人:英特維特國際股份有限公司